沉默

Gene silencing by siRNA represents a convenient experimental strategy to analyze BRCA2-dependent biological functions with immediate implications to better understand cancer biology. A method to efficiently silence BRCA2, along with the experimental procedure to detect and quantify changes in BRCA2 protein expression by immunoblotting in human cell lines, is presented.

肿瘤抑制蛋白BRCA2及其检测常规生化分析的沉默代表了由于人类BRCA2蛋白（约390 kDa的）的大尺寸巨大的技术挑战。我们报告的标准siRNA转染和免疫印迹协议的修改来沉默人类BRCA2和检测内源性BRCA2蛋白，分别在人上皮细胞系。关键的步骤包括一个高的siRNA转染试剂的比例和相同的实验中的两个随后的几轮siRNA转染的。使用这些和其他的修改标准协议中，我们一致地实现人类BRCA2基因的70％以上的沉默作为判断免疫印迹分析用抗BRCA2抗体。此外，细胞裂解物在55℃，而不是传统的70-100℃，并在免疫印迹程序的其他技术的优化变性允许检测完好BRCA2蛋白偶的wh烯极低量原料可用或当BRCA2蛋白质表达水平非常低。 BRCA2的人类细胞中沉默效率提供了一个有价值的策略，以扰乱BRCA2功能的细胞中具有完整BRCA2，包括肿瘤细胞，以检查新的分子途径，并且可能会受致病BRCA2基因突变的肿瘤中的细胞功能。此协议为有效的沉默等"大"蛋白如BRCA2的分析，适应应该是很容易实现的。

在BRCA2（乳房癌易感基因-2）基因编码肿瘤抑制蛋白，发挥在通过调节重组酶的Rad51 ¹的功能修复DNA双链断裂了至关重要的作用。 BRCA2也被牵连于转录的调节和细胞周期调控^2。在BRCA2基因的种系突变诱导的常染色体显性遗传易感性乳腺癌和在妇女卵巢癌和前列腺癌的男性，以及其他类型的癌症^3,4-倾向。然而，尽管在发展癌症，BRCA2基因突变是抑制或减少BRCA2功能可能使肿瘤细胞更容易受到化疗剂引起的DNA损伤^5-7的风险增加。零星的癌症表现出BRCA2基因突变（<3％），尽管BRCA2蛋白水平降低已在一些癌症类型被检测到低速率，这表明BRCA2蛋白通过非突变依赖性机制^-7,8-肿瘤发生过程中可能会丢失在零星的癌症。因此，要充分认识BRCA2功能在癌症生物学的上下文中以及在其他生物的设置是重​​要的。

用于鉴定在哺乳动物细胞中的基因的新颖功能的强大的工具是沉默其表达。作为一个例子，在各种正常上皮细胞的沉默BRCA2的表达最近导致了新颖BRCA2作为失巢凋亡抗性，采集的癌细胞侵入和转移能力⁹中的一个重要步骤调 ​​节器的功能的识别。基因沉默可以通过引入细胞中任一小干扰（SI）RNA或短发夹（sh的）RNA分子靶向特定基因来实现。 siRNA的高效力和它的易用性使得它的优先工具沉默实验旨在获得新的见解关键的生物进程第二，以确定新的治疗目标。然而，基因表达的有效的敲低可能并不容易实现对所有的基因，可能是高度可变的取决于细胞类型。因为在细胞内蛋白质水平的降低是所研究的最相关的表型，这是至关重要的免疫印迹的基因产物的分析以量化基因沉默。与这方面，BRCA2蛋白呈现了进一步的挑战:作为一个大的蛋白质（约390 kDa的），技术困难确实存在对常规的生化分析，包括免疫印迹。

我们在这里报告BRCA2在人类上皮细胞系的高效沉默和迅速和成功的检测用免疫印迹法击倒BRCA2蛋白优化的协议。

1.准备的siRNA的解决方案

1. 重悬5纳摩尔BRCA2基因的siRNA干燥粒料加扰（Ctrl键）和5纳摩尔在100μl无RNase水（最终的siRNA浓度为50μM）。这是所述siRNA的库存，并且必须被储存在-20℃于10微升等分试样。
2. 取从所述siRNA库存10微升等分试样并加入无RNase水40微升，得到10μM的siRNA的工作溶液。该稀释必须存储在-20℃直到使用。
   注:siRNA的工作溶液不应经受冷冻/解冻的3倍以上。

2.播种人表皮细胞系

1. 在37℃，5％的CO ₂从人上皮细胞系生长的细胞单层在组织培养板在培养箱中生长培养基中。
2. 洗细胞在板一次，用RT的PBS（10毫升的PBS为100毫米板）。
3. 以从板取下细胞，加入2ml的0.25％胰蛋白酶的/ 0.53毫摩尔EDTA溶液孵育3-5分钟取决于细胞类型。
4. 之前收集分离的细胞中，加入2ml含10％胎牛血清的完全培养基的中和胰蛋白酶。
5. 转移细胞到15毫升管。
6. 在吊桶式转子离心细胞在320-330×g离心3分钟，在4℃。
7. 重悬细胞沉淀在5ml抗生素的培养基中。
8. 算在Burker室中的显微镜下或通过根据制造商的说明使用自动计数系统的细胞。
9. 种子细胞在6孔板24小时（0.5-1×10 ^6个细胞在2ml培养基的每孔）后为约80％汇合。最佳细胞数接种可以取决于特定细胞系和生长速度各不相同。
   注意:不要在中在这一点上添加抗生素，因为抗生素会负transfe的干扰效率ction。这是很重要的，该细胞是在低培养传代（<10），以实现BRCA2 siRNA转染的高效率。

3.转染细胞的siRNA

1. 电镀细胞后二十四小时内，继续进行第一轮的转染。
   1. 稀释6微升基于脂质的¹⁰特异性的siRNA转染试剂在130微升减少血清培养基。
   2. 在130微升减少血清培养基稀释3微升10μM的siRNA（30皮摩尔）。
   3. 结合稀释的siRNA与稀释的转染试剂，孵育在室温5-10分钟。
   4. 在温育后，除去从细胞培养基中，并添加新鲜培养基预先加热至37℃（无抗生素）2毫升
   5. 加入250微升的siRNA转染试剂复合物的细胞（该量是用于一个6孔板的单个孔）。
   6. 孵育细胞在加湿培养箱中在3776下用5％的CO _2。
2. 24小时后，继续进行第二轮的转染重复步骤3.1.1-3.1.5并作以下修改为3.1.2步:稀释5微升10μM的siRNA（50皮摩尔）的130微升减少血清培养基。
   1. 分析前孵育细胞1-2天，在37℃。
      注:两轮转染和使用在第二轮高的siRNA /转染试剂的比例是必不可少得到BRCA2沉默的效率高。

4.裂解细胞免疫分析

1. 制备新鲜的裂解缓冲液与含有非离子型，非变性去污剂辛基苯氧基的1％，5毫焦磷酸钠，1mM的原钒酸钠，10mM的氟化钠，2mM的苯基甲基磺酰氟，10微克的PBS（pH为7.4）/ ml亮肽素，10微克/ ml抑肽酶。保持它在冰上。
2. 除去从细胞以及w的介质用冷PBS（2毫升/孔）在该板一次灰它们。为了防止交叉污染的PBS，它完全从板块中删除。
3. 加入200μl裂解缓冲液到每个孔中。
   注意:如果该细胞必须也用于其他测定法，trypsinize细胞如步骤2.1-2.6中描述和悬浮细胞中根据应用适当的缓冲/介质中使用。
4. 轻轻转动该板均匀地分布在裂解缓冲液孵育15分钟，在4℃下在旋转器上。
5. 收集在使用细胞刮刀冰离心管的细胞裂解物。
6. 离心机在17900×g离心25分钟，在4℃，并收集在一个新的管中的上清液。
7. 测量使用根据制造商的说明市售蛋白质测定蛋白质浓度。

5. BRCA2免疫印迹分析

1. 通过稀释加入50ml 20×Tris-醋酸SDS电泳b制备运行缓冲uffer（50毫曲辛，的50mM Tris碱，0.1％SDS，pH值8.24）950毫升蒸馏水。
2. 制备的样品如下:添加15微克总细胞裂解物，将5μl的4倍样品缓冲液含有十二烷基硫酸锂，在pH 8.4，加入2μl10×样本还原剂（0.5M DTT），和裂解缓冲液至20中的最终体积微升。
   注意:此协议允许检测BRCA2的正常细胞系也当使用总蛋白的较低量（降至5微克）。
3. 变性的样品在55℃下进行10分钟。
   注:关键是要使用55℃。因为BRCA2蛋白是热敏性^11，更高的变性温度导致完整的全长（390 kDa）的BRCA2蛋白一致损失。
4. 根据制造商的说明建立的电泳室。
5. 装载样品和10微升的高分子量预染色的蛋白质标准进行预制凝胶（Tris-醋酸3-8％），并在运行120伏的AB出2小时^12。停止55 kDa的蓝色标记离开预制胶前的电泳运行。
6. 准备转移缓冲液用50毫升20×转移缓冲液，加入100毫升100％甲醇和850毫升水中。
7. 激活PVDF膜（0.45微米孔径）通过浸泡在100％甲醇5分钟，用蒸馏水漂洗并平衡在转移缓冲液至少5分钟。浸泡在转移缓冲液传送装置的海绵，在4℃直至使用。
8. 当电泳运行结束，组装在以下顺序（自底向上）传输堆栈夹层:在转移缓冲液饱和3海绵一3MM级纸张饱和在转移缓冲液，凝胶，活化PVDF膜，人们3MM在转移缓冲液饱和级纸，三海绵饱和传输缓冲区^13,14。放置在栈入装置和转移蛋白在350mA 4小时，在4℃或在180毫安过夜，在4℃。
   注意:存在BRCA2一个非常大的蛋白质，它是非常重要的，从1小时延长转印时间（所建议的制造商，大多数传输协议），以4小时或过夜，以确保高的分子量的蛋白质的完整的传输。另外，由于长期的传输时间，有必要在4℃下进行杂交在冷室中，以尽量减少过热和促进三明治拆卸。半干转移系统是不利于传输大量的蛋白质。
9. 转移后，用TBS洗膜，阻止它为1小时，在RT在TBS-吐温0.25％（TBS-T）含有5％脱脂奶粉和探针过夜，在4℃下用30微升抗BRCA2兔多克隆抗体（ 200微克/毫升），稀释于9ml TBS-T + 5％脱脂奶粉[1:300（体积/体积）稀释。
10. 用TBS-T洗膜三次（每次10分钟），然后孵育的过滤器1小时，用1微升辣根过氧化物酶缀合的抗兔次级抗体稀释在10的TBS毫升-T + 5％脱脂奶粉。此后，用TBS-T洗膜三次（每次10分钟）。
11. 通过ECL进行免疫检测使用增强的化学发光（ECL）的Western印迹检测试剂，按照制造商的说明来揭示BRCA2蛋白。可视化高分辨率ECL电影immunochemiluminescent带。
12. 在10 1000（10微升抗微管蛋白抗体的制备:与抗体通过使用单克隆抗体与β微管蛋白稀释在1执行免疫检测对于持家基因，如β微管蛋白（55 kDa）的，在相同的过滤器作为负载对照毫升TBS-T + 5％无脂干牛奶）中1小时，在室温。洗和孵化如对于BRCA2（5.10-5.11）第二抗体，除了使用辣根过氧化物酶缀合的抗小鼠代替抗兔二级抗体。
13. 获得与immunochemiluminescent频带印象的膜的数字图像并分析由专用的图像分析软件的谱带强度（ 如，ImageJ的）。

在继续进行的生物/生化测定来检查BRCA2沉默对细胞功能的影响，第一个步骤是通过使用一个加扰的siRNA（非靶向siRNA）并排BRCA2的siRNA（ 图1A确认沉默的特异性）。它执行第二轮的siRNA转染的具有高的siRNA /转染率， ​​以得到BRCA2沉默的高效率是非常重要的。实际上，仅执行一个回合siRNA转染的或用在第二轮（25皮摩尔的siRNA和6微升转染试剂）低级的siRNA转染的比例会导致低击倒效率（ 图1B）。第二步骤是要评估的最佳的最小时间以获得的基因沉默的最高水平。取决于细胞类型，这可以在第二轮的siRNA转染后变化24 48之间和小时。例如，24小时是足够的Nthy甲状腺细胞，但多达48个需要小时用于PNT1A前列腺细胞高效BRCA2击倒（ 图2A）。BRCA2 基因沉默是直到第二转周期（ 图2B）后第7天相当稳定。值得注意的是，变性的细胞裂解物在高于55℃（100℃，5分钟）的温度下，由于BRCA2 ¹¹的热敏性导致高达50％的损失BRCA2蛋白（ 图2C），的。

一旦最佳沉默时间建立，BRCA2蛋白的损失的影响可能被利用在几个实验。自体内突变，导致的BRCA2功能丧失促进以其它化疗药物引起DNA损伤^15-18敏感性增加PARP抑制剂以及，一个共同的测定是确定BRCA2 -silenced细胞对PARP抑制剂rucaparib灵敏度或oloparib。在报告于图3中的实验，PNT1A细胞耗尽ö通过siRNA的˚FBRCA2蛋白已用10μM的rucaparib 24小时，在这之后的细胞增殖被评定通过MTT为基础的细胞增殖测定。耗尽的BRCA2蛋白导致时间依赖性降低细胞增殖rucaparib治疗（ 图3）之后。

图1.两轮转和高的siRNA转染试剂比例提高BRCA2沉默。 （一）BRCA2基因沉默的特异性 在Nthy细胞确认了第二轮转染后免疫印迹分析24小时，用炒的siRNA（Ctrl键）作为控制BRCA2蛋白水平的比较。分子量标记物被报告在左侧。（B）的 PNT1A细胞进行1或2个周期的BRCA2 s在协议中描述的[循环（＃）1和2]和BRCA2蛋白耗竭进行定量免疫印迹的iRNA转染。转炒的siRNA两个周期作为对照（按Ctrl）。在图2b，PNT1A细胞进行使用较低的siRNA转染试剂的比例在所述第二周期的变形（25皮摩尔的siRNA / 6微升转染试剂）BRCA2 siRNA转染的两个周期。在所有情况下，BRCA2蛋白水平进行分析的第二个周期后48小时。在底部，BRCA2蛋白水平的定量报告为BRCA2 /微管蛋白的比例。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2.优化BRCA2击倒的。 （A）的Optim人BRCA2击倒可能需要第二siRNA转染周期后24至48小时。两种不同的细胞系（PNT1A和Nthy）被评定为BRCA2击倒24小时，第二siRNA转染周期的免疫印迹分析后48小时。在底部，BRCA2蛋白水平被报告为水平的在时间0小时百分比，设定为100。数据代表平均值±三次独立实验SE。 （B）的 BRCA2击倒是稳定7天。 PNT1A细胞进行了评估BRCA2击倒，直到第二siRNA转染周期通过免疫印迹后196小时。 BRCA2的微管蛋白的信号的比率被报告在底部。（C）的 BRCA2蛋白是热敏性。未转染PNT1A收集细胞24小时，镀（约70％汇合）后并裂解根据该协议。两等份相同的细胞裂解物（15微克的总蛋白）的变性或者在55℃下进行10分钟，或在100＃176; C为5分钟和BRCA2蛋白质水平通过免疫印迹评估。在底部，BRCA2的微管蛋白信号的比值报道。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3. BRCA2沉默增加细胞敏感性的PARP抑制剂rucaparib。PNT1A细胞或者转染对照（Ctrl键）或BRCA2的siRNA收集转染后48小时，并接种在96孔板（2000个细胞/孔）。 24小时后，10μMrucaparib加入到该细胞24小时，然后将细胞保持在不存在药物的多达96个小时。 690纳米 - 细胞增殖的混合物在使用MTT测定法，通过测量吸光度在550所指示的时间进行评估。 EAC小时时间点代表平均值±代表性实验的SD三个孔的。 Ctrl键的siRNA，蓝线; BRCA2的siRNA，红线。在顶部，BRCA2基因的siRNA转染的细胞蛋白BRCA2轮廓报道。 请点击此处查看该图的放大版本。

由于BRCA2基因导致几个癌症类型，包括女性和男性乳腺癌，卵巢癌，前列腺癌，胰腺癌和黑素瘤^3,4-风险增加的种系突变，一些研究已经进行了解的生物学功能在BRCA2蛋白质。大部分这些研究是基于基因主要是由于在分析像BRCA2巨蛋白的技术困难。此处描述的用于沉默和分析BRCA2蛋白表达的方法，提供了有效的工具来调查BRCA2肿瘤抑制基因的功能的生物测定的广谱。沉默协议是基于标准siRNA转染程序还包含几个关键的修改以及提示BRCA2的成功和一致的击倒。在siRNA转染协议是安全，快速，高效，并从不同的shRNA，通常利用的LENtiviral矢量，并不需要特定的生物安全程序，并且可以在装有细胞培养设施的任何实验室容易地进行。同样，免疫方案进行了优化高效的检测大量的蛋白质类似BRCA2的。免疫印迹协议也已证实为检测重组人BRCA2蛋白异源表达在酵母细胞中^9。

以便进行有效的siRNA传递的几个重要因素在这里报道。它们包括转染的两个周期和高的siRNA转染试剂的比例，特别是在第二个周期。以前抗生素，并且在转染程序缺乏是另一个关键因素。但是，此过程暴露的细胞中培养细菌污染的风险增加;因此，额外的预防措施应采取保证高标准无菌的所有步骤。应当指出的是，根据不同的细胞类型，有效的基因knockdoWN通常需要在第二周期后24-48小时。当前的方法具有保持的基因沉默的至少直到第7天之后的第二个转染周期相当稳定的优点。这允许BRCA2的拦截在多种生物测定法，包括对不同化疗药物的细胞应答的影响的研究。然而，本技术的一个限制是由以下事实外源siRNA分子不整合到基因组表示，基因的表达从而稳定击倒无法实现。或者，为了获得稳定的击倒，shRNA的慢病毒感染也可以进行，条件是该实验室制备用于（根据美国国立卫生研究院指南BSL-2标准）额外的生物安全的要求。此外，当转染是不研究基因功能的一个特定的细胞类型（ 例如 ，T淋巴细胞）的适用方法，使用小区固有条件BRCA2基因敲除小鼠的仍然是唯一alternative ^19。

此方法的报告也成功检测的高分子量蛋白通过免疫印迹的一些技巧，这是适合于高和低丰度的蛋白质。特别是，由于BRCA2蛋白质的热敏性，低级变性温度是其最佳检测关键的，与先前的研究¹¹的协议。此技术"特技"也可以是用于对其中检测通过标准免疫印迹协议已经证明不成功的其他蛋白质是有用的。我们预计，这种方法包含普遍有效性的技巧，从而可以方便的沉默和检测等诸多挑战的蛋白质。

The authors have nothing to disclose.

This work was supported by FIRB-Merit grants RBNE08YFN3_005 and RBNE08HWLZ_012, and the Italian Ministry of Economy and Finance to the CNR for the Project “FaReBio di Qualità”.