Name: long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants
Uploaded: 2014-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants at JoVE.com

Obrigado a Willy Sun para assistência técnica e Dr. Kris Gellynck para comentários úteis e três revisores anônimos por seus conselhos construtivos. Este trabalho foi financiado pela Iniciativa Regeneração Audiência Sunnybrook

Tecido Mouse foi colhida a partir de Sox2 EGFP -reporter camundongos mantidos 12 e sacrificados de acordo com o Canadian Council on Animal Care diretrizes para o cuidado e uso de animais de laboratório. 1. A cultura embrionária cóclea <ol><li> Suplemento de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) por mistura de 8,89 ml de DMEM, 1 ml de soro fetal bovino (FBS), 100 ul de 100x suplemento N2, e 10 ul de 10 mg / ml ciprofloxacina. Suplemento Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) por mistura de 495 ml de HBSS com 5 ml de 100% de HEPES. </li><li> Prepare vidro placas de cultura de fundo: <ol><li> Em uma câmara de fluxo laminar, ressuspender 200 ul porão substrato extracto de membrana em 5 ml de DMEM. Prepare 35 milímetros de vidro diâmetro placas de cultura de fundo com 10 poços mm. Pipetar 150 ul de substrato / DMEM para o centro de cada prato de vidro de fundo. Estes pratos podem ser utilizados depois de 40 min de incubação, ou pode armazenada num CO 2 </sub&gt; Incubadora a 35 ° C durante pelo menos uma semana. NOTA: O vidro de fundo pratos são utilizados para as seguintes razões: para assegurar que a base do prato é transparente e adequado para imagiologia, para criar um buraco no centro do prato que permite que os explantes para se estabelecer em uma área facilmente localizado e finalmente de modo que, depois de uma experiência, a amostra pode ser processado para imunocoloração e análise subsequente. </li></ol></li><li> Prepare o posto de trabalho e ferramentas: <ol><li> Ligue o fluxo laminar banco limpo e lavar com etanol 70% para criar um espaço de trabalho limpo. Mergulhe pinças, colheres, e um preto 184 elastômero de silicone prato (uma mistura de 184 elastômero de silicone (10 partes), agente (1 parte) e carvão vegetal em pó (2,5 g) de cura) em etanol 70%. </li></ol></li><li> Na estação de trabalho limpa, embriões colheita para o experimento. Coletar embriões de gestação apropriado no gelo frio HBSS suplementado com 1% de HEPES. <ol><li> Determinar um órgão externo ou visível que vai demonstraratividade repórter e examinar os embriões usando um microscópio estéreo fluorescente. Recolher os embriões que apresentam actividade repórter em gelo frio HBSS suplementado com 1% de HEPES como estes são o objecto da experiência. </li></ol></li><li> Recolha ossos temporais: <ol><li> Trabalhando rapidamente, usando uma fonte de luz fria e uma pinça fina, recolher as cabeças dos filhotes. Tome cuidado para cortar na vértebra cervical e abaixo do queixo, para evitar danos aos ossos temporais. </li><li> Abra cuidadosamente o crânio. Remover o cérebro, aparar a parte frontal da cabeça, e transferir o posterior do crânio para gelo HBSS frio fresco suplementado com 1% de HEPES em um prato limpo. Dissecar cuidadosamente os ossos temporais em forma de amendoim tendo o cuidado de manter o sistema vestibular no tato. </li></ol></li><li> Dissecar a cóclea: <ol><li> Transfira os ossos temporais para um prato revestido de elastômero de silicone preto no gelo frio HBSS suplementado com 1% de HEPES, fixar a região vestibular do osso. Insira os pinos de insetos emum ângulo oblíquo, a fim de estabilizar o osso temporal e criar espaço para a pinça. Cravado é um passo crucial no processo como se o osso temporal pode se mover muito, é muito difícil para colher uma cóclea intacta. </li><li> Cuidadosamente retire a cartilagem ao redor da cóclea. Inserir um dente do fórceps para a cartilagem na borda exterior da base da cóclea e cortar um furo para a cartilagem. </li><li> Clipe uma aba para cima o lado, inserir o dente do fórceps e suavemente separar o telhado da conduta a partir da cartilagem. Clipe horizontalmente na parte superior e na diagonal, e com cuidado levante a parte da frente da cápsula. Insira um pino da pinça entre a cartilagem restante eo duto e gentilmente cortar fora a última seção. A superfície apical da cóclea está agora exposta. </li><li> Começando na base, apanhar a área onde o telhado da conduta se encontra com o epitélio coclear e abrir o ducto coclear. Retire suavemente o telhado, aparandoquando necessário, até que esteja completamente removida. Apare fora qualquer porção de membrana esquerda no lado medial do duto. Limpe a conduta de excesso de tecido mesenquimal e retire o duto do sistema vestibular. </li></ol></li><li> Cultura explantes: <ol><li> Coloque um explante, luminal superfície para cima, no centro de um substrato de vidro revestido cultura inferior prato, cuidadosamente desenhar fora todo o líquido e deixe por dois minutos. Adicionar 150 mL de DMEM suplementados gota a gota para o explante, tomando cuidado para não perturbá-la. Caso o explante flutuar livremente, reposicionar com uma pinça, mas tomar cuidado para que o explante deposita-se no fundo do prato de modo que ele pode anexar ao substrato. </li><li> Coloque os pratos com fundo de vidro em uma profunda 12 centímetros de diâmetro prato de petri, com um pequeno prato de água estéril para manter a umidade. Coloque as culturas para uma incubadora a 35 ° C durante a noite para que o explante para anexar ao substrato e achatar. </li></ol></li></ol> 2. Vivo Imaging <ol><li> Selecione amostras de explante. Use um microscópio estéreo fluorescente para avaliar a condição de cada cóclea explante. Somente selecione explantes, onde o duto está intacta e anexado ao vidro da base ao ápice. </li><li> Definir a incubadora a 35 ° C com 5% de CO 2 para cultura de tecidos coclear. Coloque as culturas no incubador microscópio: <ol><li> Gentilmente aspirar fora do DMEM suplementado e substituir com pelo menos 500 mL de mídia fresco. Para geração de imagens até 6 dias, 1-1,5 ml é melhor. Nos casos em que os explantes estão frouxamente ligados, pipetar um anel de meios de comunicação em torno da borda do prato. Este líquido extra vai fazer uma &quot;câmara úmida&quot; em miniatura, sem perturbar o explante, enquanto que continua a atribuir à matriz. <ol><li> Alternativamente, o uso articulado prato cobre para abrir as pálpebras, enquanto o prato permanece em sua instalação no microscópio se os reagentes precisam ser trocadas durante os intervalos entre coleções de imagens. Tampas articuladas prato permitir que as tampas para serabriu sem perturbar as amostras ou remover os pratos de suas configurações. Isso mantém a sua posição exata para captura de imagens subsequentes. </li></ol></li><li> Inserir os pratos de vidro de fundo contendo amostras adequadas no suporte do prato de amostras. O microscópio, neste exemplo, tem uma plataforma rotativa que contém oito pratos de 35 milímetros de amostra. </li><li> Sob o capô fluxo laminar substituir as tampas de plástico com tampas de vidro e coloque os pratos no suporte do prato de amostras. Coloque o suporte do prato de amostras dentro da incubadora tomando cuidado para não desalojar os explantes a partir do fundo do prato ou perturbar os meios de comunicação. </li></ol></li><li> Configure a rotina de imagem: <ol><li> Ligue o microscópio, lâmpada UV e câmera e abra o software de imagem. </li><li> Localize as amostras, escolher uma área de imagem, plano de foco e ajustar os tempos de exposição para cada prato em sequência. Escolha do plano de foco em função não só a visão do explante no momento da partida, mas aiassim tendo em conta a forma como o tecido vai passar e quanto tempo o curso do tempo será executado. </li><li> Definir uma pilha Z centralização em torno do plano focal selecionado no canal de fluorescência. Defina a frequência ea duração da amostragem para o experimento. A frequência de amostragem será limitado pelo tempo que leva para coletar imagens, de modo que este deve ser determinado após a seleção de campos de visão e definir uma pilha Z. Neste caso, a amostragem ocorre a cada 30 minutos durante cinco dias. A duração da experiência pode ser de até 14 dias. </li></ol></li><li> Gerar um filme: <ol><li> No final do período de intervalo de tempo abrir os ficheiros de imagem. Neste caso, o software Metamorph que abre pontos de recolha sequenciais é utilizada. Quadro a quadro escolher o melhor plano focal para mostrar a população de células de interesse. </li><li> Converter essas imagens para um arquivo .avi, ou exportá-los como uma montagem para gerar um conjunto de imagens que podem ser abertos e analisados ​​no software de processamento de imagem ou convertidos em forma múltiplats usando o software de processamento de vídeo. </li></ol></li></ol>

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V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Há vários pontos técnicos a considerar quando as culturas são estabelecidas e na criação do microscópio de lapso de tempo, a fim de imagem a longo prazo. Usamos matriz da membrana basal, como um substrato para a cultura de explantes de cóclea, mas o substrato deve ser compatível com o tipo de célula. Por exemplo, a imagem culturas neuronais, pode ser melhor para proporcionar um revestimento de fibronectina. A temperatura de incubação e composição do gás também deve ser escolhido de acordo com o tipo de tecido. Escolhendo a idade do explante é importante. Começamos no E13, o mais rapidamente porque na E12 direção do crescimento é menos previsível. Como é essencial que os explantes são cultivados durante a noite para anexar ao substrato, os experimentos devem ser planejadas para começar no dia seguinte. Se um experimento é começar a E15 ou mais, as culturas devem ser estabelecidos com E13 como ao longo do tempo o tecido achata e se espalha de modo que as células são mais fáceis de imagem (veja Figura 3). </p&gt; Se o órgão de Corti está a ser trabalhada, é essencial que a cóclea é dissecada cuidadosamente. Entalhes na borda lateral do explante quebrar a tensão interna do tecido, portanto, quando a cóclea sofre rearranjos morfológicas, células &quot;derramamento&quot; através do rasgo, formando um &quot;V&quot; em forma protrusion.This protusão pode mover-se a região de interesse para fora de vista . Além disso, deve ser tomado cuidado para remover o máximo do telhado da conduta no lado medial quanto possível. Este tecido continua a proliferar como o explante se expande e pode crescer ao longo do topo da região de interesse torná-lo oculto. Ao configurar a rotina de imagem, o crescimento e as mudanças na morfologia da cóclea deve ser cuidadosamente considerada. O objetivo deve ser escolhido com base não apenas no tamanho da região a ser trabalhada, mas também levando-se em consideração se que a região irá se mover ou expandir. As células na região medialda cóclea (Figura 1 e 2) dividir e se mover dentro de uma área limitada, de modo que uma grande ampliação pode ser utilizado (20X, 40X, 60X). As células do órgão de Corti, ou o epitélio lateral, no entanto, irá mover-se como o explante cresce; uma ampliação menor (10X ou 20X) é melhor, pois a probabilidade de que as células vão permanecer no campo de visão são mais elevados. Imagens das regiões fixas da cóclea é possível em grandes ampliações. Optamos por usar uma objetiva de 10X na seção de resultados representativos porque quis mostrar todo o explante, e porque o movimento do tecido é dinâmico em estágios iniciais. Em seguida a considerar é o plano de foco. Dado que o explante vai crescer para o exterior e achatar, é provável que o plano focal vai mudar dramaticamente ao longo do tempo. Se a região de interesse é o órgão de Corti ou epitélio lateral, antecipando esta e concentrando-se nas células que migram para fora do explante pode ajudar. Este é aiassim um argumento para o uso das objetivas de menor ampliação. É possível definir pilhas Z, tanto para fluorescência e DIC. Se as células de interesse são susceptíveis de se mover para fora do foco, a criação de uma pilha Z de 3-5 mM por passo pode contrariar isto, especialmente se o último passo é no plano do vidro de cobertura. Pode ser difícil escolher o plano correto quando visualizar culturas em um dia, como a densidade de empacotamento das células ea luz refletida a partir de tecido circundante pode impedir uma visão clara. Ao analisar os quadros para gerar um filme ou montagem mais tarde, a seleção cuidadosa de Z-aviões também permite o rastreamento de movimentos celulares em três dimensões. O experimento pode ser interrompido a qualquer momento para ajustar as configurações de foco se a amostra se move fora da faixa. Imagens ao vivo de um explante coclear mais de uma semana acrescenta uma nova dimensão para a compreensão do desenvolvimento da cóclea que irá complementar imagens ao vivo confocal. Este é um excelente método para usar ao órgão ampla longoexame -termo é necessário, mas não vai substituir alta de imagem confocal ampliação para estudos com células único curto prazo. A escolha da técnica é dependente do tipo de tecido a ser visualizado e o contexto do experimento. Esta técnica permitirá que os investigadores a estudar alterações espaço-temporais da expressão do gene repórter, proliferação e migração celular em tempo real e permitir o estudo do gene repórter de resposta a agentes farmacêuticos e viabilidade de células em mais detalhe do que era possível anteriormente.

A cóclea dos mamíferos é um órgão complexo altamente ordenada. No rato, entre o surgimento do ouvido interno primitivo da vesícula ótica no dia E11 e conclusão do programa de desenvolvimento em fases pós-natais, várias ondas de sinalização celular e mudanças coordenadas na expressão gênica ocorrem. Correndo de base para o ápice do ducto coclear é o som detectar epitélio sensorial, ou órgão de Corti. Desenvolvimento do órgão de Corti é primorosamente controlada de tal forma que até o final de desenvolvimento, ele será composto de uma única fileira de células ciliadas internas, três fileiras de células ciliadas externas intercaladas com cinco fileiras de células de suporte (duas fileiras de células pilares, três linhas de células de Deiters &#39;) 1. Desvio dessa ordem resultados precisos em perda auditiva, heighlighting a importância de studye ofthe gênese e padronização do epithemlium sensorial 2. Cultivo in vitro da coch embrionárias de ratolea é uma ferramenta essencial para o estudo dos mecanismos de desenvolvimento do órgão de Corti. Esta técnica foi estabelecido em 1974 e ao longo dos últimos 40 anos, tem sido utilizado para elucidar muitos dos mecanismos pelos quais o epitélio sensorial é especificado e o órgão de Corti estabelecidos 3. A cóclea é um órgão complexo com processos de desenvolvimento dinâmicos; uma manipulação pode levar até sete dias para manifestar um. Por exemplo, quando a adição de inibidores de GSK 3β a uma cultura de explante da cóclea em E13, o período de incubação óptimo para observar um efeito robusto do que o composto é seis dias 4. Imagens ao vivo da cóclea desenvolvimento permite investigação sobre as mudanças na morfologia do órgão de Corti, mudanças na expressão gênica, acompanhamento de migração, proliferação ou células que morrem, e isso permite a observação em tempo real dos resultados dos agentes farmacêuticos e rompimento de sinalização percursos. Até agora, a imagem da cóclea viverfoi principalmente realizada usando microscopia confocal a imagem pequenas áreas do órgão de Corti ao longo de períodos de tempo curtos 5-8, mas esta técnica tem limitações devido a viabilidade explante. Em imagiologia dos efeitos das manipulações de longo prazo sobre os processos de desenvolvimento lento, o ambiente de imagem é crucial. Normalmente, um sistema de imagem ao vivo confocal utiliza uma caixa de plástico umidificado que se senta no microscópio. O calor e humidade pode escapar através das aberturas na caixa de incubação onde se encontra com a tabela de microscópio, através das janelas de acesso, através das aberturas articuladas e através das lacunas em torno de várias partes do microscope- tais como o objectivo ou a fonte de luz. Este não é o ideal para a manutenção de explantes saudáveis ​​por mais do que dois ou três dias. Nós definimos &#39;incubadora microscópio&#39; como um microscópio invertido vedado dentro de uma incubadora de CO 2 padrão, em vez de uma incubadora construído em torno do microscópio. Uma incubadora microscópio extende a vida do experimento de tal modo que, em vez de imagem ao longo de dois ou três dias, as amostras podem ser visualizados por até duas semanas. Um microscópio incubadora oferece um excelente ambiente para o crescimento e diferenciação celular, com o mínimo de perturbação explantar culturas e condições padrão controlado. Em estudos que têm lugar ao longo de vários dias, é comum recorrer a amostras de imagem numa base diária, removendo-os da incubadora e levando-as a um microscópio de fluorescência invertido. Embora essa abordagem possa funcionar, de retirar os pratos da incubadora inflige estresse sobre o tecido em desenvolvimento sensível. Mudanças na acidez do meio de cultura e as flutuações na temperatura devido à remoção da incubadora pode resultar em desenvolvimento abaixo do ideal e do tecido saudável. Imagiologia da mesma região no mesmo plano focal e com a mesma orientação em cada ponto de tempo é extremamente desafiador. Ao utilizar um sistema automatizado dentro de uma incubadora, é possível manter saudáveltecido, para recolher imagens em mais pontos de tempo e para assegurar que a mesma área seja capturado em cada quadro. Nos últimos anos têm sido desenvolvidas várias incubadoras microscópio de tecido integrados, estes têm sido úteis não só na prática clínica 9, mas também em células estaminais e cancro da investigação 10,11. Aqui apresentamos um protocolo para criação de imagens ao vivo de longo prazo de explantes embrionárias de rato cocleares. Usamos um sistema de microscopia automatizada dentro de uma incubadora de CO 2 padrão que tem a capacidade de capturar imagens de várias amostras em pontos de tempo definido. O sistema consiste de um microscópio invertido definido dentro de uma incubadora. As amostras são colocadas num estrado rotativo que permite imagens de múltiplas amostras em cada ponto de tempo. Iluminação, captura de imagem e rotação do estrado são controlados por um sistema automatizado operado através de software Metamorph. Ao definir uma rotina de imagem usando o software operacional, podemos definir um experimento para funcionar por até twO semanas com mínima intervenção humana. Neste exemplo, vamos usar tanto de campo claro e fluorescência para mostrar crescimento em larga escala e rearranjo da cóclea e, especificamente, a região prosensory. Neste experimento, cóclea serão dissecados de ratos repórter Sox2 EGFP no dia embrionário E13. Será estabelecida culturas in vitro e depois trabalhada ao longo de cinco dias.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle media</td><td>Gibco</td><td>12430</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>Basement membrane extract&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers.&lt;br/&gt; http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>5630080</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>100 x N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution</td><td>Gibco</td><td>14170161</td><td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use.&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&amp;amp;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>Size number 5&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&amp;amp;CategoryId=29</td></tr><tr><td>Curette&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10080-05</td><td>size 1 mm&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&amp;amp;CategoryId=118</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-35</td><td>Must be stainless Steel&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td></tr><tr><td>50 mm plastic dishes</td><td>Corning/Falcon</td><td>351006</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>charcoal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05105-250G</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>184 silicone elastomer</td><td>Dow/Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dishes are home made several weeks in advance.&amp;nbsp; Silicone elastomer can be from any supplier.&lt;a href=&quot;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&quot;&gt;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&amp;nbsp; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL.&lt;br/&gt; http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&amp;amp;cPath= 1_4_15&amp;amp;products_id=2</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>495101-9804-000</td><td>&amp;nbsp;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td></tr><tr><td>Cold Light Source</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-182</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td></tr><tr><td>Fluorescent Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Leica microsystems</td><td>Contact Leica microsystems</td><td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td></tr><tr><td>Incubator Microscope +imaging software</td><td>Olympus</td><td>Contact Olympus</td><td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software.&lt;br/&gt; http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&amp;amp;c=0</td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Thermo Scientific</td><td>51029701</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3310</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td></tr><tr><td>Laminar Flow hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026651</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td></tr></tbody></table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

Aqui apresentamos um método para longo prazo de imagem time-lapse de explantes embrionárias de rato cocleares ao vivo. O programa de desenvolvimento responsável pela construção da altamente ordenada, estrutura complexa da cóclea de mamíferos prossegue por cerca de dez dias. A fim de estudar alterações na expressão do gene ao longo deste período e a sua resposta a farmacêutica ou manipulação genética, a imagem latente a longo prazo é necessário. Anteriormente, imagens ao vivo tem sido tipicamente limitada pela viabilidade do tecido explantado numa câmara humidificada em cima de um microscópio padrão. Dificuldade em manter condições óptimas para o crescimento da cultura no que respeita à humidade e temperatura colocou limites no comprimento de experimentos de imagem. Um microscópio integrados em um incubador de cultura de tecido modificado proporciona um ambiente excelente para a imagem latente a longo prazo ao vivo. Neste método demonstramos como estabelecer rato embrionárias explantes cocleares e como usar um microscópio de incubadora para realizar lapso de tempo imaging utilizando tanto microscopia de campo brilhante e fluorescência para examinar o comportamento de um dia de desenvolvimento embrionário normal (E) e 13 de explante da cóclea Sox2, um marcador das células prosensory da cóclea, ao longo de 5 dias.

Aqui nós mostramos uma montagem (Figura 1) e um filme (Figura 2), demonstrando como um explante coclear organotípico típico vai crescer se banhado em E13.5. Um repórter do mouse Sox2 foi usado para visualizar a região prosensory. O filme ilustra que a cóclea sofre de crescimento e convergência e extensão, as células na região lateral do domínio Sox2 verde não parecem tão dividir o tecido circundante que se expande. Esta é uma característica do órgão de Corti; sobre o epitélio sensorial E13 prospectivo sai do ciclo celular e é, subsequentemente, conhecida como zona de não proliferação 13. Um segundo experimento time-lapse centrando-se na base de meados de um explante coclear diferente (Figuras 3 e 4) demonstra que a medida que se estende, a região prosensory estreita. Note-se que depois de três dias em cultura, o tecido foi consideravelmente achatada de tal modo que é possível visualizar indivicélulas fluorescentes duplas, enquanto que no início há regiões onde a reflexão interna da luz devido à espessura do tecido tornam possível a identificação de regiões de expressão, mas não células individuais. <img alt="A Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1:. Time - imagens de lapso de tecido coclear Sox2 repórter recolhidos ao longo de cinco dias Esta montagem mostra o progresso do crescimento do explante a partir de dia zero e terminando no dia cinco, a amostragem a cada 30 minutos usando uma objetiva de 10X. O explante foi criada em E13 e cultivados durante a noite antes de imagem. Como o explante amadurece, cresce tanto e sofre movimentos de extensão convergentes. (A) imagens sequenciais que mostram a extensão do crescimento coclear em intervalos de 12 h. Canal de luz visível revestida com gene de fluorescência da GFPavaliado pelo repórter EGFP Sox2. canal de fluorescência (B) GFP só. Barra de escala corresponde a 200 m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/Figure2.f4v" target="_blank">Figura 2</a> :. Lapso de tempo de animação do tecido coclear Sox2 repórter recolhidos ao longo de 5 dias Este é o mesmo experimento explante indicado na Figura 1, desta vez os quadros são seleccionados em intervalos de 30 min durante 5 dias e combinados como um arquivo para gerar um avi filme. <img alt="A Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3:. Base de Mid passando por movimentos CE e achatamento Sequential imagens que mostram que o epitélio prosensory da base intermédia (EGFP) se estreita, e estende-se achata ao longo de 5 dias. As setas indicam a região que se estreita. Quadros selecionados a partir de uma seqüência de tempo lapso 5 dias em intervalos de 12 h, utilizando uma objetiva de 10X. Barra de escala corresponde a 200 m. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/Figure4.f4v" target="_blank">Figura 4</a> : Time-lapse animação da base de meados passando por movimentos CE e achatamento Animated seqüência de lapso de tempo mostrando a convergência ea extensão do epitélio sensorial mostrado na Figura 3 com quadros selecionados em intervalos de 30 minutos..

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Imagens ao vivo da cóclea de mamíferos embrionária é um desafio porque os processos de desenvolvimento na mão operam em um gradiente temporal, ao longo de dez dias. Aqui é apresentado um método para a cultura e, em seguida, imagiologia embrionário tecido de explante da cóclea retirado de um rato repórter fluorescente ao longo de cinco dias.

Longo prazo Time Lapse Imagem do mouse cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K visualizações.  Sunnybrook Research Institute.  Imagens ao vivo da cóclea de mamíferos embrionária é um desafio porque os processos de desenvolvimento na mão operam em um gradiente temporal, ao longo de dez dias. Aqui é apresentado um método para a cultura e, em seguida, imagiologia embrionário tecido de explante da cóclea retirado de um rato repórter fluorescente ao longo de cinco dias. 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura da embrionárias mouse cocleares explantes e Gene Transferência de Eletroporação

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Biologia do Desenvolvimento

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

Longo prazo intravital Imunofluorescência imagem do tecido componentes da matriz com epifluorescência e microscopia de dois fótons

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Bioengenharia

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Um protocolo para Decellularizing Cochleae Mouse para engenharia de tecidos do ouvido interno

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET remain unknown. Electrophysiological studies of hair cells revealed that the MET channel has a large conductance and is permeable to relatively large fluorescent cationic molecules, including some styryl dyes and Texas Red-labeled aminoglycoside antibiotics. In this protocol, we describe a method to visualize and evaluate the uptake of fluorescent dextrans in hair cells of the organ of Corti explants that can be used to assay for functional MET channels. We found that 3 kDa Texas Red-labeled dextran specifically labels functional auditory hair cells after 1&#8211;2 h incubation. In particular, 3 kDa dextran labels the two shorter stereocilia rows and accumulates in the cell body in a diffuse pattern when functional MET channels are present. An additional vesicle-like pattern of labeling was observed in the cell body of hair cells and surrounding supporting cells. Our data suggest that 3 kDa Texas-Red dextran can be used to visualize and study two pathways for cellular dye uptake; a hair cell-specific entry route through functional MET channels and endocytosis, a pattern also available to larger dextran.

Here, we present a method for visualizing the uptake of 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditory hair cells with functional mechanotransduction channels. In addition, dextrans of 3&#8211;10 kDa can be used to study endocytosis in hair and supporting cells of the organ of Corti.

Etiquetagem Dextran e Captação em Células Capilares Murina Coclear

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como Ferramenta de Triagem In Vitro na Pesquisa Auditiva

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Medicina

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparação da superfície coclear no mouse adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Neurociência

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia that are arranged in rows of increasing height. When stereocilia are deflected, they tug on tiny (~5 nm in diameter) extracellular tip links interconnecting stereocilia, which convey forces to the mechanosensitive transduction channels. Although mechanotransduction has been studied in live hair cells for decades, the functionally important ultrastructural details of the mechanotransduction machinery at the tips of stereocilia (such as tip link dynamics or transduction-dependent stereocilia remodeling) can still be studied only in dead cells with electron microscopy. Theoretically, scanning probe techniques, such as atomic force microscopy, have enough resolution to visualize the surface of stereocilia. However, independent of imaging mode, even the slightest contact of the atomic force microscopy probe with the stereocilia bundle usually damages the bundle. Here we present a detailed protocol for the hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) imaging of live rodent auditory hair cells. This non-contact scanning probe technique allows time lapse imaging of the surface of live cells with a complex topography, like hair cells, with single nanometers resolution and without making physical contact with the sample. The HPICM uses an electrical current passing through the glass nanopipette to detect the cell surface in close vicinity to the pipette, while a 3D-positioning piezoelectric system scans the surface and generates its image. With HPICM, we were able to image stereocilia bundles and the links interconnecting stereocilia in live auditory hair cells for several hours without noticeable damage. We anticipate that the use of HPICM will allow direct exploration of ultrastructural changes in the stereocilia of live hair cells for better understanding of their function.

Here we present a protocol for the Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), a non-contact scanning probe technique that allows nanoscale imaging of stereocilia bundles in live auditory hair cells.

Imagem do pacote de esterecilia com resolução de nanoescala em células capilares auditivas de mamíferos vivos

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

Imagens de células vivas in vitro para explorar a migração celular em direção ao órgão de Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

Imagem da Cóclea Envelhecida com Microscopia de Fluorescência de Folha de Luz

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

Explantes Cocleares Neonatais Totais como Modelo In vitro

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...