Name: long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants
Uploaded: 2014-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants at JoVE.com

¡Gracias a Willy Sun para la asistencia técnica y el Dr. Kris Gellynck por sus valiosos comentarios y tres revisores anónimos por sus consejos constructivos. Este trabajo fue financiado por la Iniciativa de Regeneración Audiencia Sunnybrook

Tejido de ratón fue cosechada de Sox2 EGFP -reporter ratones 12 mantenidos y sacrificados de acuerdo con el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio. 1. El cultivo embrionario cochleae <ol><li> Suplemento Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) mediante la mezcla de 8,89 ml de DMEM, 1 ml de suero bovino fetal (FBS), 100 l de 100x suplemento N2, y 10 l de 10 mg / ml de ciprofloxacina. Suplemento solución salina equilibrada de Hank (HBSS) mediante la mezcla de 495 ml de HBSS con 5 ml de HEPES 100%. </li><li> Preparar vidrio placas de cultivo de fondo: <ol><li> En una campana de flujo laminar, resuspender 200 l sótano sustrato extracto de membrana en 5 ml de DMEM. Preparar 35 mm de vidrio de diámetro inferior con placas de cultivo de 10 pozos mm. Pipetear 150 l de sustrato / DMEM en el centro de cada plato de fondo de cristal. Estos platos se pueden utilizar después de 40 min de incubación, o pueden almacenarse en un CO 2 </sub&gt; Incubadora a 35 ° C durante al menos una semana. NOTA: Vidrio de fondo platos se utilizan por las siguientes razones: para asegurarse de que la base del plato es transparente y adecuada para formación de imágenes, para crear un pozo en el centro del plato que permite a los explantes a establecerse en una zona de fácil situado y finalmente de modo que después de un experimento de la muestra se puede procesar para la inmunotinción y el análisis subsiguiente. </li></ol></li><li> Prepare la estación de trabajo y herramientas: <ol><li> Encienda el flujo laminar banco limpio, y rocíe con EtOH al 70% para crear un espacio de trabajo limpio. Remoje pinzas, cucharas y un negro 184 plato de elastómero de silicona (una mezcla de 184 elastómero de silicona (10 partes), agente (1 parte) y polvo de carbón vegetal (2,5 g) de curado) en EtOH al 70%. </li></ol></li><li> En la estación de trabajo limpia, embriones de cosecha para el experimento. Recoger los embriones de la gestación apropiado en hielo frío HBSS suplementado con 1% HEPES. <ol><li> Determinar un órgano externo o visible que demostraráactividad de reportero y examinar los embriones utilizando un microscopio estereoscópico fluorescente. Recoger los embriones que presentan actividad de reportero en el hielo frío HBSS suplementado con 1% de HEPES como éstos son objeto del experimento. </li></ol></li><li> Recoger los huesos temporales: <ol><li> Trabajando rápidamente, utilizando una fuente de luz fría y unas pinzas finas, recoger las cabezas de los cachorros. Tenga cuidado de clip en las vértebras cervicales y debajo de la mandíbula para evitar daños a los huesos temporales. </li><li> Abra cuidadosamente el cráneo. Retire el cerebro, recortar la parte delantera de la cabeza, y transferir el cráneo posterior a hielo fresco HBSS frío suplementado con 1% de HEPES en un plato limpio. Diseccionar cuidadosamente los huesos temporales con forma de maní, teniendo cuidado de mantener el sistema vestibular en el tacto. </li></ol></li><li> Diseccionar la cóclea: <ol><li> La transferencia de los huesos temporales a un plato recubierto de elastómero de silicona negro en el hielo frío HBSS suplementado con 1% de HEPES, el pin de la región vestibular del hueso. Inserte clavijas de insectos enun ángulo oblicuo con el fin de estabilizar el hueso temporal y crear espacio para los fórceps. Prender con alfileres es un paso crucial en el proceso como si se permite que el hueso temporal para moverse demasiado, es muy difícil de cosechar una cóclea intacta. </li><li> Retire con cuidado el cartílago que rodea la cóclea. Inserte una púa de las pinzas en el cartílago en el borde exterior de la base de la cóclea y el clip de un agujero en el cartílago. </li><li> Clip una solapa hacia arriba el lado, inserte el diente de las pinzas y separar suavemente el techo del conducto desde el cartílago. Clip horizontalmente a través de la parte superior y en diagonal, y levante con cuidado la sección delantera de la cápsula. Inserte una punta de las pinzas en entre el cartílago restante y el conducto y el clip suavemente de la última sección. La superficie apical de la cóclea está ahora expuesto. </li><li> Comenzando en la base, coger el área donde el techo del conducto coclear se encuentra con el epitelio y abra el conducto coclear. Tienes que despegar de la azotea, el recortecuando sea necesario, hasta que se elimina por completo. Se quita porciones de membrana izquierda en el lado medial del conducto. Limpiar el conducto de exceso de tejido mesenquimal y separar el conducto desde el sistema vestibular. </li></ol></li><li> Cultura de los explantes: <ol><li> Publicar un explante, luminal superficie hacia arriba, en el centro de una placa de cultivo de vidrio recubierta inferior sustrato, cuidadosamente extrayendo todo el líquido y dejar actuar durante dos minutos. Añadir 150 ml de DMEM complementado gota a gota para el explante, teniendo cuidado de no molestar a ella. Si el explante flotar libremente, vuelva a colocar con pinzas, pero tener cuidado de que el explante se deposita en el fondo del plato de manera que se puede unir al sustrato. </li><li> Coloque los platos de fondo de cristal en un profundo 12 cm placa de Petri de diámetro, con un pequeño plato de agua estéril para mantener la humedad. Ponga las culturas en las que un 35 ° C incubadora durante la noche para que el explante para adjuntar al sustrato y aplanar. </li></ol></li></ol> 2. Vivo ImagING <ol><li> Seleccionar muestras de explantes. Utilice un microscopio estereoscópico de fluorescencia para evaluar la condición de cada cóclea explantado. Sólo seleccione explantes donde el conducto está intacto y unido al cristal de la base al ápice. </li><li> Ajuste la incubadora a 35 ° C con 5% de CO 2 al tejido coclear cultura. Ponga las culturas en el microscopio incubadora: <ol><li> Aspirar suavemente la DMEM suplementado y reemplazar con al menos 500 l de medio nuevo. Para obtener imágenes de hasta 6 días, 1-1,5 ml es mejor. En los casos en los explantes están vagamente conectados, una pipeta un anillo de los medios de comunicación alrededor del borde del plato. Este líquido adicional hará una &#39;cámara de humidificado&#39; miniatura sin perturbar el explante mientras se sigue concediendo a la matriz. <ol><li> Como alternativa, el uso de bisagras plato cubre para abrir los párpados, mientras que el plato se mantiene en su adaptación en el microscopio si los reactivos deben ser intercambiados durante los intervalos entre las colecciones de imágenes. Tapas de platos de bisagras permiten que las tapas seanabierto sin molestar a las muestras o la eliminación de los platos de su configuración. Esto mantiene su posición exacta para capturas de imágenes posteriores. </li></ol></li><li> Inserte los platos de cristal inferior que contienen muestras adecuadas en el soporte de plato de muestra. El microscopio en este ejemplo tiene una plataforma giratoria que tiene ocho platos de 35 mm de la muestra. </li><li> En virtud de la campana de flujo laminar reemplazar las tapas de plástico con tapas de vidrio e insertar los platos en el soporte de plato de muestra. Coloque el soporte de platos de la muestra dentro de la incubadora teniendo cuidado de no desalojar los explantes de la parte inferior del plato o molestar a los medios de comunicación. </li></ol></li><li> Establecer la rutina de imagen: <ol><li> Encienda el microscopio, lámpara UV y la cámara y abra el software de imágenes. </li><li> Busque las muestras, escoger un área de imagen, el plano de enfoque y ajustar los tiempos de exposición para cada plato en secuencia. Elija el plano de enfoque dependiendo no sólo de la vista del explante en el momento de partida, pero alpor lo que teniendo en cuenta cómo el tejido se moverá y el tiempo que el curso del tiempo se ejecutará. </li><li> Establecer una pila Z centrado alrededor del plano focal seleccionada en el canal de fluorescencia. Ajuste la frecuencia y la duración de la toma de muestras para el experimento. La frecuencia de muestreo será limitado por el tiempo que se necesita para recoger imágenes, por lo que esta debe determinarse después de seleccionar campos de visión y el establecimiento de una pila Z. En este caso, el muestreo se lleva a cabo cada 30 minutos durante cinco días. La duración del experimento puede ser de hasta 14 días. </li></ol></li><li> Generar una película: <ol><li> Al final del período de tiempo transcurrido abrir los archivos de imagen. En este caso el software Metamorph que se abre puntos de recogida secuenciales se utiliza. Cuadro por cuadro elegir el mejor plano focal para mostrar la población celular de interés. </li><li> Convertir estas imágenes en un archivo .avi o exportarlos como un montaje para generar un conjunto de imágenes que se pueden abrir y analizados en el software de procesamiento de imágenes o convertir en múltiple-formats utilizando el software de procesamiento de vídeo. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Hay varios puntos técnicos a tener en cuenta cuando se establecen las culturas y en la creación del microscopio de lapso de tiempo para que la imagen a largo plazo. Utilizamos matriz de membrana basal como sustrato para el cultivo de explantes cocleares, pero el sustrato debe corresponder al tipo de células. Por ejemplo, para cultivos neuronales de la imagen, puede ser mejor para proporcionar un revestimiento fibronectina. La temperatura de incubación y la composición de gas también deben ser elegidos según el tipo de tejido. La elección de la edad del explante es importante. Comenzamos en E13 en la primera porque en E12 la dirección del crecimiento es menos predecible. Como es esencial que los explantes se cultivan durante la noche para unir al sustrato, los experimentos deben ser planificadas para comenzar el día siguiente. Si un experimento es comenzar a E15 o más viejos, los cultivos deben establecerse sobre E13 como el tiempo, el tejido se aplana y se extiende de modo que las células son más fáciles de imagen (véase la Figura 3). </p&gt; Si el órgano de Corti es en ser fotografiado, es esencial que la cóclea se diseca cuidadosamente. Nicks en el borde lateral del explante romper la tensión interna del tejido, por lo tanto, cuando la cóclea sufre reordenamientos morfológicas, derrame &#39;&#39; las células a través de la formación de una &#39;v&#39; protrusion.This protuberancia en forma de lágrima puede mover la región de interés fuera de la vista . Además, se debe tener cuidado para eliminar la mayor cantidad de la cubierta del conducto en el lado medial como sea posible. Este tejido continúa proliferando como el explante se expande y puede crecer sobre la parte superior de la región de interés ocultando de la vista. Al configurar la rutina de imágenes, el crecimiento y los cambios en la morfología de la cóclea se deben considerar cuidadosamente. El objetivo debe ser elegido sobre la base no sólo del tamaño de la región para obtener imágenes, sino también teniendo en cuenta si esa región se moverá o ampliar. Las células en la región medialde la cóclea (Figura 1 y 2) se dividen y se mueven dentro de un área confinada, por lo que una gran ampliación puede ser utilizado (20X, 40X, 60X). Las células en el órgano de Corti o el epitelio lateral, sin embargo, se moverán como el explante crece; un aumento menor (10X o 20X) es mejor, ya que las posibilidades de que las células permanecerá en el campo de visión son más altos. Obtención de imágenes de regiones fijas de la cóclea es posible a altas magnificaciones. Elegimos utilizar un objetivo de 10X en la sección de resultados representativos porque hemos querido mostrar todo el explante, y debido a que el movimiento de los tejidos es dinámica en las primeras etapas. Siguiente a considerar es el plano de enfoque. Dado que el explante crecerá hacia el exterior y aplanar, es probable que el plano focal va a cambiar dramáticamente en el transcurso del tiempo. Si la región de interés es el órgano de Corti o epitelio lateral, anticipando esto y centrarse en las células que migran fuera del explante puede ayudar. Esto es alpor lo que un argumento para el uso de los objetivos de aumento más bajo. Es posible establecer pilas Z, tanto para fluorescencia y DIC. Si las células de interés son probable que se mueva fuera de foco, la creación de una pila Z de 3-5 micras por paso puede contrarrestar esto, especialmente si el último paso es en el plano de la cubierta de vidrio. Puede ser difícil elegir el plano correcto durante la visualización de las culturas en el día uno, como la densidad de empaquetamiento de las células y la luz del tejido circundante puede prevenir una visión clara reflejada. Al revisar los marcos para generar una película o montaje más tarde, la selección cuidadosa de Z-planos también permite el seguimiento de los movimientos de las células en tres dimensiones. El experimento se puede detener en cualquier momento para ajustar los ajustes de enfoque si la muestra se mueve fuera de rango. Imágenes en vivo de un explante coclear más de una semana añade una nueva dimensión a la comprensión del desarrollo de la cóclea que complementará imágenes en vivo confocal. Este es un método excelente para usar cuando el órgano de ancho de largo-término examen es necesario, pero no sustituirá a alta magnificación de imagen confocal para estudios de células solo a corto plazo. Elección de la técnica depende del tipo de tejido a la imagen y el contexto del experimento. Esta técnica permitirá a los investigadores para examinar los cambios espacio-temporales en la expresión del gen indicador, la proliferación celular y la migración en tiempo real y permiten el estudio de la respuesta del gen reportero a los agentes farmacéuticos y viabilidad de las células con más detalle que antes era posible.

La cóclea de los mamíferos es un órgano complejo altamente ordenada. En el ratón, entre la aparición del oído interno primitiva de la vesícula ótica en el día E11 y la finalización del programa de desarrollo en las etapas postnatales tempranas, múltiples oleadas de la señalización celular y los cambios coordinados en la expresión génica se llevan a cabo. Que va desde la base al ápice del conducto coclear es el sonido detectar epitelio sensorial, o el órgano de Corti. Desarrollo del órgano de Corti está exquisitamente controlada de tal manera que al final del desarrollo, que consistirá en una sola fila de células ciliadas internas, tres filas de células ciliadas externas intercalados con cinco filas de células de apoyo (dos filas de células pilar, tres hileras de células Deiters &#39;) 1. La desviación de esta precisos resultados de orden en la pérdida de audición, heighlighting la importancia de studye deEl génesis y el patrón de la epithemlium sensorial 2. En el cultivo in vitro de la coch ratón embrionariolea es una herramienta esencial en el estudio de los mecanismos de desarrollo del órgano de Corti. Esta técnica fue establecida en 1974 y en los últimos 40 años, ha sido utilizado para dilucidar muchos de los mecanismos por los que se especifica el epitelio sensorial y el órgano de Corti estableció 3. La cóclea es un órgano complejo con los procesos de desarrollo dinámicos; una manipulación puede llegar a tardar hasta siete días para manifestar 1. Por ejemplo, cuando la adición de inhibidores de GSK 3β a un cultivo de explantes cocleares en E13, el período de incubación óptimo para observar un efecto robusta del compuesto es de seis días 4. Imágenes en vivo de la cóclea permite el desarrollo de investigación sobre los cambios en la morfología del órgano de Corti, los cambios en la expresión génica, el seguimiento de la migración, proliferación o células que mueren, y que permite la observación en tiempo real de los resultados de los agentes farmacéuticos y la alteración de la señalización vías. Hasta ahora, la imagen en directo de la cócleaprincipalmente se ha realizado utilizando microscopía confocal para pequeñas áreas de imagen del órgano de Corti en períodos de tiempo cortos 5-8, pero esta técnica tiene limitaciones debido a la viabilidad de explante. En las imágenes de los efectos de las manipulaciones a largo plazo sobre los procesos de desarrollo lento, el entorno de imagen es crucial. Normalmente, un sistema de imagen confocal en vivo utiliza una caja de plástico humidificado que se sienta en el microscopio. El calor y la humedad pueden escapar a través de los huecos en el cuadro de la incubación de donde se encuentra con la mesa del microscopio, a través de las ventanas de acceso, a través de las aberturas de bisagra y a través de los huecos alrededor de varias partes de la Microscopio- tales como el objetivo o la fuente de luz. Este no es óptimo para el mantenimiento de explantes sanos durante más de dos o tres días. Definimos &#39;microscopio incubadora&#39; como un microscopio invertido sellado dentro de un incubador de CO2 estándar, en lugar de una incubadora construida alrededor del microscopio. Un microscopio incubadora extiende la vida del experimento de tal manera que en lugar de formación de imágenes de más de dos o tres días, las muestras se pueden obtener imágenes de hasta dos semanas. Un microscopio incubadora ofrece un excelente ambiente para el crecimiento y la diferenciación celular, con el menor trastorno posible a explante culturas y condiciones estándar controlado. En los estudios que se llevan a cabo a través de múltiples día es común que recurrir a muestras de formación de imágenes sobre una base diaria por la eliminación de ellos de la incubadora y llevándolos a un microscopio de fluorescencia invertido. Si bien este enfoque puede funcionar, la eliminación de los platos de la incubadora inflige presión sobre el tejido en desarrollo sensible. Los cambios en la acidez del medio de cultivo y las fluctuaciones en la temperatura debido a la eliminación de la incubadora pueden resultar en el desarrollo subóptima y tejido enfermo. Imágenes de la misma región en el mismo plano focal y en la misma orientación en cada punto de tiempo es extremadamente difícil. Mediante el uso de un sistema automatizado dentro de una incubadora, es posible mantener saludabletejido, para recoger imágenes en más puntos de tiempo y para garantizar que la misma área es capturada en cada fotograma. En los últimos años se han desarrollado varias incubadoras de tejido microscopio integrados, estos han sido útiles no sólo en la práctica clínica 9, sino también en células madre y la investigación del cáncer 10,11. Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes en vivo a largo plazo de explantes cocleares embrionarias de ratón. Utilizamos un sistema de microscopía automatizada dentro de un incubador de CO2 estándar que tiene la capacidad de capturar imágenes de múltiples muestras en los puntos de tiempo establecidos. El sistema consta de un microscopio invertido conjunto dentro de una incubadora. Las muestras se colocan en una tarima giratoria que permite obtener imágenes de múltiples muestras en cada punto de tiempo. La iluminación, la captura de imágenes, y la rotación de la tarima están controlados por un sistema automatizado operado a través de software Metamorph. Al establecer una rutina de imágenes utilizando el software de funcionamiento podemos establecer un experimento para funcionar durante un máximo de two semanas, con mínima intervención humana. En este ejemplo usamos tanto de campo claro y fluorescencia para mostrar el crecimiento a gran escala y la reordenación de la cóclea, y en concreto, la región prosensorial. En este experimento, cochleae será disecado de ratones reportero EGFP Sox2 en el día embrionario E13. Se establecerá cultivos in vitro y luego fotografiada durante cinco días.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle media</td><td>Gibco</td><td>12430</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>Basement membrane extract&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers.&lt;br/&gt; http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>5630080</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>100 x N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution</td><td>Gibco</td><td>14170161</td><td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use.&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&amp;amp;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>Size number 5&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&amp;amp;CategoryId=29</td></tr><tr><td>Curette&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10080-05</td><td>size 1 mm&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&amp;amp;CategoryId=118</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-35</td><td>Must be stainless Steel&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td></tr><tr><td>50 mm plastic dishes</td><td>Corning/Falcon</td><td>351006</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>charcoal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05105-250G</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>184 silicone elastomer</td><td>Dow/Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dishes are home made several weeks in advance.&amp;nbsp; Silicone elastomer can be from any supplier.&lt;a href=&quot;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&quot;&gt;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&amp;nbsp; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL.&lt;br/&gt; http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&amp;amp;cPath= 1_4_15&amp;amp;products_id=2</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>495101-9804-000</td><td>&amp;nbsp;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td></tr><tr><td>Cold Light Source</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-182</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td></tr><tr><td>Fluorescent Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Leica microsystems</td><td>Contact Leica microsystems</td><td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td></tr><tr><td>Incubator Microscope +imaging software</td><td>Olympus</td><td>Contact Olympus</td><td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software.&lt;br/&gt; http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&amp;amp;c=0</td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Thermo Scientific</td><td>51029701</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3310</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td></tr><tr><td>Laminar Flow hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026651</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td></tr></tbody></table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

Aquí presentamos un método para obtener imágenes de lapso de tiempo a largo plazo de los explantes cocleares de ratón embrionarias en vivo. El programa de desarrollo responsable de la construcción de la muy ordenada, compleja estructura de los ingresos cóclea de mamíferos durante unos diez días. Con el fin de estudiar los cambios en la expresión génica durante este período y su respuesta a farmacéutico o la manipulación genética, de formación de imágenes a largo plazo es necesario. Anteriormente, imágenes en vivo ha sido típicamente limitada por la viabilidad del tejido explantado en una cámara humidificada encima de un microscopio estándar. Dificultad en el mantenimiento de las condiciones óptimas para el crecimiento del cultivo con respecto a la humedad y la temperatura ha puesto límites en la longitud de los experimentos de imagen. Un microscopio integrado en una incubadora de cultivo de tejidos modificados ofrece un excelente ambiente para la formación de imágenes a largo plazo en directo. En este método se demuestra cómo establecer ratón embrionario explantes cocleares y cómo utilizar un microscopio incubadora para realizar Imagi lapso de tiempong utilizando tanto de campo brillante y microscopía fluorescente para examinar el comportamiento de un día típico embrionario (E) 13 explante coclear y Sox2, un marcador de las células prosensoriales de la cóclea, durante 5 días.

Aquí mostramos un montaje (Figura 1) y una película (Figura 2) que demuestra cómo una típica explante coclear organotípico crecerá si chapado en E13.5. Un reportero del ratón Sox2 se utiliza para visualizar la región prosensorial. La película ilustra que la cóclea se somete a crecimiento y la convergencia y la extensión, las células en la región lateral del dominio Sox2 verde no parecen dividir como el tejido circundante se expande. Esta es una característica del órgano de Corti; E13 en el epitelio sensorial prospectivo sale del ciclo celular y posteriormente se conoce como la zona de la no proliferación 13. Un segundo experimento de lapso de tiempo centrado en la base de un explante mediados coclear diferente (Figuras 3 y 4) demuestra que la medida que se extiende, la región prosensorial se estrecha. Tenga en cuenta que después de tres días en cultivo del tejido se ha aplanado considerablemente de tal manera que es posible visualizar indivicélulas fluorescentes duales, mientras que al principio hay regiones donde la reflexión interna de la luz debido al espesor del tejido hacen posible identificar regiones de expresión, pero no las células individuales. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1:. Tiempo - imágenes de lapso de tejido coclear reportero Sox2 recogido más de cinco días Este montaje muestra el progreso del crecimiento del explante de partida en el día cero y terminando en el quinto día, el muestreo cada 30 minutos utilizando un objetivo de 10X. El explante se estableció el E13 y se cultivaron durante la noche antes de la imagen. A medida que el explante madura que tanto crece y se somete a los movimientos de extensión convergentes. (A) imágenes secuenciales que muestran el grado de crecimiento coclear a intervalos de 12 h. Canal de luz visible cubrió de gen GFP fluorescenciacalificado por el reportero EGFP Sox2. canal de fluorescencia (B) sólo GFP. La barra de escala corresponde a 200 micras. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/Figure2.f4v" target="_blank">Figura 2</a> :. animación de lapso de tiempo de tejido coclear reportero Sox2 recogido más de 5 días Este es el mismo experimento explante indica en la Figura 1, esta vez los marcos se seleccionan a intervalos de 30 min durante 5 días y se combinaron como un archivo .avi para generar una película. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3:. Mediados de someterse a base de movimientos de CE y aplanamiento SequentiAL imágenes que muestran que el epitelio prosensorial de la base de MID (EGFP) se estrecha, se extiende y se aplana en el transcurso de 5 días. Las flechas indican región que se estrecha. Marcos seleccionados a partir de una secuencia de lapso de tiempo de 5 días en intervalos de 12 h utilizando un objetivo de 10X. La barra de escala corresponde a 200 micras. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta cifra.</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/Figure4.f4v" target="_blank">Figura 4</a> : animación Time-lapse de la base de mediados de someterse a los movimientos de la CE y el aplanamiento secuencia de lapso de tiempo de animación que muestra la convergencia y la extensión del epitelio sensorial se muestra en la Figura 3 con cuadros seleccionados en intervalos de 30 min..

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Imágenes en vivo de la cóclea de mamíferos embrionario es un reto porque los procesos de desarrollo en la mano operan en un gradiente temporal de más de diez días. Aquí presentamos un método para cultivar y luego la formación de imágenes de embriones tejido explante coclear tomado de un ratón reportero fluorescente en cinco días.

A largo plazo Lapso de tiempo de imágenes de Ratón cocleares explantes

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K vistas.  Sunnybrook Research Institute.  Imágenes en vivo de la cóclea de mamíferos embrionario es un reto porque los procesos de desarrollo en la mano operan en un gradiente temporal de más de diez días. Aquí presentamos un método para cultivar y luego la formación de imágenes de embriones tejido explante coclear tomado de un ratón reportero fluorescente en cinco días. 

Video: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Cultura de embriones de ratón explantes cocleares y Gene Transfer por electroporación

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

A largo plazo intravital Inmunofluorescencia imágenes de tejido Componentes de Matriz con epifluorescencia y microscopía de dos fotones

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Bioingeniería

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Un protocolo para Decellularizing ratón cócleas para ingeniería de tejidos del oído interno

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET remain unknown. Electrophysiological studies of hair cells revealed that the MET channel has a large conductance and is permeable to relatively large fluorescent cationic molecules, including some styryl dyes and Texas Red-labeled aminoglycoside antibiotics. In this protocol, we describe a method to visualize and evaluate the uptake of fluorescent dextrans in hair cells of the organ of Corti explants that can be used to assay for functional MET channels. We found that 3 kDa Texas Red-labeled dextran specifically labels functional auditory hair cells after 1&#8211;2 h incubation. In particular, 3 kDa dextran labels the two shorter stereocilia rows and accumulates in the cell body in a diffuse pattern when functional MET channels are present. An additional vesicle-like pattern of labeling was observed in the cell body of hair cells and surrounding supporting cells. Our data suggest that 3 kDa Texas-Red dextran can be used to visualize and study two pathways for cellular dye uptake; a hair cell-specific entry route through functional MET channels and endocytosis, a pattern also available to larger dextran.

Here, we present a method for visualizing the uptake of 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditory hair cells with functional mechanotransduction channels. In addition, dextrans of 3&#8211;10 kDa can be used to study endocytosis in hair and supporting cells of the organ of Corti.

Etiquetado y toma de Dextran en células de cabello cocleares de murine en vivo y funcionales

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Técnica de Explante Coclear Murino Neonatal como<em&gt; In Vitro</em&gt; Herramienta de detección en la investigación de la audición

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Medicina

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparación de la superficie coclear en el ratón adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Neurociencias

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia that are arranged in rows of increasing height. When stereocilia are deflected, they tug on tiny (~5 nm in diameter) extracellular tip links interconnecting stereocilia, which convey forces to the mechanosensitive transduction channels. Although mechanotransduction has been studied in live hair cells for decades, the functionally important ultrastructural details of the mechanotransduction machinery at the tips of stereocilia (such as tip link dynamics or transduction-dependent stereocilia remodeling) can still be studied only in dead cells with electron microscopy. Theoretically, scanning probe techniques, such as atomic force microscopy, have enough resolution to visualize the surface of stereocilia. However, independent of imaging mode, even the slightest contact of the atomic force microscopy probe with the stereocilia bundle usually damages the bundle. Here we present a detailed protocol for the hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) imaging of live rodent auditory hair cells. This non-contact scanning probe technique allows time lapse imaging of the surface of live cells with a complex topography, like hair cells, with single nanometers resolution and without making physical contact with the sample. The HPICM uses an electrical current passing through the glass nanopipette to detect the cell surface in close vicinity to the pipette, while a 3D-positioning piezoelectric system scans the surface and generates its image. With HPICM, we were able to image stereocilia bundles and the links interconnecting stereocilia in live auditory hair cells for several hours without noticeable damage. We anticipate that the use of HPICM will allow direct exploration of ultrastructural changes in the stereocilia of live hair cells for better understanding of their function.

Here we present a protocol for the Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), a non-contact scanning probe technique that allows nanoscale imaging of stereocilia bundles in live auditory hair cells.

Imágenes de paquetes de estereocilios con resolución a nanoescala en células ciliadas auditivas de mamíferos vivos

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

In vitro Time-lapse live-cell imaging para explorar la migración celular hacia el órgano de Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

Obtención de imágenes de la cóclea envejecida con microscopía de fluorescencia de lámina de luz

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

Explantes cocleares neonatales enteros como modelo in vitro

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...