Name: long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants
Uploaded: 2014-11-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants at JoVE.com

Yararlı yorumlar ve yapıcı tavsiye için üç anonim yorumcular teknik yardım için Willy Güneş ve Dr. Kris Gellynck için teşekkür ederiz. Bu çalışma Sunnybrook İşitme Yenilenme Girişimi tarafından finanse edildi

Fare doku korunur ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Hayvan Bakımı kurallar üzerinde Kanadalı Konseyi çerçevesinde ötenazi farelerde 12 -reporter Sox2 EGFP hasat edildi. 1. Kültürleme Embriyonik Cochleae <ol><li> 8.89 mL DMEM, fetal sığır serumu ve 1 ml (FBS), 100 x N2 ek 100 ul ve / ml siprofloksasin, 10 mg, 10 ul karıştırılarak Dulbecco Modifiye Eagle ortamı (DMEM) Supplement. % 100 HEPES, 5 ml ile 495 ml HBSS karıştırılmasıyla Hank Dengeli Tuz Solüsyonu (HBSS), Supplement. </li><li> Cam alt kültür yemekleri hazırlayın: <ol><li> Bir laminar akış başlığı içinde, 5 ml DMEM içinde 200 ul bazal membran ekstraktıdır alt-tabakanın yeniden süspanse edin. 10 mm kuyu ile 35 mm çapındaki cam alt kültür yemekleri hazırlayın. Her cam merkezi için pipet 150 ul alt tabaka / DMEM dipli çanak. Bu yemekler 40 dakika inkübe edildikten sonra kullanılabilir, veya bir CO 2 depolanabilir </sub&gt; En az bir hafta boyunca 35 ° C&#39;de kuluçka makinesine kondu. NOT: çanak taban şeffaf ve görüntüleme için uygun olduğundan emin olmak için, iyi eksplantlar nihayet kolayca bulunduğu alanda yerleşmek için izin verir ve yemeğin ortasında bir oluşturmak için: Cam yemekler aşağıdaki nedenlerle kullanılır dipli bu nedenle, bir deneyden sonra numune immüno-boyama ve bir sonraki analiz için işlenebilmesidir. </li></ol></li><li> Iş istasyonu ve araçları hazırlayın: <ol><li> Laminer akımlı temiz tezgah açın ve temiz bir çalışma alanı oluşturmak için% 70 EtOH ile aşağı püskürtün. % 70 EtOH (madde (1 kısım) ve kömür tozu (2.5 g), sertleştirme 184 silikon elastomer (10 kısım) bir karışımı) forseps, kaşık ve siyah 184 silikon elastomer çanak bekletin. </li></ol></li><li> Temiz çalışma istasyonu, deney için hasat embriyolar. Soğuk HBSS% 1 HEPES buz uygun gebeliğin embriyolar toplayın. <ol><li> Göstereceğiz harici veya görünür organını belirleyinmuhabir aktivitesi ve bir floresan stereo mikroskop kullanılarak embriyolar inceleyin. Deneyin konusu bu olarak% 1 HEPES ile takviye edilmiş olan, soğuk HBSS buz reporter aktivitesini sergileyen embriyolar toplayın. </li></ol></li><li> Zamansal kemikleri toplayın: <ol><li> Serin bir ışık kaynağı ve ince forseps kullanarak, hızlı bir çalışma, yavruların kafalarını toplamak. Temporal kemiklerin zarar görmesini önlemek için servikal omurlar seviyesinde ve çene altında klibi için özen gösterin. </li><li> Dikkatle kafatası açın. , Beyin çıkarın başının ön keserek ve temiz bir tabak% 1 HEPES taze buz HBSS&#39;nin için arka kafatası aktarın. Dikkatle inceliğini vestibüler sistemin tutmaya özen fıstık şeklindeki zamansal kemikleri teşrih. </li></ol></li><li> Kokleayı ayır: <ol><li> Soğuk HBSS,% 1 HEPES, buz içerisinde siyah bir silikon elastomer kaplı tabak ve temporal kemik transfer kemik vestibüler bölgesini pin. Böcek işaretçilerine takıntemporal kemik stabilize ve forseps için bir oda oluşturmak için bir eğik açı. Temporal kemik bir sağlam koklea hasat etmek çok zordur çok fazla hareket etmesine imkân tanınır gibi Sabitleme sürecinde çok önemli bir adımdır. </li><li> Dikkatle kokleayı çevreleyen kıkırdak çıkarın. Koklea tabanının dış kenarında kıkırdağa forseps bir dişe yerleştirin ve kıkırdak içine bir delik klip. </li><li> , Yan bir kapağını Clip forseps tine yerleştirin ve yavaşça kıkırdaktan kanalının çatı ayırın. Çapraz ve üst kısmında yatay Klip ve dikkatle kapsülün ön kısmını kaldırın. Kalan kıkırdak ve kanal arasında forseps bir ucu yerleştirin ve yavaşça son bölümü off klibi. Kokleanın apikal yüzeyi artık maruz kalmaktadır. </li><li> Üssünde başlayan, kanalın çatı koklear epitel karşılayan alanını yakalamak ve koklear kanalı açın. Yavaşça kırparak, çatıdan soymagerektiğinde tamamen kaldırılana kadar. Kanalın medial tarafında sol zarın herhangi bölümlerini keserek. Aşırı mezenkimal doku kanalı temizleyin ve vestibüler sistemden kanalı ayırmak. </li></ol></li><li> Kültür, eksplantlar: <ol><li> Dikkatle, bir alt tabaka kaplanmış cam alt kültür çanak merkezinde, bir eksplantın, lümen yüzeyi yukarı bakacak şekilde yerleştirin sıvının tüm kapalı çizmek ve iki dakika bekletin. Onu rahatsız etmemek için özen DMEM damla-bilge eksplantasyona takviye 150 ul ekleyin. Eksplant, serbest yüzer forseps ile yeniden konumlandırmak, ancak yüzeye tutunur, böylece eksplant yemeğin altına yerleşir dikkat etmelisiniz. </li><li> Nem elde etmek için steril su içinde küçük bir tabak, derin bir 12 cm çaplı bir petri tabağına cam alt yemekler yerleştirin. Gece boyunca eksplant substrata yapışır ve düzleştirmek için sırayla 35 ° C inkübatör içinde kültürleri koyun. </li></ol></li></ol> 2. Canlı Imaging <ol><li> Eksplant örnekleri seçin. Her Eksplante cochlea&#39;nın durumunu değerlendirmek için bir floresan stereo mikroskop kullanın. Kanal bozulmamış ve doruk tabanından camına yapışarak burada sadece eksplantlarını seçin. </li><li> Kültür koklear dokuya% 5 CO2 ile 35 ° C&#39;de kuluçka ayarlayın. Inkübatör mikroskop içine kültürleri koyun: <ol><li> Yavaşça takviye DMEM aspire ve en az 500 ul taze medya ile değiştirin. 6 gün kadar görüntüleme için 1-1.5 ml iyidir. Eksplantlar gevşek bir şekilde bağlı olması halinde, çanak kenarı etrafında ortamın bir halka pipetle. Bu matrise eklemek için devam ederken bu ekstra sıvı eksplant bozmadan bir minyatür &#39;nemlendirilmelidir odasını&#39; yapacak. <ol><li> Alternatif olarak, kullanım reaktifler görüntü koleksiyonları arasında aralıklarla sırasında değiş tokuş gerekiyorsa çanak mikroskop kendi uydurma kalır iken çanak kapaklarını açmak için kapakları menteşeli. Menteşeli çanak kapakları kapakları olmasına izinörnekleri rahatsız ya da ayarlarından yemekleri çıkarmadan açıldı. Bu sonraki görüntü yakalar için onların tam konumunu sürdürmektedir. </li></ol></li><li> Numune çanak tutucu içine uygun örneklerini içeren cam alt yemekleri yerleştirin. Bu örnekte mikroskop sekiz 35 mm numune yemekler sahip dönüşlü bir platform bulunmaktadır. </li><li> Laminer akış kaputun altında cam kapaklı plastik kapaklarını değiştirmek ve numune çanak tutucu içine yemekleri yerleştirin. Yemeğin altından eksplantlarm çıkarmak için ya da medyayı rahatsız değil inkübatör alarak bakımı içinde örnek çanak tutucu yerleştirin. </li></ol></li><li> Görüntüleme rutin ayarlayın: <ol><li> Mikroskop, UV lamba ve fotoğraf makinesini açın ve görüntüleme yazılımını açın. </li><li> , Örnekleri bulun sırayla her yemek için pozlama süreleri, bir görüntüleme alanı seçin odak düzlemi ve ayarlayın. Odak başlama zamanında eksplant görünüme sadece bağlı düzlemini seç, ancak Elböylece doku nasıl hareket edeceği ve zaman ders çalışacağını ne kadar göz önünde. </li><li> Floresan kanal seçilen odak düzlemi etrafında yoğunlaşan Z yığını ayarlayın. Deney için numune alma sıklığını ve uzunluğunu ayarlayın. Örnekleme sıklığı, görüntüleri toplamak için gereken zaman ile sınırlı olacak, bu yüzden bu görüş alanları seçme ve Z yığın ayarlandıktan sonra tespit edilmelidir. Bu durumda örnekleme beş gün boyunca her 30 dakikada bir gerçekleşir. Deney süresi 14 güne kadar olabilir. </li></ol></li><li> Bir film oluşturmak: <ol><li> Zaman atlamalı döneminin sonunda görüntü dosyalarını açmak. Ardışık toplama noktaları açar, bu durumda Metamorph yazılımı kullanılmaktadır. Kare kare ilgi hücre popülasyonu gösteren en iyi odak düzlemi seçin. </li><li> Bir avi dosyası bu görüntüleri dönüştürmek, ya da birden fazla forma açıldı ve analiz görüntü işleme yazılımı veya dönüştürülebilir görüntülerin bir dizi oluşturmak için bir montaj olarak bunları ihraçvideo işleme yazılımı kullanarak ts. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture.">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li><li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+for+canonical+Wnt/beta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea.">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li><li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+:+the+official+journal+of+Microscopy.">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti.">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6 (2013).</li><li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Kültürler kurulur ve uzun vadeli görüntüleme için sırayla time-lapse mikroskop kurma zaman dikkate alınması gereken birkaç teknik nokta vardır. Bu koklear eksplantların kültürlenmesiyle için bir alt tabaka olarak temel membran matrisi, ancak alt-tabaka, hücre tipi için uygun olmalıdır. Örneğin, görüntü nöron kültürleri ile, bir fibronektin kaplamasının temin edilmesi için daha iyi olabilir. Kuluçka sıcaklık ve gaz bileşimi, aynı zamanda, doku tipine bağlı olarak seçilmelidir. Eksplant yaşı seçimi önemlidir. E12 üzerinde büyüme yönü daha az tahmin edilebilir çünkü erken E13 başlayacak. Bu eksplantlar yüzeye bağlamak için gece boyunca kültürlü olması esastır gibi, deneyler ertesi gün başlamak için planlanmalıdır. Bir deneme E15 ya da daha büyük başlaması isteniyorsa, kültürler, doku düzleştirir ve böylece hücrelerin görüntü daha kolay yayılan zamanla olarak E13 üzerine kurulmalıdır (bakınız Şekil 3). </p&gt; Corti organ yansıması için, bu koklea çok dikkatle kesilmiştir esastır. Eksplant lateral kenarında çentik salyangoz görünümü dışında, ilgili bölgeyi taşıyabilir protrusion.This uzantı şeklinde bir &#39;V&#39; oluşturan gözyaşı yoluyla hücrelerin dökülme &#39;morfolojik düzenlenmeleri maruz dolayısıyla zaman, doku iç gerilim kırılmasına . Buna ek olarak, bakım mümkün medial yan kanal çatısının kadar ortadan kaldırmak için dikkat edilmelidir. Bu doku eksplant genişler ve görünümünden obscuring ilgi bölgenin üstünden büyüyebilir olarak çoğalmaya devam ediyor. Görüntüleme rutin kurarken, koklea morfolojisi büyüme ve değişiklikler dikkatlice ele alınmalıdır. Hedef bölgenin büyüklüğü yansıması için değil, aynı zamanda bu bölge hareket genişletildiklerinde olup olmadığını dikkate alınarak göre seçilmelidir. Orta bölümünde hücrelerböylece yüksek bir büyütme (20X, 40X, 60X) kullanılabilir koklea (Şekil 1 ve 2) böl ve sınırlı bir alanda hareket, bir. Eksplant büyüdükçe Corti veya yanal epitelin organ hücreleri Ancak, hareket edecektir; hücreler görüş alanında kalır başarı oranı çok yüksektir gibi bir düşük büyütme (10X ya da 20X), daha iyidir. Kokleanın sabit bölgelerinin Görüntüleme yüksek büyütme mümkündür. Biz bütün eksplant göstermek istediği için temsili sonuçlar bölümünde bir 10X objektif kullanmayı seçti ve doku hareketi erken dönemlerinde dinamik çünkü. Dikkate yanındaki odak düzlemi olduğunu. Eksplant dışa büyüyecek ve dümdüz olacak düşünüldüğünde, odak düzlemi süresi boyunca önemli ölçüde değişecektir olasıdır. Ilgi bölgesi Corti veya lateral epitel organı, bu tahmin ve yardımcı olabilir eksplant dışına göç eden hücreler üzerinde duruluyor ise. Bu, el olduğuböylece alt büyütme hedefleri kullanarak bir argüman. Bu floresan ve DIC hem de Z yığınları ayarlamak mümkündür. Ilgi hücreleri son adım kapak cam düzleminde, özellikle de bu karşı olabilir adım başı 3-5 mikron Z yığını kurma, odak dışında hareket olasılığı varsa. Bu hücrelerin paketleme yoğunluğu gibi, günün birinde kültürleri izlerken doğru uçağı seçmek zor olabilir ve net bir görüş önleyebilir çevreleyen dokudan yansıyan ışığı olabilir. Daha sonra bir film ya da montaj oluşturmak için kareleri incelerken, Z-uçakları dikkatli seçilmesi de üç boyutlu hücre hareketlerinin izlenmesine olanak sağlar. Deney numune aralığının dışında hareket ederse odak ayarlarını yapmak için herhangi bir noktada durdurulmuş olabilir. Bir hafta boyunca koklear eksplant Canlı görüntüleme konfokal canlı görüntüleme tamamlayacak Kokleanın gelişimini anlamak için yeni bir boyut ekler. Bu geniş, uzun, organ kullanmak için mükemmel bir yöntemdir-vadedeki muayene yapılması gereklidir, ancak kısa vadeli tek bir hücre çalışmaları için yüksek büyütme confocal görüntüleme yerine geçmez. Tekniğin seçimi, görüntülenecek doku türüne ve deney bağlamında bağlıdır. Bu teknik, araştırmacılar, gerçek zamanlı olarak raportör gen ekspresyonu, hücre proliferasyonu ve göçünde uzay-zaman değişiklikleri incelemek ve daha önce mümkün olandan daha ayrıntılı olarak hücrelerin farmasötik maddeler ve canlılığı için raportör gen cevabın çalışma olanak sağlayacaktır.

Memeli salyangozunun bir çok sipariş karmaşık bir organdır. Fare, doğum sonrası erken aşamalarında otik gün E11 üzerinde vezikül ve gelişimsel programın tamamlanmasından itibaren ilkel iç kulağın ortaya çıkması arasında, hücre sinyal birden dalgaları ve gen ifadesi koordine değişiklikler gerçekleşir. Koklear kanalın doruk tabanından çalışan Corti duyusal epiteli, organ ya da tespit sesidir. Corti organı Kalkınma zarif gelişme sonunda, bu iç saç hücrelerinin tek bir satır oluşacaktır şekilde kontrol edilir, dış saç hücrelerinin üç sıra destek hücrelerin beş satır (sütun hücrelerin iki satır, üç serpiştirilmiş Deiters &#39;hücrelerin satır) 1. , Işitme kaybı oluşumu ve duyusal epithemlium 2 desenlendirme kesitler studye önemini heighlighting Bu kesin emir sonuçlarından sapma. Embriyonik fare Coch in vitro kültür içindelea Corti organı gelişme mekanizmaları eğitim önemli bir araçtır. Bu teknik 1974 yılında kurulmuş ve son 40 yıldır, duyusal epitel belirtilen ve Corti organı 3 kurulduğu tarafından mekanizmaların birçok aydınlatmak için kullanılır olmuştur. Cochlea dinamik gelişim süreçleri ile karmaşık bir organdır; yedi gün 1 tezahür olarak bir manipülasyon olarak uzun sürebilir. E13 bir koklear eksplant kültürü için GSK, 3β inhibitörlerin eklenmesi, örneğin,, en uygun kuluçka süresi bileşiğinin güçlü bir etkisi altı gün 4 gözlemlemek. Gelişmekte Kokleanın Canlı görüntüleme Corti organı morfoloji değişiklikleri soruşturma verir, gen ifadesi değişiklikleri, göç ve izleme çoğalan veya hücreleri ölüyor, ve gerçek-zamanlı ilaç ajanların sonuçlarının gözlem ve sinyalizasyon bozulması sağlar yollar. Şimdiye kadar, Kokleanın Canlı görüntülemeyeağırlıklı olarak kısa süreler 5-8 üzerinde Corti organı görüntü küçük alanlarda konfokal mikroskopi kullanılarak gerçekleştirilen, ancak bu tekniğin eksplant canlılığı nedeniyle sınırlamalar sahiptir. Yavaş gelişim süreçleri uzun süreli manipülasyon etkilerinin görüntülemede, görüntüleme ortamında çok önemlidir. Tipik bir konfokal canlı görüntüleme sistemi mikroskop oturur nemlendirilmiş bir plastik kutu kullanır. Isı ve nem gibi objektif veya ışık kaynağı olarak eklemli açıklıklar içinden ve microscope- çeşitli parçaları etrafında boşluklar aracılığıyla, erişim pencerelerden, mikroskop tablo uygun kuluçka kutusuna boşluklar kaçabilir. Bu fazla iki veya üç gün boyunca sağlıklı eksplantlarını korumak için optimal değildir. Biz standart bir CO 2 inkübatör içinde mühürlü bir ters mikroskop yerine mikroskop etrafında inşa edilen bir inkübatör olarak &#39;inkübatör mikroskop&#39; tanımlar. Bir inkübatör mikroskop exDeneyin ömrünü uzatmaktadır yerine, iki veya üç gün boyunca görüntüleme daha, örnekler iki haftaya kadar süre için görüntülü şekildedir. Bir inkübatör mikroskop kültürleri ve standart kontrollü koşullar eksplantasyona minimal rahatsızlık, hücre büyümesi ve farklılaşması için mükemmel bir ortam sağlar. Birden fazla gün içinde yer alan çalışmalarda inkübatörden çıkardıktan ve bir ters flüoresan mikroskop bunları taşıyarak günlük olarak görüntüleme örneklere başvurmak olağandır. Bu yaklaşım işe iken, inkübatör bulaşıkları kaldırma duyarlı gelişmekte olan doku üzerinde stres uğratan. Nedeniyle inkübatörden çıkarıldıktan için sıcaklık kültürleme orta ve dalgalanmalar asit değişiklikleri optimal gelişim ve sağlıksız dokuya neden olabilir. Aynı odak düzlemi ve her zaman noktasında aynı yönde aynı bölgeyi görüntüleme son derece zordur. Bir inkübatör içinde otomatik bir sistem kullanılarak, sağlıklı sağlamak mümkündürdoku, daha fazla zaman noktalarında görüntüleri toplamak ve aynı alan her karede yakalanmasını sağlamak için. Son yıllarda birçok entegre mikroskop doku inkübatör, geliştirilen bu klinik pratikte 9 değil aynı zamanda kök hücre ve kanser araştırmalarında 10,11 değil sadece yararlı olmuştur. Burada embriyonik fare koklear eksplantlannın uzun vadeli canlı görüntüleme için bir protokol mevcut. Biz set zaman noktalarında çoklu numunelerin görüntüleri yakalamak için kapasitesine sahip standart bir CO 2 inkübatör içinde otomatik bir mikroskop sistemi kullanın. Sistem, bir kuluçka makinesi içine yerleştirilmiş ters çevrilmiş bir mikroskop oluşur. Numuneler, her bir zaman noktasında çok sayıda örneğin görüntüleme sağlayan döner bir kürsü yerleştirilir. Aydınlatma, görüntü yakalama ve kürsünün dönme Metamorph yazılımı aracılığıyla işletilen otomatik bir sistem tarafından kontrol edilir. Işletim yazılımı kullanarak bir görüntüleme rutin ayarlayarak biz tw kadar aday için bir deney ayarlayabilirsinizen az insan müdahalesi ile o hafta. Bu örnekte biz özellikle büyük ölçekli büyüme ve koklea yeniden düzenlenmesini ve, prosensory bölgeyi göstermek için hem parlak bir alan ve floresan kullanın. Bu deneyde, cochleae. Embriyonik gün E13 üzerinde Sox2 EGFP muhabiri fareler disseke edilecektir In vitro kültürler kurulacak ve daha sonra beş gün içinde görüntülendi.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle media</td><td>Gibco</td><td>12430</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>Basement membrane extract&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers.&lt;br/&gt; http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>5630080</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>100 x N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution</td><td>Gibco</td><td>14170161</td><td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use.&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&amp;amp;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>Size number 5&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&amp;amp;CategoryId=29</td></tr><tr><td>Curette&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10080-05</td><td>size 1 mm&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&amp;amp;CategoryId=118</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-35</td><td>Must be stainless Steel&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td></tr><tr><td>50 mm plastic dishes</td><td>Corning/Falcon</td><td>351006</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>charcoal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05105-250G</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>184 silicone elastomer</td><td>Dow/Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dishes are home made several weeks in advance.&amp;nbsp; Silicone elastomer can be from any supplier.&lt;a href=&quot;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&quot;&gt;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&amp;nbsp; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL.&lt;br/&gt; http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&amp;amp;cPath= 1_4_15&amp;amp;products_id=2</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>495101-9804-000</td><td>&amp;nbsp;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td></tr><tr><td>Cold Light Source</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-182</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td></tr><tr><td>Fluorescent Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Leica microsystems</td><td>Contact Leica microsystems</td><td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td></tr><tr><td>Incubator Microscope +imaging software</td><td>Olympus</td><td>Contact Olympus</td><td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software.&lt;br/&gt; http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&amp;amp;c=0</td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Thermo Scientific</td><td>51029701</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3310</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td></tr><tr><td>Laminar Flow hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026651</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td></tr></tbody></table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

Burada canlı embriyonik fare koklear eksplantlannın uzun vadeli time-lapse görüntüleme için bir yöntem mevcut. Yaklaşık on gün boyunca memeli koklea gelirlerinin son derece düzenli, kompleks bir yapı oluşturmanın sorumlu gelişimsel programı. Bu süre boyunca gen ifadesindeki değişiklikler ve farmasötik veya genetik manipülasyona tepkilerini incelemek amacıyla, uzun dönemli görüntüleme gereklidir. Daha önce, canlı görüntüleme tipik olarak, standart bir mikroskop üzerinde bir nemlendirilmiş oda içinde Çıkarılan dokunun yaşayabilirliği ile sınırlandırılmıştır. Nem ve sıcaklık açısından Kültür büyümesi için gerekli ideal koşulları altında güçlüğü görüntüleme deneyleri uzunluğuna sınırları vermiştir. Değiştirilmiş bir doku kültürü inkübatör entegre bir mikroskop uzun vadeli-canlı görüntüleme için mükemmel bir ortam sağlar. Bu yöntemde biz embriyonik fare koklear eksplantlar kurmak nasıl ve zaman atlamalı IMAGI yapmak için bir inkübatör mikroskop nasıl kullanılacağını göstermektedirng 5 gün boyunca tipik embriyonik gün (E) 13 koklear çıkarılması ve Sox2, koklea prosensory hücrelerin bir göstergesi, davranışını incelemek için parlak bir alan ve floresan mikroskopi her ikisini de kullanarak.

Burada bir montaj (Şekil 1) ve E13.5 üzerine kaplama eğer tipik bir organotipik koklear eksplant büyüyecek nasıl gösteren bir film (Şekil 2) göstermektedir. Bir Sox2 raportör fare prosensory bölge görselleştirmek için kullanılmıştır. Film koklea büyüme ve yakınsama ve uzantısı uğradığını göstermektedir, yeşil Sox2 etki lateral bölgede hücreler genişler çevreleyen doku olarak bölmek için görünmüyor. Bu Corti organı karakteristik bir özelliğidir; E13 üzerindeki muhtemel duyusal epitel hücre döngüsünü çıkar ve takiben çoğalma 13&#39;ün bölgesi olarak bilinir. Farklı bir koklear eksplant orta tabanı (Şekil 3 ve 4) uzanır gibi, prosensory bölge daraltır gösteriyor odaklanma ikinci time-lapse deney. Kültür içinde üç gün sonra doku o Indivi görselleştirmek için mümkün olduğu ölçüde bu yassı unutmayınÇift floresanlama hücreleri, başında nedeniyle doku kalınlığına ışığın iç yansıma mümkün ifadenin bölgelerini ancak bireysel değil hücreleri belirlemek için yapmak bölgeler vardır oysa. <img alt="Şekil 1," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1:. Zaman - beş gün boyunca toplanan Sox2 muhabiri koklear doku atlamalı görüntüleri Bu montaj eksplant büyüme sıfır gününde başlayan ve 10X objektif kullanılarak her 30 dakikada bir örnekleme, günde beş biten bir ilerleme gösterir. Eksplant E13 üzerinde kurulmuş ve görüntüleme önce gece boyunca kültüre edildi. Eksplant onu olgunlaştıkça hem büyür ve yakınsak uzatma hareketleri uğrar. 12 saat aralıklarla koklear büyüme boyutlarını gösteren (A) Sıralı görüntüler. Görünür ışık kanal GFP floresan geni ile kaplanmıştırEGFP Sox2 muhabiri tarafından derecelendirildi. (B) GFP floresan kanal sadece. Ölçek çubuğu 200 mikron karşılık gelir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/Figure2.f4v" target="_blank">Şekil 2</a> :. 5 gün boyunca toplanan Sox2 muhabiri koklear dokusunun Time-lapse animasyon Bu Şekil 1&#39;de gösterildiği aynı eksplant deneydir, bu zaman çerçevesi 5 gün boyunca 30 dakika aralıklarla seçilmiş ve üretmek için bir avi dosyası olarak birleştirilir film. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3:. Orta taban CE hareketleri geçiyor ve düzleştirme Sequentiorta tabanın prosensory epitel (EGFP) sınırlandırdığına uzanır ve 5 gün boyunca düzleştirir olduğunu gösteren diğerleri görüntüler. Oklar daralan bölge göstermektedir. 10X objektif kullanılarak, 12 saat aralıklarla 5 gün time lapse dizisi seçilen Çerçeveler. Ölçek çubuğu 200 mikron karşılık gelir. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/Figure4.f4v" target="_blank">Şekil 4</a> :. orta tabanı CE hareketleri geçiyor ve düzleştirme Hareketli time-lapse dizisi yakınsaması ve 30 dakika aralıklarla seçilen kare ile Şekil 3&#39;te gösterilen duyusal epitel uzantısı gösteren Time-lapse animasyon.

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants at JoVE.com

Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Eldeki gelişimsel süreçleri on gün içinde bir zamansal degrade üzerinde çalışacak, çünkü embriyonik memeli Kokleanın Canlı görüntüleme zordur. Burada beş gün boyunca bir floresan raportör fare alınan embriyonik koklear eksplant doku görüntüleme sonra kültürleme ve için bir yöntem mevcut.

Fare Koklear Eksplantlarından uzun vadeli Time Lapse Görüntüleme

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K Görüntüleme.  Sunnybrook Research Institute.  Eldeki gelişimsel süreçleri on gün içinde bir zamansal degrade üzerinde çalışacak, çünkü embriyonik memeli Kokleanın Canlı görüntüleme zordur. Burada beş gün boyunca bir floresan raportör fare alınan embriyonik koklear eksplant doku görüntüleme sonra kültürleme ve için bir yöntem mevcut. 

Video: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Elektroporasyon tarafından Embriyonik Fare Koklear Eksplantlarından Kültür ve Gen Transferi

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Gelişim Biyolojisi

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

Epifluoresan ile Doku Matrix Bileşenler ve İki foton Mikroskopi uzun vadeli Intravital İmmünofloresan Görüntüleme

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

Biyomühendislik

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Fare Cochleae iç kulak doku mühendisliği için Decellularizing için bir iletişim kuralı

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET remain unknown. Electrophysiological studies of hair cells revealed that the MET channel has a large conductance and is permeable to relatively large fluorescent cationic molecules, including some styryl dyes and Texas Red-labeled aminoglycoside antibiotics. In this protocol, we describe a method to visualize and evaluate the uptake of fluorescent dextrans in hair cells of the organ of Corti explants that can be used to assay for functional MET channels. We found that 3 kDa Texas Red-labeled dextran specifically labels functional auditory hair cells after 1&#8211;2 h incubation. In particular, 3 kDa dextran labels the two shorter stereocilia rows and accumulates in the cell body in a diffuse pattern when functional MET channels are present. An additional vesicle-like pattern of labeling was observed in the cell body of hair cells and surrounding supporting cells. Our data suggest that 3 kDa Texas-Red dextran can be used to visualize and study two pathways for cellular dye uptake; a hair cell-specific entry route through functional MET channels and endocytosis, a pattern also available to larger dextran.

Here, we present a method for visualizing the uptake of 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditory hair cells with functional mechanotransduction channels. In addition, dextrans of 3&#8211;10 kDa can be used to study endocytosis in hair and supporting cells of the organ of Corti.

Canlı ve Fonksiyonel Murine Koklear Saç Hücrelerinde Dekstran Etiketleme ve Alımı

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

Yenidoğan Murin Koklear Explant Tekniği<em&gt; In vitro</em&gt; İşitme Araştırmalarında Tarama Aracı

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Tıp

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Yetişkin Farede Koklear Yüzey Hazırlama

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Nörobilim

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia that are arranged in rows of increasing height. When stereocilia are deflected, they tug on tiny (~5 nm in diameter) extracellular tip links interconnecting stereocilia, which convey forces to the mechanosensitive transduction channels. Although mechanotransduction has been studied in live hair cells for decades, the functionally important ultrastructural details of the mechanotransduction machinery at the tips of stereocilia (such as tip link dynamics or transduction-dependent stereocilia remodeling) can still be studied only in dead cells with electron microscopy. Theoretically, scanning probe techniques, such as atomic force microscopy, have enough resolution to visualize the surface of stereocilia. However, independent of imaging mode, even the slightest contact of the atomic force microscopy probe with the stereocilia bundle usually damages the bundle. Here we present a detailed protocol for the hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) imaging of live rodent auditory hair cells. This non-contact scanning probe technique allows time lapse imaging of the surface of live cells with a complex topography, like hair cells, with single nanometers resolution and without making physical contact with the sample. The HPICM uses an electrical current passing through the glass nanopipette to detect the cell surface in close vicinity to the pipette, while a 3D-positioning piezoelectric system scans the surface and generates its image. With HPICM, we were able to image stereocilia bundles and the links interconnecting stereocilia in live auditory hair cells for several hours without noticeable damage. We anticipate that the use of HPICM will allow direct exploration of ultrastructural changes in the stereocilia of live hair cells for better understanding of their function.

Here we present a protocol for the Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), a non-contact scanning probe technique that allows nanoscale imaging of stereocilia bundles in live auditory hair cells.

Canlı Memeli İşitsel Saç Hücrelerinde Nano ölçekli Çözünürlüğe Sahip Stereosilia Bundle Görüntüleme

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

Yaşlanan Kokleanın Işık Tabakası Floresan Mikroskobu ile Görüntülenmesi

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

İn vitro Model Olarak Tüm Yenidoğan Koklear Eksplantları

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...