Este protocolo incorpora uma abordagem simples para agilizar as etapas de cultivo, obtendo explantes de alta qualidade e contribuirá para explorar e desvendar mecanismos moleculares das células cocleares. A principal vantagem dessa técnica é o manuseio direto mínimo dos órgãos, coordenando as etapas de dissecção, o revestimento adequado da superfície do polímero, o volume médio otimizado e o tempo de fixação dos explantes. Esta técnica representa uma abordagem popular in vitro para o estudo da perda auditiva neurossensorial.
Isso pode ser usado para estabelecer modelos ototóxicos, realizar análises estruturais, avaliar vias de sinalização e realizar estudos de triagem de drogas. Em princípio, este método pode aplicar-se a diferentes explantes de tecidos. Ele também pode ser empregado em pesquisas do ouvido interno para obter informações sobre os estágios de desenvolvimento embrionário.
Para começar, coloque a cabeça do rato decapitado sobre a almofada estéril. Use tesoura e pinça para remover a mandíbula, depois levante a pele e descasque-a de volta do crânio. Coloque a pinça nas cavidades orbitárias para segurar o crânio.
Com uma lâmina afiada de bisturi, corte cuidadosamente o crânio ao longo da sutura sagital e, em seguida, a área de sutura coronal sem danificar a cóclea. Agora, remova o cérebro das duas metades do crânio. Sob o microscópio, localize a cóclea no osso temporal e solte o tecido circundante entre a cóclea e o osso temporal.
Em seguida, coloque a pinça no canal semicircular superior. Puxar suavemente o osso temporal para longe da cóclea e segurar a cóclea presa ao vestíbulo com o osso temporal. Insira as pontas da pinça na região do ápice, que é visível como uma linha branca, e remova a cápsula cartilaginosa da cóclea peça por peça para expor o ducto coclear.
Coloque as pinças sob a cóclea e as desprenda do órgão vestibular e do osso temporal. Transfira a cóclea para um novo prato de 60 milímetros contendo PBS gelado. Para isolar os órgãos do explante de Corti, segure o órgão na base e o ducto coclear na região do gancho basal e desanuvie suavemente o ducto coclear do modíolo sem rasgá-lo.
Em seguida, segure o ducto coclear na base e puxe o ligamento espiral e a estria vascular. Para o isolamento dos explantes cocleares, utilizar pinça para desprender o gânglio espiral da lâmina espiral óssea e desenrolar o modíolo durante o descolamento. Com pinças, segure a região do gancho e remova o ligamento espiral com a estria vascular.
Além disso, retire a membrana de Reissner peça por peça. Para transferir os explantes cocleares, mergulhe uma espátula de laboratório na placa que contém o explante. Levante o explante com as células ciliadas viradas para cima junto com alguns microlitros de PBS agitando uma espátula.
Coloque o explante em uma lâmina de câmara de oito poços, agitando suavemente a espátula no meio. Deixe o explante deslizar para dentro da câmara. Usando uma pipeta de 100 microlitros, retire 80 microlitros do meio e descarte-o.
Verifique a visibilidade das células ciliadas e das células neurais do gânglio espiral ao microscópio. Se necessário, use fórceps para afastar o tecido sobreposto. Retire o meio restante do poço.
O explante ficará agora mais plano na superfície da câmara. Após 10 segundos, pipetar de volta uma ou duas gotas do meio ao lado do explante, e o meio restante a alguma distância para evitar o desprendimento do explante. Certifique-se de que os explantes não se movam ao adicionar o meio.
Incubar a câmara por duas horas para fixar os órgãos firmemente ao fundo da câmara. Após a incubação, aspirar o meio. E usando uma pipeta de 100 ou 200 microlitros, adicione cuidadosamente 300 microlitros de meio completo fresco e pré-aquecido.
As imagens microscópicas confocais do disco giratório mostraram que os explantes do Órgão de Corti de ratos mantiveram sua estrutura e comprimento total em condições normais e estressadas. Além disso, um microscópio confocal de varredura demonstrou células ciliadas sobreviventes de explantes dos órgãos de camundongos, juntamente com células ciliadas em apoptose. O protocolo possibilitou o monitoramento de processadores biológicos em células cocleares vivas utilizando sondas permeáveis celulares apropriadas e microscópio confocal de disco giratório.
A cultura desses explantes cocleares favorece a análise da interação entre as células ciliadas e as células do gânglio espiral. As células ciliadas dos implantes cocleares foram detectadas com o marcador de células ciliadas, MYO7A. Da mesma forma, corpos celulares ganglionares espirais saudáveis e danificados e neuritos foram identificados usando o marcador neuronal, Tuj 1.
Na visão ampliada, os corpos celulares das células ciliadas marcadas com o anticorpo MYO7A eram visíveis. Estereocílios de células ciliadas externas e imagens descontorcidas de estereocílios de células ciliadas internas individuais marcados com faloidina foram identificados. Cuidados devem ser tomados durante os procedimentos sob o microscópio, especialmente ao separar o gânglio espiral da lâmina espiral óssea.
Os explantes intactos devem ser transferidos e alinhados com cuidado. Este protocolo otimizou estudos in vitro de explantes da orelha interna. Os resultados desses estudos, como vias de sinalização e toxicidade de drogas, podem guiar o desenho de estudos in vivo mais distantes.
