도움의 의견과 건설적인 조언을 세 익명의 검토에 대한 기술 지원을위한 윌리 일 박사 크리스 Gellynck을 부탁드립니다. 이 작품은 Sunnybrook 청각 재생 이니셔티브에 의해 투자되었다

마우스 조직을 유지 관리 및 실험 동물의 사용을 위해 동물 관리 지침에 캐나다위원회에 따라 안락사 쥐 12 -reporter SOX2 EGFP에서 수확했다. 1. 배양 배아 Cochleae <ol><li> DMEM 8.89 ml의 소 태아 혈청 1 ㎖ (FBS), 100 × N2 보충제 100 ㎕, 및 / ㎖ 시프로플록사신 10 ㎎의 10 μl를 혼합하여 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 보충. 100 % HEPES 5 ㎖와 함께 495 ㎖의 HBSS를 혼합하여 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS)을 보충. </li><li> 유리 바닥 배양 접시를 준비합니다 : <ol><li> 층류 후드에서 5 ㎖의 DMEM 200 ㎕의 막 대형 추출물 기판을 재현 탁. 10mm 우물에 35mm 직경의 유리 바닥 문화 요리를 준비합니다. 각 유리의 센터에 피펫 150 μL 기판 / DMEM는 접시를 바닥. 이들 접시는 40 분 인큐베이션 후에 사용되거나, CO (2)에 기록되어있다 </sub&gt; 적어도 일주일 동안 35 ° C에서 인큐베이터. 참고 : 요리의 기본은 투명하고 이미지에 적합 함을 보장하기 위해, 잘 외식 결국 쉽게 찾을 지역에 정착 할 수있는 요리의 중심에를 만들려면 유리 요리는 다음과 같은 이유로 사용되는 바닥 그래서 실험 후의 샘플을 면역 염색 이후의 분석을 위해 처리 될 수있다. </li></ol></li><li> 워크 스테이션 및 도구를 준비합니다 : <ol><li> 층류 클린 벤치를 켜고 깨끗한 작업 공간을 만들기 위해 70 % EtOH로 다운 스프레이. 70 % EtOH로에서 (에이전트 (1 부) 및 숯 분말 (2.5 g)을 경화 (184) 실리콘 엘라스토머 (10 부)의 혼합) 집게, 숟가락, 검은 184 실리콘 엘라스토머 요리를 만끽 해보세요. </li></ol></li><li> 깨끗한 워크 스테이션에서, 실험 수확 배아. 차가운 HBSS 1 % HEPES와 보충 얼음의 적절한 임신의 배아를 수집합니다. <ol><li> 시연 외부 또는 눈에 보이는 기관을 결정리포터 활성 및 형광 실체 현미경을 이용하여 배아를 조사. 실험 대상은 이들과 같은 1 % HEPES로 보충되어 차가운 HBSS 얼음 리포터 활성을 나타내는 배아를 수집. </li></ol></li><li> 시간적 뼈를 수집 : <ol><li> 멋진 광원 및 미세 집게를 사용하여 신속하게 작동, 새끼의 머리를 수집합니다. 시간적 뼈의 손상을 방지하려면 경추에서 턱 아래에 클립주의하십시오. </li><li> 조심스럽게 두개골을 엽니 다. 뇌를 제거 머리의 앞을 트림, 깨끗한 접시에 1 % HEPES와 보충 신선한 얼음 차가운 HBSS에 후방 두개골을 전송합니다. 조심스럽게 전술에 전정 시스템을 유지하기 위해주의하면서 땅콩 모양의 시간적 뼈를 해부. </li></ol></li><li> 달팽이관을 해부 : <ol><li> 차가운 HBSS 1 % HEPES와 보충 얼음에 검은 색 실리콘 엘라스토머 코팅 접시에 시간적 뼈를 이동시켜 뼈의 전정 부위를 고정. 에 곤충 핀을 삽입측두골을 안정시키고 집게를위한 공간을 만들기 위해 경사 각도. 측두골는 그것이 그대로 달팽이관을 수확하는 것은 매우 어렵다 너무 많이 이동시킨다 것처럼 피닝 공정에서 중요한 단계이다. </li><li> 조심스럽게 달팽이관을 둘러싸고있는 연골을 제거합니다. 달팽이관의베이스의 바깥 쪽 가장자리에있는 연골에 포셉 한 가지를 넣고 연골에 구멍을 클립. </li><li> , 측면 플랩을 클립 집게의 가지를 넣고 부드럽게 연골에서 덕트의 지붕을 분리합니다. 대각선 위쪽과 가로로 클립, 조심스럽게 캡슐의 앞 부분을 들어 올립니다. 나머지 연골과 덕트 사이에 집게의 단자를 삽입하고 부드럽게 마지막 부분을 클립. 달팽이관의 꼭대기의 표면은 지금 노출되어있다. </li><li> 기본에서 시작, 덕트의 지붕은 인공 와우 상피에 맞는 영역을 잡아 인공 와우 덕트를 엽니 다. 조심스럽게 트리밍, 지붕을 벗겨필요한 경우이를 완전히 제거 될 때까지. 덕트의 내측에 남아있는 멤브레인의 어떤 부분을 잘라냅니다. 초과 중간 엽 조직의 덕트를 청소하고 전정 시스템에서 덕트를 분리합니다. </li></ol></li><li> 문화 외식 : <ol><li> 신중하게, 기판 코팅 유리 바닥 배양 접시의 중앙에, 절편, 내강 표면이 위로 가게 모든 액체를 그리는 2 분 동안 둡니다. 그것을 방해하지 돌보는 DMEM 드롭 현명한 절편을 보충 150 μl를 추가합니다. 절편, 무료 떠 집게로 위치를 변경하지만, 기판에 부착 할 수 있도록 절편은 접시의 바닥에 침전 있음을주의해야한다. </li><li> 습도를 유지하기 위해 멸균의 작은 접시로, 깊이 12cm 직경 페트리 접시에 유리 바닥 요리를 놓습니다. 하룻밤 절편이 기판에 부착하고 평평하게하기 위해서는 35 ° C의 배양기에 문화를 넣습니다. </li></ol></li></ol> 2. 라이브 IMAGING <ol><li> 절편 샘플을 선택합니다. 각 외식 달팽이관의 상태를 평가하기 위해, 형광 실체 현미경을 사용한다. 덕트가 손상되지 및 삼각 형상에베이스에서 유리에 부착 된 경우에만 외식을 선택합니다. </li><li> 문화 인공 조직에 5 % CO 2와 35 ° C에서 인큐베이터를 설정합니다. 인큐베이터 현미경으로 문화를 넣어 : <ol><li> 조심스럽게 보충 DMEM을 대기음 적어도 500 μL 신선한 용지로 교체합니다. 육일까지 이미징, 1.5 ml를 더 좋다. 이식편이 느슨하게 부착되는 경우에, 접시의 가장자리 주위 미디어 링 피펫. 이 매트릭스에 부착 계속하면서 여분의 액체가 절편을 방해하지 않고 소형 &#39;가습 실&#39;을 만들 것입니다. <ol><li> 또한, 사용 시약 이미지 컬렉션 사이의 간격 동안 교환 할 필요가있는 경우 요리는 현미경에서의 피팅에 체류하는 동안 요리가 뚜껑을 엽니 다 커버 힌지. 힌지 접시 덮개는 덮개가 될 수 있도록샘플을 방해하거나 설정에서 요리를 제거하지 않고 열었다. 이 이후의 이미지 캡처에 대한 자신의 정확한 위치를 유지합니다. </li></ol></li><li> 샘플 접시 홀더에 적절한 샘플을 포함하는 유리 바닥 요리를 삽입합니다. 이 예에서 현미경 여덟 35mm 샘플 요리를 보유하고 회전 플랫폼을 가지고있다. </li><li> 층류 후드에서 유리 뚜껑 플라스틱 뚜껑을 교체하고 샘플 접시 홀더에 요리를 삽입합니다. 접시의 바닥에서 외식을 제거하거나 미디어를 방해하지 인큐베이터 돌보는 내부의 샘플 접시 홀더를 놓습니다. </li></ol></li><li> 영상 루틴을 설정합니다 : <ol><li> 현미경, UV 램프 및 카메라 스위치 및 이미징 소프트웨어를 엽니 다. </li><li> , 샘플을 찾아 순서대로 각각의 요리에 대한 노출 시간을, 이미징 영역을 선택 초점면과 조정합니다. 초점은 시작시 절편의보기에뿐만 아니라 따라 평면을 선택하지만, 알그래서 조직을 이동하는 방법과 시간 경과를 실행할 시간을 명심. </li><li> 형광 채널에서 선택된 초점면을 중심으로 Z 스택을 설정합니다. 실험의 샘플링 주파수와 길이를 설정합니다. 샘플링 주파수는 영상을 수집하는 데 걸리는 시간에 의해 제한되므로,이보기의 필드를 선택하고 Z 스택을 설정 한 후 결정되어야한다. 이 경우 샘플링 다섯 일 동안 30 분마다 일어난다. 실험 기간은 최대 14 일 수있다. </li></ol></li><li> 동영상을 생성합니다 : <ol><li> 시간 경과 기간의 끝에서 이미지 파일을 연다. 순차 수집 포인트를 열어이 경우 MetaMorph로부터 소프트웨어가 사용된다. 프레임별로 관심의 세포 인구를 표시하기위한 최적의 초점면을 선택합니다. </li><li> .avi 파일에 이러한 변환 이미지, 또는 여러 예측에 개방되고 분석 이미지 처리 소프트웨어 또는 전환 될 수있는 이미지 세트를 생성하는 몽타주로 내보낼영상 처리 소프트웨어를 사용하여 TS. </li></ol></li></ol>

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	<li>Wu, D. K., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+inner+ear+development.">Molecular mechanisms of inner ear development.</a> Cold Spring Harbor perspectives in biology. 4, (2012).</li><li>Shim, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+auditory+sensory+epithelium:+the+instrument+of+sound+perception.">The auditory sensory epithelium: the instrument of sound perception.</a> The international journal of biochemistry &amp; cell biology. 38, 1827-1833 (2006).</li><li>Van de Water, T., Ruben, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+the+inner+ear+in+organ+culture.">Growth of the inner ear in organ culture.</a> The Annals of otology, rhinology, and laryngology. 83, 1-16 (1974).</li><li>Jacques, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+function+for+canonical+Wnt/beta-catenin+signaling+in+the+developing+mammalian+cochlea.">A dual function for canonical Wnt/beta-catenin signaling in the developing mammalian cochlea.</a> Development. 139, 4395-4404 (2012).</li><li>Castellano-Munoz, M., Peng, A. W., Salles, F. T., Ricci, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Swept+field+laser+confocal+microscopy+for+enhanced+spatial+and+temporal+resolution+in+live-cell+imaging.+Microscopy+and+microanalysis+:+the+official+journal+of+Microscopy.">Swept field laser confocal microscopy for enhanced spatial and temporal resolution in live-cell imaging. Microscopy and microanalysis : the official journal of Microscopy.</a> Society of America, Microbeam Analysis Society, Microscopical Society of Canada. 18, 753-760 (2012).</li><li>Szarama, K. B., Gavara, N., Petralia, R. S., Chadwick, R. S., Kelley, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thyroid+hormone+increases+fibroblast+growth+factor+receptor+expression+and+disrupts+cell+mechanics+in+the+developing+organ+of+corti.">Thyroid hormone increases fibroblast growth factor receptor expression and disrupts cell mechanics in the developing organ of corti.</a> BMC developmental biology. 13, 6 (2013).</li><li>Appler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gata3+is+a+critical+regulator+of+cochlear+wiring.">Gata3 is a critical regulator of cochlear wiring.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 3679-3691 (2013).</li><li>Wibowo, I., Pinto-Teixeira, F., Satou, C., Higashijima, S., Lopez-Schier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalized+Notch+signaling+sustains+epithelial+mirror+symmetry.">Compartmentalized Notch signaling sustains epithelial mirror symmetry.</a> Development. 138, 1143-1152 (2011).</li><li>Hashimoto, S., Kato, N., Saeki, K., Morimoto, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+high-potential+embryos+by+culture+in+poly(dimethylsiloxane)+microwells+and+time-lapse+imaging.">Selection of high-potential embryos by culture in poly(dimethylsiloxane) microwells and time-lapse imaging.</a> Fertility and sterility. 97, 332-337 (2012).</li><li>Matsuoka, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology-based+prediction+of+osteogenic+differentiation+potential+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Morphology-based prediction of osteogenic differentiation potential of human mesenchymal stem cells.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Ma, G. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

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문화가 설립 장기 이미징 위해 시간 경과 현미경을 설정하는 경우 고려해야 할 몇 가지 기술적 인 점이있다. 우리는 인공 이식편을 배양 기재로서 기저막 매트릭스를 사용하지만, 기판은 세포 유형에 매칭되어야한다. 예를 들어, 이미지의 연결을 문화, 그것은 피브로넥틴 코팅을 제공하는 것이 더 좋을 수도있다. 항온 처리 온도 및 가스 조성은 또한 조직의 종류에 따라 선택되어야한다. 절편의 나이를 선택하는 것이 중요합니다. E12에 성장의 방향이 예측하기 때문에 우리는 초기에 E13에 시작합니다. 이 절편이 기판에 부착 하룻밤 배양하는 것이 필수적이므로, 실험 다음 날 시작하는 계획해야합니다. 실험 E15 또는 오래된 시작하는 경우, 배양 조직 평면화 등 셀 상에 쉽게 확산 시간 경과로 E13 설립되어야한다 (도 3 참조). </p&gt; 코르티 기관이 이미징 될 경우, 달팽이관은 매우 조심스럽게 해부 것이 필수적이다. 절편의 측면 가장자리에 닉스는 달팽이관보기에서 관심 영역을 이동할 수 있습니다 protrusion.This 돌기 모양의 &#39;V&#39;를 형성 눈물을 통해, 세포의 유출을 &#39;형태 재 배열을 거쳐 따라서 때, 조직의 내부 긴장을 깰 . 또한, 치료는 가능한 내측부에 덕트의 지붕만큼 제거주의해야한다. 이 조직 절편이 확대보기에서을 왜곡 관심 영역의 맨 위에 성장할 수로 확산하고 있습니다. 영상 루틴을 설정하는 경우, 달팽이관의 형태의 성장과 변화는 신중하게 고려되어야한다. 목표는 영역의 크기에 묘화 될뿐만 아니라, 그 영역을 이동하거나 확대할지 고려 기초하여 선택되어야한다. 내측부의 셀그래서 고배율 (20X, 40X, 60X) 사용될 수 달팽이관 (도 1, 2) 분할 및 한정된 영역 내에서 이동의. 이식편의 성장에 따라 코르티 또는 횡 상피의 장기 세포 그러나 이동할 것이다; 세포가 시야에 남아 가능성이 높은만큼 낮은 배율 (10 배 또는 20 배)이 더 좋다. 달팽이관의 고정 된 지역의 영상은 높은 배율로 이용 가능합니다. 우리는 전체 이식편을 표시하고 싶다고 때문에 대표적인 결과 섹션 10X 목적을 사용하기로하고, 조직 운동이 초기 단계에서 동적이기 때문이다. 고려 다음에 포커스의 평면이다. 이식편 바깥쪽으로 성장하고 평탄화 것으로 볼 때, 초점면이 시간 경과에 걸쳐 극적으로 변화 할 가능성이있다. 관심 영역은 코르티 나 측면 상피의 기관이를 기대하고 도울 수있는 절편에서 마이그레이션하는 세포에 초점이됩니다. 이 알 것입니다그래서 낮은 배율의 대물 렌즈를 사용하기위한 인수. 그것은 형광 및 DIC 모두 Z 스택을 설정할 수 있습니다. 관심있는 세포는 마지막 단계는 상기 커버 글래스의 평면에 경우에는 특히, 이에 대응 가능 단계 3-5 ㎛의 Z 스택을 설정, 초점이 이동할 가능성이있는 경우. 그것은 세포의 포장의 밀도로, 첫날에 문화를 볼 때 올바른 평면을 선택하기 어려울과 밝은 전망을 방지 할 수 있습니다 주변 조직에서 빛을 반사 할 수 있습니다. 나중에 영화 또는 몽타주를 생성하는 프레임을 검토 할 때, Z 플레인의 신중한 선택은 입체적으로 세포의 움직임을 추적 할 수있다. 실험 시료가 범위를 벗어나 이동하는 경우, 포커스 설정을 조정하기 위해 모든 시점에서 일시 정지 될 수있다. 일주일 이상 인공 절편의 라이브 영상은 공 초점 라이브 영상을 보완 달팽이관의 개발을 이해에 새로운 차원을 추가합니다. 이 넓은 긴 장기 사용 할 수있는 좋은 방법입니다-TERM 검사가 필요하지만 단기적으로 단일 세포 연구에 대한 높은 배율 공 초점 이미지를 대체하지 않습니다. 기술의 선택은 묘화 될 조직의 형태 및 실험의 문맥에 의존한다. 이 기술은 연구자 실시간 리포터 유전자 발현, 세포 증식 및 이동의 시공간적 변화를 검사 이전에 가능한 것보다 더 많은 세부 사항에서 세포 약제과 생존에 리포터 유전자 반응 연구를 허용하도록 허용 할 것이다.

포유류 달팽이관 주문한 높은 복잡한 기관이다. 마우스에서 출생 초기 단계에서 귀의 날 E11에 소포 및 개발 프로그램의 완성에서 원시적 인 내이의 출현 사이에, 세포 신호의 여러 파도와 유전자 발현 조정 변화가 일어난다. 인공 와우 덕트의 삼각 형상에베이스에서 실행하면 코르티 감각 상피, 또는 기관을 검출하는 소리입니다. 코르티 기관의 발전 절묘하게 개발 단부함으로써, 내측 유모 세포의 단일 행으로 구성된다되도록 제어되는, 외부 모세포 3 열의는지지 세포의 다섯 열 (기둥 셀의 두 행, 세 산재 Deiters &#39;셀의 행) 1. , 청력 손실을 기원하고 감각 epithemlium 2의 패턴이 적힌 studye의 중요성을 heighlighting이 정확한 순서로 결과에서 편차. 배아 마우스 COCH의 체외 배양에서레아는 코르티 기관의 발전의 메커니즘을 연구에 필수적인 도구입니다. 이 기술은 1974 년에 설립되었으며, 지난 40 년 동안, 감각 상피 지정 및 코르티 기관 (3)을 설립하는 메커니즘의 많은 것을 해명하는 데 사용되었습니다. 달팽이관은 동적 발달 과정과 복잡한 기관이다; 칠일 1 명시하는 등의 조작은 오래 걸릴 수 있습니다. E13에 인공 이식편 배양에 GSK 3β의 억제제를 추가 할 때 예를 들어, 최적의 잠복기는 화합물의 강력한 효과 육일 4 관찰. 개발 달팽이관의 라이브 영상은 코르티 기관의 형태의 변화로 조사를 할 수 있습니다, 유전자 발현의 변화, 이주의 추적 증식 또는 세포를 죽어가는, 그리고 실시간 제약 에이전트의 결과 관찰 및 신호의 중단을 할 수 있습니다 경로. 지금까지 달팽이관의 영상을 살고주로 단시간 5-8 위에 코르티 기관의 화상 작은 영역에 공 초점 현미경을 사용하여 수행하지만,이 기술은 이식편 생존력으로 인해 한계가있다. 느린 발달 과정에 장기간 조작의 효과의 촬상에서는, 촬상 환경이 매우 중요하다. 일반적으로 공 촛점 라이브 영상 시스템은 현미경에 앉는 가습 플라스틱 상자를 사용한다. 열 및 습도는 대물 또는 광원으로는 힌지 결합 된 개구를 통해 상기 microscope-의 다양한 부분 주위에 갭을 통해, 상기 액세스 창을 통해, 현미경 테이블을 충족 배양 상자의 간극을 통해 빠져 나갈 수. 이 이상의 2-3 일 건강한 이식편을 유지하기위한 최적이 아니다. 우리는 표준 CO 2 인큐베이터 안에 봉인 거꾸로 현미경보다는 현미경 중심으로 인큐베이터 &#39;인큐베이터 현미경&#39;을 정의합니다. 인큐베이터 현미경 전실험의 수명 경향 오히려 2-3 일 이상 촬상보다는 샘플 최대 2 주 동안 묘화 될 수 있도록. 인큐베이터 현미경은 문화와 표준 제어 조건을 절편하기 위해 최소한의 방해로, 세포의 성장과 분화를위한 훌륭한 환경을 제공합니다. 여러 날에 걸쳐 수행 될 연구에서는 인큐베이터에서 제거하고 거꾸로 형광 현미경을 수행하여 매일 영상 샘플에 의존하는 것이 일반적이다. 이 방법을 사용할 수 있지만, 인큐베이터에서 요리를 제거하면 민감한 개발 조직에 스트레스를 입 힙니다. 때문에 인큐베이터에서 제거에 온도에서 배양 매체와 변동 산도의 변화는 차선의 개발과 건강하지 못한 조직이 발생할 수 있습니다. 동일한 초점 평면에서 모든 시점에서 동일한 방향으로 동일한 영역을 이미징하는 것은 매우 어려운 것이다. 인큐베이터 내에서 자동화 된 시스템을 사용함으로써, 건강하게 유지할 수있다티슈는 더 시점에서 영상을 수집하고 동일한 영역이 매 프레임에서 캡처되도록. 최근에는 여러 개의 집적 현미경 조직 인큐베이터가 개발되어 임상 적으로 이들 9뿐만 아니라 줄기 세포 연구 및 암 (10,11)에서뿐만 아니라 유용했을. 여기에서 우리는 배아 마우스 와우 외식의 장기간의 라이브 영상을위한 프로토콜을 제시한다. 우리가 설정된 시점에서 다중 샘플의 이미지를 캡쳐하기위한 능력을 가진 표준 CO 2 인큐베이터 안에 자동화 현미경 시스템을 사용한다. 이 시스템은 인큐베이터 안에 설정 거꾸로 현미경으로 구성되어 있습니다. 샘플은 각 시점에서 다중 샘플의 이미징을 허용 회전 단상에 위치한다. 조명, 촬영, 및 연단의 회전 MetaMorph로부터 소프트웨어를 통해 운영 시스템에 의해 자동 제어된다. 운영 소프트웨어를 이용하여 촬상 루틴을 설정함으로써, 우리는 TW까지 동안 작동 실험을 설정할 수간섭을 최소한으로 줄이고 O 주. 이 예에서 우리는 특별히 큰 규모의 성장과 달팽이관의 재 배열하고, prosensory 영역을 보여 모두 시야 및 형광을 사용합니다. 이 실험에서, cochleae는. 배아 일 E13에 SOX2 EGFP 리포터 생쥐 해부한다 체외 배양이 설정됩니다 다음 오일을 통해 몇 군데.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle media</td><td>Gibco</td><td>12430</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>Basement membrane extract&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers.&lt;br/&gt; http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>5630080</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>100 x N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution</td><td>Gibco</td><td>14170161</td><td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use.&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&amp;amp;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>Size number 5&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&amp;amp;CategoryId=29</td></tr><tr><td>Curette&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10080-05</td><td>size 1 mm&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&amp;amp;CategoryId=118</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-35</td><td>Must be stainless Steel&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td></tr><tr><td>50 mm plastic dishes</td><td>Corning/Falcon</td><td>351006</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>charcoal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05105-250G</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>184 silicone elastomer</td><td>Dow/Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dishes are home made several weeks in advance.&amp;nbsp; Silicone elastomer can be from any supplier.&lt;a href=&quot;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&quot;&gt;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&amp;nbsp; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL.&lt;br/&gt; http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&amp;amp;cPath= 1_4_15&amp;amp;products_id=2</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>495101-9804-000</td><td>&amp;nbsp;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td></tr><tr><td>Cold Light Source</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-182</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td></tr><tr><td>Fluorescent Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Leica microsystems</td><td>Contact Leica microsystems</td><td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td></tr><tr><td>Incubator Microscope +imaging software</td><td>Olympus</td><td>Contact Olympus</td><td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software.&lt;br/&gt; http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&amp;amp;c=0</td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Thermo Scientific</td><td>51029701</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3310</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td></tr><tr><td>Laminar Flow hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026651</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td></tr></tbody></table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

여기에서 우리는 살아있는 배아 마우스 와우 외식의 장기 시간 경과 이미징을위한 방법을 제시한다. 약 10 일 동안 포유류의 달팽이관 진행의 높은 주문, 복잡한 구조를 구축하기위한 책임을 발달 프로그램. 이 기간 동안 유전자 발현의 변화 및 ​​약제 학적 또는 유전자 조작에 대한 반응을 연구하기 위하여, 장기간의 영상이 필요하다. 이전에는, 라이브 영상은 전형적 표준 현미경 꼭대기 가습 실 내에 이식 된 조직의 생존 능력에 의해 제한되었다. 습도와 온도에 관해서는 배양 성장을위한 최적의 조건을 유지하는데 어려움 이미징 실험의 길이에 제한을 두었다. 수정 된 조직 문화 인큐베이터에 통합 현미경 장기-라이브 영상을위한 훌륭한 환경을 제공합니다. 이 방법에서 우리는 배아 마우스 와우 외식을 설정하는 방법과 시간 경과 imagi를 수행하는 인큐베이터 현미경을 사용하는 방법을 보여잉 오일 위에 전형적인 배아 일 (E) (13)와 인공 이식편 SOX2, 달팽이관의 prosensory 세포 마커의 거동을 조사 시야와 형광 현미경을 모두 사용.

여기에서 우리는 몽타주 (그림 1)과 E13.5에 도금하는 경우 일반의 Organotypic 인공 절편이 성장하는 방법을 보여주는 동영상 (그림 2)를 보여줍니다. SOX2 리포터 마우스 prosensory 영역을 시각화하는데 사용되었다. 영화는 달팽이관이 성장과 통합 및 확장을 겪는 것으로 보여, 녹색 SOX2 도메인의 측면 지역에서 세포는 확장 주변 조직으로 분할하지 않는 것. 이 코르티 기관의 특성; E13에 미래 감각 상피 세포주기를 종료하고 이후 비확산 (13)의 영역으로 알려져있다. 다른 인공 이식편의 중간베이스 (도 3 및 4)의 연장으로서, prosensory 영역이 좁아 것을 증명 중심 초 저속 실험. 배양 세 일 후에 조직이 개성 미친를 시각화 할 수 있다는 등의 상당히 평평 것을 유의이중 형광 세포, 처음에 의한 조직 두께 광의 내부 반사가 가능한 표현의 영역이지만 개별없는 셀을 식별 할 영역이있는 반면. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1 :. 시간 - 5 일 동안 수집 SOX2 기자 인공 조직의 경과 이미지는이 몽타주는 절편 성장이 날 제로에서 시작하고 10 배 목표를 사용하여 30 분마다 샘플링, 5 일째에 종료의 진행 상황을 보여줍니다. 절편은 E13 설립 및 이미징 전에 하룻밤 배양 하였다. 이식편 그것을 성숙 모두 성장하고 수렴 확장 움직임을 겪는다. 12 시간 간격으로 인공 성장의 정도를 나타내는 (A) 순차 이미지. 가시 광선 채널은 GFP 형광 유전자와 겹쳐EGFP SOX2 기자에 의해 평가. (B) GFP의 형광 채널 만. 스케일 바는 200 μm의에 해당합니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/Figure2.f4v" target="_blank">그림 2</a> :. 오일에 걸쳐 수집 SOX2 기자 인공 조직의 시간 경과 애니메이션이 그림 1의 같은 절편 실험이며,이 시간 프레임 5 일 동안 30 분 간격으로 선택을 생성하는 .AVI 파일로 결합 영화. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" width="500" /> 그림 3 :. 미드베이스 CE 운동을 진행하고 평평 Sequenti중반베이스의 prosensory 상피 (EGFP)를, 좁아 확장 및 오일의 과정을 통해 평평하게 보여주는 등 이미지. 화살표는 좁아 지역을 나타냅니다. 10 배 목표를 사용하여 12 시간 간격으로 5 일간의 시간 경과 순서에서 선택된 프레임. 스케일 바는 200 μm의에 해당합니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/Figure4.f4v" target="_blank">그림 4</a> :. 중반 기본 CE 운동을 진행하고 평평 애니메이션 시간 경과 순서가 수렴하고 30 분 간격으로 선택한 프레임과 그림 3의 감각 상피의 확장을 보여주는 시간 경과 애니메이션.

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다.

마우스 인공 와우의 Explants의 장기 시간 경과 영상

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

long-term-time-lapse-imaging-of-mouse-cochlear-explants

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K 조회수.  Sunnybrook Research Institute.  손의 발달 과정 10 일 임시 그라데이션에서 작동하기 때문에 배아 포유류의 달팽이관의 라이브 영상은 도전이다. 여기에서 우리는 오일을 통해 형광 기자 마우스에서 촬영 배아 인공 절편 조직을 이미징 한 후 배양 및 방법을 제시한다. 

비디오: Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

Electroporation에 의한 배아 마우스 달팽이의 Explants의 문화 유전자 전송

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

연구

발생학

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

표면 형광을 가진 조직 매트릭스 구성 요소 및 두 개의 광자 현미경의 장기의 intravital 면역 형광 이미징

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

생체공학

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

내가 조직 공학에 대 한 마우스 Cochleae Decellularizing에 대 한 프로토콜

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET remain unknown. Electrophysiological studies of hair cells revealed that the MET channel has a large conductance and is permeable to relatively large fluorescent cationic molecules, including some styryl dyes and Texas Red-labeled aminoglycoside antibiotics. In this protocol, we describe a method to visualize and evaluate the uptake of fluorescent dextrans in hair cells of the organ of Corti explants that can be used to assay for functional MET channels. We found that 3 kDa Texas Red-labeled dextran specifically labels functional auditory hair cells after 1&#8211;2 h incubation. In particular, 3 kDa dextran labels the two shorter stereocilia rows and accumulates in the cell body in a diffuse pattern when functional MET channels are present. An additional vesicle-like pattern of labeling was observed in the cell body of hair cells and surrounding supporting cells. Our data suggest that 3 kDa Texas-Red dextran can be used to visualize and study two pathways for cellular dye uptake; a hair cell-specific entry route through functional MET channels and endocytosis, a pattern also available to larger dextran.

Here, we present a method for visualizing the uptake of 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditory hair cells with functional mechanotransduction channels. In addition, dextrans of 3&#8211;10 kDa can be used to study endocytosis in hair and supporting cells of the organ of Corti.

라이브 및 기능성 뮤린 달팽이관 모발 세포의 덱젠 라벨링 및 섭취량

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

신생아 쥐의 달팽이관 Explant 기법으로<em&gt; 체외에서</em&gt; 청력 연구의 스크리닝 도구

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

의학

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

성인 마우스의 달팽이관 표면 준비

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

신경과학

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia that are arranged in rows of increasing height. When stereocilia are deflected, they tug on tiny (~5 nm in diameter) extracellular tip links interconnecting stereocilia, which convey forces to the mechanosensitive transduction channels. Although mechanotransduction has been studied in live hair cells for decades, the functionally important ultrastructural details of the mechanotransduction machinery at the tips of stereocilia (such as tip link dynamics or transduction-dependent stereocilia remodeling) can still be studied only in dead cells with electron microscopy. Theoretically, scanning probe techniques, such as atomic force microscopy, have enough resolution to visualize the surface of stereocilia. However, independent of imaging mode, even the slightest contact of the atomic force microscopy probe with the stereocilia bundle usually damages the bundle. Here we present a detailed protocol for the hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) imaging of live rodent auditory hair cells. This non-contact scanning probe technique allows time lapse imaging of the surface of live cells with a complex topography, like hair cells, with single nanometers resolution and without making physical contact with the sample. The HPICM uses an electrical current passing through the glass nanopipette to detect the cell surface in close vicinity to the pipette, while a 3D-positioning piezoelectric system scans the surface and generates its image. With HPICM, we were able to image stereocilia bundles and the links interconnecting stereocilia in live auditory hair cells for several hours without noticeable damage. We anticipate that the use of HPICM will allow direct exploration of ultrastructural changes in the stereocilia of live hair cells for better understanding of their function.

Here we present a protocol for the Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), a non-contact scanning probe technique that allows nanoscale imaging of stereocilia bundles in live auditory hair cells.

살아있는 포유류 청각 머리 세포에 있는 나노 규모 해상도를 가진 스테레오실리모들 화상 진찰

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

코르티 의 장기를 향해 세포 마이그레이션을 탐구하는 체외 시간 경과 라이브 세포 이미징

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

광시트 형광 현미경을 이용한 노화된 달팽이관 이미징

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

체외 모델로서의 전체 신생아 인공와우 이식

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...