有益なコメントとその建設的な助言のための3つの匿名査読のために技術支援のためのウィリー日博士とクリスGellynckに感謝します。この作業は、サニーブルック聴覚回生イニシアチブによって資金を供給された

マウス組織をマウス12実験動物のケアと使用のための動物実験ガイドラインにカナダ人評議会に従って維持し、安楽死させ-reporter Sox2のEGFPから収穫した。 1.培養胚蝸牛<ol><li> 、DMEMを8.89ミリリットルを混合することにより、ウシ胎児血清（FBS）、100×N2サプリメントを100μl、及び10mg / mlのシプロフロキサシンの10μlを1mlのをダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を補う。 100％HEPES 5mlで495ミリリットルHBSSを混合することにより、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）を補う。 </li><li>ガラス底の培養皿を準備します。 <ol><li>層流フード中で5mlのDMEM中の200μlの基底膜抽出物の基質を懸濁する。 10ミリメートルウェルを有する35mm直径のガラス底の培養皿を準備します。各ガラスの中心にピペット150μlの基質/ DMEMを皿の底。これらの皿は、40分間のインキュベーションの後に使用することができ、またはCO 2に格納することができ</sub&gt;少なくとも1週間35℃でインキュベーター。 注：ガラスの皿を、以下の理由のために使用される底：外植片を容易に位置する領域に定着することができ、皿の中心にうまくを作成するために、皿の底が透明およびイメージングに適していることを確実にするために、最終的に実験後、試料を免疫染色し、その後の分析のために処理することができるので。 </li></ol></li><li>ワークステーションやツールを準備します。 <ol><li>層流クリーンベンチをオンにし、清潔な作業スペースを作成するために70％エタノールでダウンスプレー。 70％EtOH中（エージェント（1部）と木炭粉末（2.5グラム）を硬化、184シリコーンエラストマーのミックス（10部））ピンセット、スプーン、黒184シリコーンエラストマー皿を浸す。 </li></ol></li><li>クリーンなワークステーションでは、実験用の収穫の胚。冷HBSS 1％HEPESを補充した氷の中の適切な妊娠の胚を収集します。 <ol><li>デモンストレーションを行います外部または可視臓器を決定レポーター活性、蛍光実体顕微鏡を用いて、胚を調べます。氷冷HBSSにおけるレポーター活性を示す胚を集めるこれらは実験の対象であるとして、1％HEPESを補充した。 </li></ol></li><li>頭骨を収集します。 <ol><li>クールな光源と細かい鉗子を用いて、迅速に作業し、子犬の頭を収集する。頭骨の損傷を避けるために頸椎時および顎の下にクリップするように注意してください。 </li><li>慎重に頭蓋骨を開きます。脳を外し頭の前部を切り落とす、ときれいな皿に、1％HEPESを補充した新鮮氷冷HBSSに後部頭蓋骨を転送する。慎重にタクトで前庭系を保つように注意しながらピーナッツ形の頭骨を解剖する。 </li></ol></li><li>蝸牛を解剖： <ol><li>氷冷HBSS中で料理をコーティングした黒色のシリコーンエラストマーに頭骨を転送骨の前庭地域をピン、1％HEPESを補充した。で虫ピンを挿入します頭骨を安定させ、鉗子のための部屋を作成するために斜めの角度。頭骨は、それが無傷蝸牛を収穫することは非常に困難であまり移動させることができるかのようにピン止めは、プロセスにおける重要なステップである。 </li><li>慎重に蝸牛周囲の軟骨を取り除く。蝸牛の基部の外縁に軟骨に鉗子の1タインを挿入し、軟骨に穴をクリップ。 </li><li> 、サイドアップフラップをクリップ鉗子の歯を差し込んで、静かに軟骨からダクトの屋根を区切る。上部に水平にクリップや斜めに、そして慎重にカプセルの前部を持ち上げ。残りの軟骨とダクトとの間に鉗子の突起を差し込んで、静かに最後のセクションをオフにクリップ。蝸牛の頂端面は現在公開されます。 </li><li> baseから始まり、ダクトの屋根が蝸牛上皮を満たしているエリアをキャッチし、蝸牛管を開きます。優しくトリミング、屋根をはがし必要な場合、それが完全に除去されるまで。ダクトの内側に残された膜の任意の部分を切り落とす。過剰間葉組織のダクトを清掃し、前庭系からダクトを取り外してください。 </li></ol></li><li>文化植片： <ol><li>慎重に液体のすべてをオフに描き、2分間のまま、基板コーティングされたガラス底の培養皿の中央に、外植片、管腔側表面を上にして置きます。 DMEMを滴下外植片に、それを邪魔しないように注意しながら補足し150μlのを追加します。外植片は、無料のフロート鉗子で再配置するが、それは基板に取り付けることができるように、外植片は皿の底に落ち着くことに注意する必要があります。 </li><li>湿度を維持するための滅菌水小皿で、深い直径12cmシャーレにガラスボトムディッシュを置きます。外植片が基板に付着し平坦化するために、一晩、35℃のインキュベーターにで文化を置く。 </li></ol></li></ol> 2.ライブ画像の再生ING <ol><li>外植片のサンプルを選択します。各外植蝸牛の状態を評価するために、蛍光立体顕微鏡を使用してください。ダクトは無傷で、ベースから頂点にガラスに付着している外植片をのみを選択します。 </li><li>文化蝸牛組織への5％のCO 2で35℃のインキュベーターを設定します。インキュベーター顕微鏡に文化を置く： <ol><li>優しく補充されたDMEMをオフに吸引し、少なくとも500μlの新鮮な培地と交換してください。 6日までイメージングするために、1〜1.5ミリリットルが良いです。外植片が緩く接続されているケースでは、皿の縁の周りのメディアの輪​​をピペット。この余分な液体は、それがマトリックスにアタッチし続けている間に外植片を乱すことなく、ミニチュアの「加湿チャンバー」を行います。 <ol><li>別の方法として、使用は試薬が画像コレクションの間隔の間に交換する必要がある場合に、皿を顕微鏡でのフィッティングに留まりながら、料理は蓋を開くためにカバーしてヒンジ付き。ヒンジ付きの皿カバーは蓋をすることを可能にするサンプルを乱すか、その設定から食器を削除せずにオープンしました。これは、次の画像キャプチャの彼らの正確な位置を維持しています。 </li></ol></li><li>試料皿ホルダーに適切なサンプルを含むガラスボトムディッシュを挿入します。この例では、顕微鏡は8 35mmのサンプル皿を保持している回転台を持っています。 </li><li>層流フードの下にガラス蓋付きのプラスチックの蓋を交換し、試料皿ホルダーに料理を挿入します。皿の底から外植片を取り除くために、またはメディアを乱さないように注意しながらインキュベーター内部の試料皿ホルダーを置きます。 </li></ol></li><li>イメージング·ルーチンを設定します。 <ol><li>顕微鏡、UVランプとカメラに切り替え、イメージングソフトウェアを開きます。 </li><li>試料の位置を確認し、シーケンス内の各ディッシュの露光時間を、撮像エリアを選ぶ焦点面と調整。始動時の外植片の観点だけでなく応じて焦点面を選択しますが、アルそう、組織がどのように移動するかを念頭にしてどのくらいの時間経過が実行されます。 </li><li>蛍光チャネルで選択された焦点面を中心に、Zスタックを設定します。実験のためのサンプリングの頻度と長さを設定します。サンプリング周波数は、画像を収集するのにかかる時間によって制限されるので、これは視野を選択し、Zスタックを設定した後に決定されるべきである。この場合、サンプリングは5日間にわたり30分毎に行われます。実験期間は14日間までであることができる。 </li></ol></li><li>ムービーを生成します。 <ol><li>時間の経過期間の終了時にイメージファイルを開く。逐次収集ポイントをオープンする。この場合、MetaMorphソフトウェアを使用する。フレームごとに、関心のある細胞集団を示すための最良の焦点面を選択します。 </li><li> .aviファイルにこれらの画像を変換する、または複数のフォーマに開放し、分析する画像処理ソフトウェアで、または変換することができる一連の画像を生成するために、モンタージュとして書き出すビデオ処理ソフトウェアを使用してtsが。 </li></ol></li></ol>

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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al.Transforming+growth+factor-beta1+and+-beta2+in+gastric+precancer+and+cancer+and+roles+in+tumor-cell+interactions+with+peripheral+blood+mononuclear+cells+in+vitro.">et al.Transforming growth factor-beta1 and -beta2 in gastric precancer and cancer and roles in tumor-cell interactions with peripheral blood mononuclear cells in vitro.</a> PloS one. 8, (2013).</li><li>Taranova, O. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SOX2+is+a+dose-dependent+regulator+of+retinal+neural+progenitor+competence.">SOX2 is a dose-dependent regulator of retinal neural progenitor competence.</a> Genes &amp; development. 20, 1187-1202 (2006).</li><li>Chen, P., Segil, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27(Kip1)+links+cell+proliferation+to+morphogenesis+in+the+developing+organ+of+Corti.">p27(Kip1) links cell proliferation to morphogenesis in the developing organ of Corti.</a> Development. , 1581-1590 (1999).</li></ol>

著者らは、開示することは何もない。

培養物を確立し、長期的画像化するためにタイムラプス顕微鏡を設定する際にされているときに考慮すべきいくつかの技術的なポイントがある。 我々は、蝸牛外植片を培養するための基質として基底膜マトリックスを使用するが、基質は、細胞型に適合させるべきである。例えば、画像ニューロン培養物には、フィブロネクチンのコーティングを提供することが望ましい場合がある。インキュベーション温度およびガス組成物はまた、組織の種類に応じて選択すべきである。外植片の年齢を選択することが重要です。 E12に成長の方向が予測しにくいですので、私たちは、早ければE13に開始します。それは外植片を基板に取り付けるために一晩培養することが不可欠であるとして、実験は次の日を開始するために計画する必要があります。実験はE15または古い開始する場合、培養物をE13に確立されるべき組織を平らにし、経時的に広がるように、細胞を画像に容易である（ 図3参照）。 </p&gt; コルチ器官が撮像される場合は、蝸牛を非常に慎重に解剖されることが重要である。外植片の側縁でニックスは、組織の内部張力を破る、蝸牛は形態的再配列を受けたとき、したがって、「V」字型protrusion.This突起を形成し、涙を通して細胞の流出は、「ビューの外に関心領域を移動することができます。さらに、ケアはできるだけ内側にダクトの屋根の多くを取り除くように注意しなければならない。この組織は、外植片が膨張して視界からそれを曖昧にすることを目的の領域の上に成長することができますように増殖し続けている。 イメージング·ルーチンを設定するときは、蝸牛の形態の成長と変化を慎重に考慮しなければなりません。目的は、撮像すべき領域の大きさだけでなく基づいてではなく、その領域を移動または拡大するかどうかを考慮して選択すべきである。内側領域での細胞蝸牛（ 図1および2）の分割及び制限された領域内を移動するので、高倍率（20X、40X、60X）を用いることができる。外植片が成長するにつれてコルチ器官又は横上皮の細胞は、しかし、移動します。細胞が視野内に残る可能性が高くなっているように低倍率（10倍または20倍）が、優れている。蝸牛の定常領域をイメージングは​​、高倍率で可能です。我々は全体の外植片を表示することを望んだので、代表的な結果のセクションで10倍対物レンズを使用することを選択し、および組織運動は、初期段階での動的であるため。 次に考慮すべき焦点面である。外植片が外側に成長し、平坦化することを考慮すると、焦点面が時間経過にわたって劇的に変化する可能性がある。関心領域はコルティ又は横上皮の器官である場合は、これを先取りし、外植片から遊走する細胞に焦点を当てたことは助けることができます。これはアルですそう低倍率の目標を使用するための引数。これは、蛍光およびDICの両方のZスタックを設定することが可能である。目的の細胞の焦点が外れて移動する可能性がある場合は、ステップあたり3~5ミクロンのZスタックをセットアップする最後のステップは、カバーガラスの面内にある場合は特に、これに対抗することができる。周囲組織からの細胞と反射光の充填密度がクリアな視界を防ぐことができるように、それは、初日の培養物を表示するときに、正しい面を選択することは困難である。後で映画やモンタージュを生成するために、フレームを確認するときは、Z平面の注意深い選択は​​、3次元での細胞運動の追跡を可能にする。実験は、試料が範囲外に移動した場合、フォーカスの設定を調整するために任意の時点で一時停止することができる。 週にわたる蝸牛外​​植片のライブイメージングは​​、共焦点ライブイメージングを補完する蝸牛の開発を理解するための新たな次元を追加します。これはオルガン広い長い使用するための優れた方法である-term検査が必要であるが、短期的に単一細胞研究のための高倍率の共焦点イメージングを置き換えることはありません。技術の選択は、画像化される組織の種類および実験の文脈に依存している。この技術は、研究者がリアルタイムでレポーター遺伝子発現、細胞増殖および遊走の時空間変化を調べ、薬剤及び従来よりもより詳細に細胞の生存にレポーター遺伝子応答の研究を可能にすることを可能にする。

哺乳類の蝸牛は非常に規則正しい複雑な器官である。出生後早期の段階での日に耳胞からプリミティブ内耳の出現E11と発達プログラムの完了との間に、マウスでは、細胞のシグナル伝達および遺伝子発現の協調変化の複数の波が起こる。ベースから蝸牛管の頂点に実行すると、感覚上皮を検出する音、またはコルチ器官である。コルチ器官の開発は絶妙開発の終わりまでには、内有毛細胞の単一の行で構成されように制御され、外有毛細胞の3つの行は、支持細胞の5行（柱状セルの二行三に散在ダイテルス「セルの行）1。 、難聴起源感覚epithemlium 2のパターニングofthe studyeの重要性をheighlightingでこの正確な順序結果からの偏差。 胚性マウスCOCHの体外培養においてLEAは、コルチ器官の発達のメカニズムを研究する上で不可欠なツールです。この技術は1974年に設立され、過去40年間で、感覚上皮が指定され、コルチ器官は3が確立されたメカニズムの多くを解明するために使用されてきた。蝸牛は、動的な発生過程との複雑な器官である。操作1をマニフェストに限り、7日間かかる場合があります。 E13での蝸牛外植片培養物にGSK3βの阻害剤を追加する場合、例えば、化合物の強固な効果を観察するための最適なインキュベーション期間の6日4である。 現像蝸牛のライブイメージングは​​、コルチ器官の形態の変化、遺伝子発現の変化、細胞を、移行増殖性または死亡の追跡調査を可能にし、それはリアルタイム薬剤の結果の観察およびシグナリングの中断を可能にする経路。今までは、蝸牛のイメージングを生きる主に短時間5-8上コルチ器官の画像小領域に、共焦点顕微鏡を使用して実行するが、この技術は、外植片生存率による制限を有するされている。遅い発達プロセスにおける長期的な操作の効果の撮影では、撮影環境が重要である。通常、共焦点ライブイメージング·システムは、顕微鏡に座って、加湿プラスチックの箱を使用しています。暑さと湿度は、アクセス窓から、ヒンジ付きの開口部を通って、そのような客観的または光源としてmicroscope-のさまざまな部分の周りの隙間を通って、顕微鏡テーブルを満たすインキュベートボックス内の隙間を通って逃げることができる。これは、2つまたは3つ以上日間健康な外植片を維持するために最適ではない。 我々は、標準的なCO 2インキュベータ内に封入され、倒立顕微鏡ではなく、顕微鏡を中心に構築され、インキュベーターとして「インキュベーター顕微鏡&#39;を定義。インキュベーター顕微鏡事後むしろ二、三日間のイメージングより、サンプルは2週間まで撮像することができるように、実験の寿命がある。インキュベーター顕微鏡は文化や標準制御された条件を外植する最小限の妨害で、細胞の増殖および分化のための優れた環境を提供します。複数日にわたって行われた研究では、培養器からそれらを除去し、倒立蛍光顕微鏡にそれらを実施することによって、日常的に画像化サンプルに頼るのが一般的である。このアプローチは働くことができる一方で、インキュベータから皿を除去することに敏感な開発組織のストレスを負わせる。原因インキュベーターから取り出し、温度における培養培地および変動の酸性度の変化は、次善の開発や不健康な組織になることができます。あらゆる時点において同じ焦点面と同じ方向に同じ領域を撮像することは極めて困難である。インキュベータ内で自動化システムを使用することにより、健康維持することができる組織は、複数の時点での画像を収集するために、同じ領域が全てのフレームに取り込まれることを確実にする。近年、いくつかの統合された顕微鏡組織インキュベーターが開発されており、これらは、臨床診療9にも、幹細胞および癌研究10,11のみならず、有用であった。 ここでは、マウス胎児蝸牛外植片の長期ライブイメージングのためのプロトコルを提示する。我々は、設定された時点で複数のサンプルの画像を捕捉する能力を有する標準的なCO 2インキュベータの内部に自動顕微鏡システムを使用する。システムは、インキュベータ内にセットし、倒立顕微鏡で構成されています。サンプルは、各時点で複数のサンプルの画像化を可能にする回転壇上に配置されている。照明、画像キャプチャ、および演壇の回転は、MetaMorphソフトウェアを介して操作の自動化システムによって制御される。オペレーティングソフトウェアを用いた撮像ルーチンを設定することにより、我々は、twの最大のために実行するための実験を​​設定することができ最小限の人間の介入と週O。この例では、大規模な成長と転位蝸牛の、具体的には、prosensory領域を示すために、明視野および蛍光の両方を使用する。この実験では、蝸牛は胎生E13にSox2のEGFPレポーターマウスから解剖されます。 インビトロ培養が確立した後、5日間にわたり画像化されます。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle media</td><td>Gibco</td><td>12430</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>Basement membrane extract&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>354230</td><td>Matrigel. Alternative similar products are available from other suppliers.&lt;br/&gt; http://catalog2.corning.com/Lifesciences/en-US/Shopping/Product.aspx?categoryname=Cell+Culture+and+Bioprocess%28Lifesciences%29|Extracellular+Matrix+Proteins+ECMs+and+Attachment+Factors%28Lifesciences%29|Matrigel+Basement+Membrane+Matrix+%28Lifesciences%29</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>16000044</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=fbs&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>5630080</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=hepes&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>100 x N2 supplement</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/search/global/searchAction.action?query=n2&amp;amp;resultPage=1&amp;amp;results PerPage=15&amp;amp;autocomplete=</td></tr><tr><td>Ciprofloxacin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17850-5G-F</td><td>Multiple brands manufacture this&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/17850?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>Hank&#039;s balanced salt solution</td><td>Gibco</td><td>14170161</td><td>Multiple brands manufacture this. Should be refidgerated before use.&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/cell-culture/mammalian-cell-culture/reagents/balanced-salt-solutions/hbss-hanks-balanced-salt-solution.html?s_kwcid=AL!3652!3!26107410508!e!!g!!hbss&amp;amp;ef_id=xoFOglw2s UMAAMU8:20140228185720:s</td></tr><tr><td>Fine Forceps</td><td>Fine Science tools</td><td>11254-20</td><td>Size number 5&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=350&amp;amp;CategoryId=29</td></tr><tr><td>Curette&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10080-05</td><td>size 1 mm&amp;nbsp;&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=91&amp;amp;CategoryId=118</td></tr><tr><td>Insect Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26001-35</td><td>Must be stainless Steel&lt;br/&gt; http://www.finescience.ca/Special-Pages/Products.aspx?ProductId=124</td></tr><tr><td>50 mm plastic dishes</td><td>Corning/Falcon</td><td>351006</td><td>Multiple brands manufacture this</td></tr><tr><td>charcoal</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05105-250G</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/05105?lang=en&amp;amp;region=CA</td></tr><tr><td>184 silicone elastomer</td><td>Dow/Corning&amp;nbsp;</td><td>SYLGARD&amp;reg; 184 SILICONE ELASTOMER KIT</td><td>Dishes are home made several weeks in advance.&amp;nbsp; Silicone elastomer can be from any supplier.&lt;a href=&quot;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&quot;&gt;http://www.dowcorning.com/applications/search/products/Details.aspx?prod=01064291&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Glass bottom dishes</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>The dimensions of the dish are determined by the specifications of the imaging system.&amp;nbsp; 35 mm diameter, 10mm well, number 0 coverslip fits Olympus Vivaview FL.&lt;br/&gt; http://glass-bottom-dishes.com/catalog/index.php?main_page=product_info&amp;amp;cPath= 1_4_15&amp;amp;products_id=2</td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Zeiss&amp;nbsp;</td><td>495101-9804-000</td><td>&amp;nbsp;Stemi 2000 model. multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/stereo-zoom-microscopes/stemi-2000.html</td></tr><tr><td>Cold Light Source</td><td>Zeiss</td><td>000000-1063-182</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://microscopy.zeiss.com/microscopy/en_de/products/microscope-components/lightsources.html</td></tr><tr><td>Fluorescent Stereomicroscope&amp;nbsp;</td><td>Leica microsystems</td><td>Contact Leica microsystems</td><td>Leica M165-FC. Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.leica-microsystems.com/products/stereo-microscopes-macroscopes/fluorescence/details/product/leica-m165-fc/</td></tr><tr><td>Incubator Microscope +imaging software</td><td>Olympus</td><td>Contact Olympus</td><td>Inverted microcope sealed inside a Co2 incubator. Vivaview FL incubator microscope with proprietry Metamorpoh imaging software.&lt;br/&gt; http://olympuscanada.com/seg_section/product.asp?product=1055&amp;amp;c=0</td></tr><tr><td>Clean bench</td><td>Thermo Scientific</td><td>51029701</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/product/heraguard-eco-clean-bench.html</td></tr><tr><td>CO2 incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>3310</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/co2-incubators.html</td></tr><tr><td>Laminar Flow hood</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026651</td><td>Multiple brands manufacture similar items&lt;br/&gt; http://www.thermoscientific.com/en/products/biological-safety-cabinets-clean-benches.html</td></tr></tbody></table>

long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants

ここでは、ライブ胚のマウス蝸牛外植片の長期的なタイムラプスイメージングのための方法を提示する。約10日間の哺乳類蝸牛が進むの非常に規則正しい、複雑な構造を構築するための責任が発生プログラム。この期間にわたって遺伝子発現の変化および医薬品または遺伝子操作に対する反応を研究するために、長期的画像化が必要である。以前は、ライブイメージングは​​、典型的には、標準的な顕微鏡の上の加湿チャンバー内で移植組織の生存度によって制限されてきた。湿度および温度に関して培養増殖のための最適な条件を維持することが困難で画像化実験の長さに制限を置いている。修正された組織培養インキュベーターに統合顕微鏡は、長期的なライブイメージングのための優れた環境を提供します。この方法では、我々はマウス胎児蝸牛外植片を確立する方法と時間経過のimagiを実施するインキュベーター顕微鏡を使用する方法を示し5日間にわたり、典型的な胚日（E）13蝸牛外植片及びSox2の、蝸牛のprosensory細胞のマーカーの挙動を調べるために、明視野および蛍光顕微鏡の両方を使用してngの。

ここでは、モンタージュ（ 図1）およびE13.5上に播種した場合、典型的な器官蝸牛外植片が成長する方法を示す映画（ 図2）を示す。 Sox2のレポーターマウスprosensory領域を可視化するために使用された。映画は蝸牛成長と収束と拡張子を受けることを示し、緑のSox2のドメインの横の領域内のセルは、それが拡大し、周囲の組織のように分割していないようです。これはコルチ器官の特徴である。 E13に前向き感覚上皮は、細胞周期を出て、その後、不拡散13のゾーンとして知られている。異なる蝸牛外植片のミッドベース（ 図3および図4）、それが延びるにつれて、prosensory領域が狭くなることを実証しているを中心とした第二タイムラプス実験。培養3日後に、組織は、それがINDIVIを可視化することが可能であることはかなりように平坦化していることに注意してください二重蛍光細胞、初めに起因し、組織の厚さへの光の内部反射は、それが可能な表現領域ではなく、個々の細胞を同定することを可能にする領域が存在する一方で。 <img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" width="500" /> 図1：時間- 5日間にわたって収集Sox2のレポーター蝸牛組織の経過イメージズはこのモンタージュは、外植片の成長はゼロ日に開始し、10倍の対物レンズを用いて30分毎にサンプリング、5日に終了の進行状況が表示されます。外植片はE13に設立され、イメージングの前に一晩培養した。外植片がそれが成熟するにつれて、両方が成長し収斂伸長運 ​​動を受ける。12時間の間隔で、蝸牛の成長の程度を示す、（A）連続画像。 GFP蛍光遺伝子を重ね可視光チャネルEGFPのみSox2のレポーター（B）GFP蛍光チャネルによって評価。スケールバーは200μmであるに対応しています。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/52101fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/Figure2.f4v" target="_blank">図2</a> ：5日間にわたって収集Sox2のレポーター蝸牛組織のタイムラプスアニメーションこれは、図1に示された同じ外植実験で、この時間枠は5日間かけて30分間隔で選択され、生成する.AVIファイルとして結合される映画。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" width="500" /> 図3：ミッド·ベースのCEの動きを受けて平坦化Sequenti。ミッドベース（EGFP）のprosensory上皮が狭くなることを示すらの画像は、拡張し、5日間にわたって平坦化します。矢印は狭くなる地域を示している。 10×対物レンズを用いて12時間間隔で5日間の時間経過の配列から選択されたフレーム。スケールバーは200μmであるに対応しています。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/52101fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52101/Figure4.f4v" target="_blank">図4</a> ：ミッドベースのCEの動きを受けて、収束し、30分間隔で選択されたフレームと、図3に示す感覚上皮の延長を示すアニメーションタイムラプスシーケンスを平坦化するタイムラプスアニメーション 。

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Long-term Time Lapse Imaging of Mouse Cochlear Explants

手元の発達プロセスには10日間の一時的な勾配で動作するため、胚性哺乳動物の蝸牛のライブイメージングは​​困難である。ここでは、培養した後、5日間にわたり蛍光レポーターマウスから採取した胚性蝸牛外植片組織を画像化するための手法を提案する。

マウス蝸牛外植片の長期的タイムラプスイメージング

Here we present a method for long-term time-lapse imaging of live embryonic mouse cochlear explants. The developmental program responsible for building ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.5K ビュー.  Sunnybrook Research Institute. 手元の発達プロセスには10日間の一時的な勾配で動作するため、胚性哺乳動物の蝸牛のライブイメージングは​​困難である。ここでは、培養した後、5日間にわたり蛍光レポーターマウスから採取した胚性蝸牛外植片組織を画像化するための手法を提案する。 

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Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair cells are aligned in one row of inner hair cells and three rows of outer hair cells that extend along the basal to apical axis of the cochlea. The explant culture technique described here provides an efficient method to isolate and maintain cochlear explants from the embryonic mouse inner ear. Also, the morphology and molecular characteristics of sensory hair cells and nonsensory supporting cells within the cochlear explant cultures resemble those observed in vivo and can be studied within its intrinsic cellular environment. The cochlear explants can serve as important experimental tools for the identification and characterization of molecular and genetic pathways that are involved in cellular specification and patterning. Although transgenic mouse models provide an effective approach for gene expression studies, a considerable number of mouse mutants die during embryonic development thereby hindering the analysis and interpretation of developmental phenotypes. The organ of Corti from mutant mice that die before birth can be cultured so that their in vitro development and responses to different factors can be analyzed. Additionally, we describe a technique for electroporating embryonic cochlear explants ex vivo which can be used to downregulate or overexpress specific gene(s) and analyze their potential endogenous function and test whether specific gene product is necessary or sufficient in a given context to influence mammalian cochlear development1-8.

We present a method that describes isolation and culture of cochlear explants from embryonic mouse inner ear. We also demonstrate a method for gene transfer into cochlear explants via square-wave electroporation. The in vitro explant culture coupled with gene transfer technique enables researchers to study the effects of altering gene expression during development.

エレクトロポレーションによりマウス胎児蝸牛外植の文化と遺伝子導入

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

発生生物学

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

生物工学

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

内耳組織工学用マウス蝸牛を Decellularizing するためのプロトコル

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Dextran Labeling and Uptake in Live and Functional Murine Cochlear Hair Cells

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET remain unknown. Electrophysiological studies of hair cells revealed that the MET channel has a large conductance and is permeable to relatively large fluorescent cationic molecules, including some styryl dyes and Texas Red-labeled aminoglycoside antibiotics. In this protocol, we describe a method to visualize and evaluate the uptake of fluorescent dextrans in hair cells of the organ of Corti explants that can be used to assay for functional MET channels. We found that 3 kDa Texas Red-labeled dextran specifically labels functional auditory hair cells after 1&#8211;2 h incubation. In particular, 3 kDa dextran labels the two shorter stereocilia rows and accumulates in the cell body in a diffuse pattern when functional MET channels are present. An additional vesicle-like pattern of labeling was observed in the cell body of hair cells and surrounding supporting cells. Our data suggest that 3 kDa Texas-Red dextran can be used to visualize and study two pathways for cellular dye uptake; a hair cell-specific entry route through functional MET channels and endocytosis, a pattern also available to larger dextran.

Here, we present a method for visualizing the uptake of 3 kDa Texas Red-labeled dextran in auditory hair cells with functional mechanotransduction channels. In addition, dextrans of 3&#8211;10 kDa can be used to study endocytosis in hair and supporting cells of the organ of Corti.

生きた機能性マウス人工内毛細胞におけるデキストランの標識と取り込み

The hair cell mechanotransduction (MET) channel plays an important role in hearing. However, the molecular identity and structural information of MET ...

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a condition that typically involves damage to or loss of the delicate mechanosensory structures of the inner ear. Sophisticated in vitro and ex vivo assays have emerged in recent years, enabling the screening of an increasing number of potentially therapeutic compounds while minimizing resources and accelerating efforts to develop cures for SNHL. Though homogenous cultures of certain cell types continue to play an important role in current research, many scientists now rely on more complex organotypic cultures of murine inner ears, also known as cochlear explants. The preservation of organized cellular structures within the inner ear facilitates the in situ evaluation of various components of the cochlear infrastructure, including inner and outer hair cells, spiral ganglion neurons, neurites, and supporting cells. Here we present the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The careful preparation of these explants facilitates the identification of mechanisms that contribute to SNHL and constitutes a valuable tool for the hearing research community.

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

The goal of this protocol is to demonstrate the preparation, culture, treatment, and immunostaining of neonatal murine cochlear explants. The technique can be utilized as an in vitro screening tool in hearing research.

新生児マウス蝸牛移植法<em&gt;インビトロ</em&gt;聴覚研究のスクリーニングツール

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

医学

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

大人のマウスにおける人工内耳表面製剤

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

神経科学

Stereocilia Bundle Imaging with Nanoscale Resolution in Live Mammalian Auditory Hair Cells

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia that are arranged in rows of increasing height. When stereocilia are deflected, they tug on tiny (~5 nm in diameter) extracellular tip links interconnecting stereocilia, which convey forces to the mechanosensitive transduction channels. Although mechanotransduction has been studied in live hair cells for decades, the functionally important ultrastructural details of the mechanotransduction machinery at the tips of stereocilia (such as tip link dynamics or transduction-dependent stereocilia remodeling) can still be studied only in dead cells with electron microscopy. Theoretically, scanning probe techniques, such as atomic force microscopy, have enough resolution to visualize the surface of stereocilia. However, independent of imaging mode, even the slightest contact of the atomic force microscopy probe with the stereocilia bundle usually damages the bundle. Here we present a detailed protocol for the hopping probe ion conductance microscopy (HPICM) imaging of live rodent auditory hair cells. This non-contact scanning probe technique allows time lapse imaging of the surface of live cells with a complex topography, like hair cells, with single nanometers resolution and without making physical contact with the sample. The HPICM uses an electrical current passing through the glass nanopipette to detect the cell surface in close vicinity to the pipette, while a 3D-positioning piezoelectric system scans the surface and generates its image. With HPICM, we were able to image stereocilia bundles and the links interconnecting stereocilia in live auditory hair cells for several hours without noticeable damage. We anticipate that the use of HPICM will allow direct exploration of ultrastructural changes in the stereocilia of live hair cells for better understanding of their function.

Here we present a protocol for the Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), a non-contact scanning probe technique that allows nanoscale imaging of stereocilia bundles in live auditory hair cells.

生きた哺乳類聴覚毛細胞におけるナノスケール分解能によるステレオシリアバンドルイメージング

Inner ear hair cells detect sound-induced displacements and transduce these stimuli into electrical signals in a hair bundle that consists of stereocilia ...

In vitro Time-lapse Live-Cell Imaging to Explore Cell Migration toward the Organ of Corti

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after co-culture with cochlear epithelium. The organ of Corti was immobilized on a plastic coverslip by pressing a portion of the Reissner's membrane generated during the dissection. MSCs confined by a glass cylinder migrated toward cochlear epithelium when the cylinder was removed. Their predominant localization was observed in the modiolus of the organ of Corti, aligned in a direction similarly to that of the nerve fibers. However, some MSCs were localized in the limbus area and showed a horizontally elongated shape. In addition, migration into the hair cell area was increased, and the morphology of the MSCs changed to various forms after kanamycin treatment. In conclusion, the results of this study indicate that the coculture of MSCs with cochlear epithelium will be useful for the development of therapeutics via cell transplantation and for studies of cell regeneration that can examine various conditions and factors.

In this study, we present a real-time imaging method using confocal microscopy to observe cells moving toward damaged tissue by ex vivo incubation with the cochlear epithelium containing the organ of Corti.

コルチの器官に向かう細胞の移動を探るインビトロタイムラプスライブセルイメージング

To study the effects of mesenchymal stem cells (MSCs) on cell regeneration and treatment, this method tracks MSC migration and morphological changes after ...

Imaging the Aging Cochlea with Light-Sheet Fluorescence Microscopy

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or presbycusis is a primary cause of sensorineural hearing loss and is characterized by damage to hair cells, spiral ganglion neurons (SGNs), and the stria vascularis. These structures reside within the cochlea, which has a complex, spiral-shaped anatomy of membranous tissues suspended in fluid and surrounded by bone. These properties make it technically difficult to investigate and quantify histopathological changes. To address this need, we developed a light-sheet microscope (TSLIM) that can image and digitize the whole cochlea to facilitate the study of structure-function relationships in the inner ear. Well-aligned serial sections of the whole cochlea result in a stack of images for three-dimensional (3D) volume rendering and segmentation of individual structures for 3D visualization and quantitative analysis (i.e., length, width, surface, volume, and number). Cochleae require minimal processing steps (fixation, decalcification, dehydration, staining, and optical clearing), all of which are compatible with subsequent high-resolution imaging by scanning and transmission electron microscopy. Since all the tissues are present in the stacks, each structure can be assessed individually or relative to other structures. In addition, since imaging uses fluorescent probes, immunohistochemistry and ligand binding can be used to identify specific structures and their 3D volume or distribution within the cochlea. Here we used TSLIM to examine cochleae from aged mice to quantify the loss of hair cells and spiral ganglion neurons. In addition, advanced analyses (e.g., cluster analysis) were used to visualize local reductions of spiral ganglion neurons in Rosenthal&#39;s canal along its 3D volume. These approaches demonstrate TSLIM microscopy&#39;s ability to quantify structure-function relationships within and between cochleae.

A light-sheet microscope was developed to image and digitize whole cochlea.

ライトシート蛍光顕微鏡による老化蝸牛のイメージング

Deafness is the most common sensory impairment, affecting approximately 5% or 430 million people worldwide as per the World Health Organization1. Aging or ...

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is characterized by the cumulative and irreversible loss of sensory hair cells and auditory nerves in the cochlea. Entire and vital cochlear explants are one of the fundamental tools in hearing research to detect hair cell loss and to characterize the molecular mechanisms of the inner ear cells. Many years ago, a protocol for neonatal cochlear isolation was developed, and although it has been modified over time, it still holds potential for improvement. 
This paper presents an optimized protocol for isolating and culturing whole neonatal cochlear explants in multi-well culture chambers that enables the study of hair cells and spiral ganglion neuron cells along the entire length of the cochlea. The protocol was tested using cochlear explants from mice and rats. Healthy cochlear explants were obtained to study the interaction between hair cells, spiral ganglion neuron cells, and the surrounding supporting cells. 
One of the main advantages of this method is that it simplifies the organ culture steps without compromising the quality of the explants. All three turns of the organ of Corti are attached to the bottom of the chamber, which facilitates in vitro experiments and the comprehensive analysis of the explants. We provide some examples of cochlear images from different experiments with live and fixed explants, demonstrating that the explants retain their structure despite exposure to ototoxic drugs. This optimized protocol can be widely used for the integrative analysis of the mammalian cochlea.

Whole Neonatal Cochlear Explants as an In vitro Model

The current protocol updates previous protocols and incorporates relatively straightforward approaches for culturing high-quality cochlear explants. This provides reliable data acquisition and high-resolution imaging in live and fixed cells. This protocol supports the ongoing trend of studying inner ear cells.

In vitroモデルとしての新生児蝸牛外植片全体

Untreated hearing loss imposes significant costs on the global healthcare system and impairs individuals' quality of life. Sensorineural hearing loss is ...