Descelularização para a Preparação de Matriz de Pele Acelular Humana Altamente Preservada para Medicina Regenerativa

A pele humana descelularizada é adequada para a regeneração de tecidos. Uma questão importante da descelularização é a preservação da arquitetura nativa, juntamente com o conteúdo apropriado de proteínas estruturais, glicosaminoglicanos (GAGs) e fatores de crescimento. O método proposto permite uma descelularização rápida e eficaz, produzindo pele descelularizada com traços nativos bem preservados.

A matriz extracelular (MEC) fornece estímulos biofísicos e bioquímicos para apoiar a auto-renovação, proliferação, sobrevivência e diferenciação das células circundantes devido ao seu conteúdo de diversas moléculas bioativas. Devido a essas características, a ECM tem sido recentemente considerada uma candidata promissora para a criação de scaffolds biológicos para impulsionar a regeneração tecidual. Estudos emergentes demonstraram que tecidos humanos descelularizados podem se assemelhar à ECM nativa em seus perfis estruturais e bioquímicos, preservando a arquitetura tridimensional (3D) e o conteúdo de moléculas biológicas fundamentais. Assim, a MEC descelularizada pode ser empregada para promover a remodelação tecidual, reparo e reconstrução funcional de muitos órgãos. A seleção do procedimento de descelularização adequado é crucial para obter tecidos acelulares que retenham as características do microambiente ideal para as células.

O protocolo descrito aqui fornece uma descrição detalhada passo a passo do método de descelularização para obter uma ECM biológica livre de células reprodutível e eficaz. Fragmentos de pele de pacientes submetidos à cirurgia plástica foram reduzidos e descelularizados usando uma combinação de dodecilsulfato de sódio (SDS), Triton X-100 e antibióticos. Para promover o transporte regular e homogêneo da solução através das amostras, elas foram fechadas em embutidos para garantir a proteção contra insultos mecânicos. Após o procedimento de descelularização, a cor branca como a neve dos fragmentos de pele indicou descelularização completa e bem-sucedida. Além disso, as amostras descelularizadas mostraram uma arquitetura intacta e bem preservada. Os resultados sugerem que o método de descelularização proposto foi eficaz, rápido e reprodutível e protegeu as amostras de danos arquitetônicos.

A MEC serve como um andaime para as células, sustentando-as por meio de uma intrincada arquitetura mantida por diferentes componentes, e é um dos principais fatores responsáveis pelas propriedades mecânicas do coração e da função do tecido cardíaco ^1,2. Evidências crescentes sugerem que a MEC desempenha um papel ativo na remodelação tecidual, tornando obsoleta a suposição convencional de que a MEC é um componente passivo 3,4,5,6. O papel da ECM é fornecer pistas biofísicas e bioquímicas para as células residentes. Está bem estabelecido que esses sinais podem influenciar muitos comportamentos celulares fundamentais, impactando sua função contrátil, proliferação, migração e potencial de diferenciação ^7,8,9. Assim, a MEC está sendo cada vez mais empregada na engenharia de tecidos e na medicina regenerativa como ferramenta de suporte terapêutico 9,10,11,12,13.

A MEC consiste em várias proteínas, como colágeno, elastina, fibronectina, proteoglicano e laminina, juntamente com fatores de crescimento ligados à MEC, todos envolvidos em mecanismos de regeneração, como recrutamento, migração e diferenciação celular, bem como alinhamento e proliferação celular¹⁴. As propriedades mecânicas dos tecidos também têm grande relevância na fisiopatologia dos órgãos. De fato, mudanças nas propriedades mecânicas são frequentemente associadas ao aparecimento e à evolução de várias doenças. A razão reside no fato de que, quando a MEC é modificada, os sinais vindos do ambiente induzem alterações na expressão gênica e proteica, levando ao comprometimento funcional^15,16.

As terapias regenerativas para reparo de órgãos estão atualmente focadas em replicar o sofisticado microambiente do tecido nativo para curar o órgão onde o corpo falha. Apesar do ritmo acelerado de muitas abordagens de engenharia de tecidos, os tecidos ainda não podem ser reproduzidos com precisão em sua totalidade e complexidade por procedimentos artificiais. Os materiais sintéticos têm sido amplamente empregados até agora, pois podem ser ajustados adequadamente para simular as propriedades mecânicas e bioquímicas do microambiente celular. No entanto, eles têm limites, como a incapacidade de mimetizar as inúmeras interações dentro do tecido nativo, o custo das tecnologias para produzi-los e o fato de serem menos naturais e biocompatíveis do que o tecido nativo 17,18,19. Além disso, sua composição, principalmente em termos de proteínas e fatores solúveis, difere muito da natural, que é extremamente difícil de replicar²⁰.

A abordagem de ponta na medicina regenerativa para reduzir a lacuna entre os pacientes necessitados e os transplantes de órgãos é produzir andaimes feitos de matriz extracelular descelularizada (d-ECM) e repovoá-los com os tipos de células apropriados para regenerar os órgãos danificados. A descelularização é o processo no qual a MEC é isolada de suas células nativas e material genético para produzir um arcabouço natural e biomimético, capaz de evitar a resposta imune e a rejeição uma vez implantado nos pacientes 21,22,23. A ECM assim obtida pode então ser repovoada para produzir tecido funcional. O principal problema ao desenvolver um d-ECM é o método. Para qualquer técnica de descelularização, o objetivo principal continua sendo a preservação da composição, rigidez e estrutura 3D nativas do ECM, e todas as estratégias têm vantagens e desvantagens. Como a eliminação do conteúdo celular e do DNA do tecido requer o uso de agentes químicos ou físicos, ou a combinação de ambos, cada procedimento de descelularização causa, em diferentes graus, a ruptura da MEC. Portanto, é crucial minimizar os danos à ECM 24,25,26.

A utilização da ECM nativa como plataforma para a reconstituição da ECM nativa in vitro é altamente desejável. Para tanto, vários protocolos de descelularização têm sido aplicados a uma ampla gama de tecidos 27,28,29,30. De fato, desde os estágios iniciais da pesquisa de descelularização e desenvolvimento da MEC, vários tecidos, como artérias, válvulas aórticas e nervos periféricos de animais e humanos, foram descelularizados, e alguns d-ECMs ainda estão disponíveis comercialmente e são usados para substituição de tecidos ou cicatrização de feridas 31,32,33. Recentemente, a pele humana também emergiu como uma candidata adequada para a produção de scaffolds descelularizados para reparo cardíaco devido à sua composição e propriedades mecânicas, capazes de aumentar o potencial regenerativo das células progenitoras cardíacas (CPCs) e se adaptar à contratilidade cardíaca³⁴. Este trabalho descreve um protocolo simples e rápido para produzir scaffolds descelularizados a partir de pele humana adulta, permitindo o desenvolvimento de um d-ECM com arquitetura bem preservada.

As amostras de tecido humano foram coletadas de acordo com os princípios da Declaração de Helsinque e observando as diretrizes do Hospital Universitário "Federico II". Todos os pacientes envolvidos neste estudo forneceram o termo de consentimento livre e esclarecido.

1. Preparação das soluções

1. Preparação de 1200 mL de solução descelularizante a 1%
   1. Preparar 600 ml de solução Triton X-100 a 2% medindo 588 ml de água bidestilada num cilindro graduado e transferindo-a para um copo de 1 L. Com uma pipeta serológica, adicione 12 ml de Triton X-100 e uma barra de agitação ao copo. Colocar o copo num agitador magnético e misturar a solução até que o Triton X-100 esteja completamente dissolvido.
   2. Pare a agitação. Remova a barra de agitação usando um recuperador de barra de agitação. Armazene em temperatura ambiente.
   3. Preparar 600 ml de solução SDS a 2% medindo 550 ml de água bidestilada num cilindro graduado e transferindo-a para um copo de 1 L.
   4. Pesar 12 g de pó de FDS num recipiente de pesagem de plástico e transferi-lo para o copo que contém a água bidestilada no passo 1.1.3.
      NOTA: A etapa 1.1.4 deve ser executada sob um capuz químico e o usuário deve usar equipamento de proteção individual.
   5. Adicione uma barra de agitação, coloque o copo em um agitador magnético e misture a solução até que a SDS esteja completamente dissolvida.
   6. Pare o processo de agitação. Remova a barra de agitação usando um recuperador de barra de agitação.
   7. Transferir a solução para um cilindro graduado e ajustar o volume para 600 ml adicionando água bidestilada
   8. Despeje a solução Triton X-100 a 2% preparada na etapa 1.1.1 em um cilindro de 2 L.
   9. Despeje a solução SDS a 2% preparada nas etapas 1.1.3-1.1.7 no mesmo cilindro de 2 L para obter um volume total de 1200 mL.
   10. Cobrir com parafilme e misturar delicadamente por inversão para obter uma solução homogénea.
   11. Transfira a solução misturada para um frasco de 2 L usando um funil para evitar a formação de espuma. Conservar a solução a +4 °C.
2. Preparação de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS)
   1. Prepare 500 mL de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS) dissolvendo 0,1 g de fosfato de potássio monobásico, 0,1 g de cloreto de potássio, 4,0 g de cloreto de sódio e 0,575 g de fosfato de sódio dibásico em água dupla destilada estéril. Verifique o valor do pH (7.4).
   2. Conservar a +4 °C até à utilização.
3. Preparação da solução antibiótica
   1. Pesar 625 μg de anfotericina B num recipiente de pesagem de plástico.
   2. Pipete 8 mL de uma mistura de penicilina e estreptomicina (caneta / estreptococos) em um tubo de 15 mL.
   3. Adicione a anfotericina B pesada à mistura caneta / estreptococos e ajuste o volume para 10 mL adicionando a mistura de penicilina e estreptomicina (caneta / estreptococos). Tampe o tubo e dissolva a anfotericina B agitando vigorosamente.

2. Dia 1 - inicie o procedimento de descelularização.

1. Despeje 400 mL da solução descelularizante em um béquer de 500 mL.
2. Adicione 2,0 mL da solução antibiótica.

3. Preparação de amostras cutâneas

1. Lave a amostra de pele humana do abdômen de pacientes submetidos à abdominoplastia em uma bandeja de plástico, dobrando-a e virando-a de cabeça para baixo em uma solução fisiológica isotônica de NaCl a 0,9% para remover o excesso de sangue e outros fluidos biológicos.
2. Remova o cabelo usando uma pinça fina e a gordura usando uma tesoura cirúrgica grande.
3. Colocar a amostra de pele na placa dissecadora e dissecá-la com bisturi, tendo como referência as graduações na placa dissecadora para obter fragmentos de 3 cm x 2,5 cm (comprimento por largura), evitando cicatrizes e áreas sujas ou queimadas do tecido.
4. Coloque cada fragmento em um de embutimento, feche-o e certifique-se de que todos os estejam devidamente travados para evitar vazamento da amostra durante o procedimento de descelularização.
5. Colocar um máximo de quatro de embutir com amostras num copo com a solução descelularizante. Adicione uma barra de agitação. Cubra com papel alumínio, escrevendo na parte superior todas as informações para identificar a amostra e a hora de início do procedimento.
6. Colocar o copo sobre o agitador magnético e iniciar a agitação a uma velocidade de rotação de 150 rpm. Pare a agitação. Remova a folha de alumínio que cobre o béquer e retire os de embutir com uma pinça longa.
   NOTA: Depois de parar a agitação, verifique a clareza da solução. Modifique a duração da agitação (menos ou mais de 8 horas) com base no grau de turvação devido à liberação de detritos celulares.
7. Coloque cada em um prato de 100 mm. Substitua a solução descelularizante repetindo as etapas 3.5-3.6 durante a noite.

4. Dia 2 - verifique o estado das amostras de pele.

1. Pare o processo de agitação. Remova a folha de alumínio que cobre o béquer e retire os de embutir com uma pinça longa.
2. Coloque cada em um prato de 100 mm e abra-o. Verifique a cor da amostra.
   NOTA: As amostras podem mostrar uma mudança de cor do bege nativo para o branco como a neve.
3. Remova os pelos residuais e separe a epiderme da derme. Substitua a solução descelularizante repetindo as etapas 3.5-3.6.
4. Pare a agitação após 8 h. Repita as etapas 4.1 a 4.2 até que a amostra pareça branca como a neve. Pare o procedimento de descelularização.
   NOTA: O tempo de exposição à ação dos detergentes pode ser estendido, se necessário.
5. Meça 400 mL de 1x PBS em um cilindro de 500 mL, despeje em um béquer de 500 mL e adicione 2 mL da mistura de Pen Strep/Anfotericina B. Adicione uma barra de agitação.
6. Colocar um máximo de quatro contendo as amostras em cada copo com a solução 1x PBS/antibióticos. Cubra com papel alumínio e escreva todas as informações na parte superior como na etapa 3.5.
7. Colocar o copo num agitador magnético e iniciar a agitação a uma velocidade de rotação de 150 rpm durante a noite, à temperatura ambiente.

5. Dia 3 - uma lavagem final das amostras

1. Pare a agitação. Substitua a solução 1x PBS por 400 mL de água bidestilada Adicione uma barra de agitação. Cubra com papel alumínio e escreva todas as informações no topo como na etapa 3.5.
2. Colocar o copo num agitador magnético e iniciar a agitação a uma velocidade de rotação de 150 rpm durante 30 min.
3. Pare o processo de agitação. Remova a folha de alumínio que cobre o béquer e retire os de embutir com uma pinça longa.
4. Coloque cada de incorporação contendo a amostra de pele descelularizada em um prato de 100 mm. Abra os e seque suavemente as amostras de pele, esfregando-as em lenços umedecidos.
5. Colocar cada amostra de pele descelularizada num recipiente de pesagem previamente marcado com as informações sobre a amostra. Cubra o barco com papel alumínio e escreva todas as informações na parte superior para identificar a amostra. Conservar a - 80 °C.

O objetivo do protocolo foi obter uma amostra de d-ECM de pele de tecido biológico, mantendo uma estrutura 3D bem organizada e um conteúdo bem preservado de moléculas biológicas (Figura 1). Este método baseia-se principalmente na agitação constante das amostras em uma solução contendo a combinação de dois detergentes, Triton X-100 e SDS, preservando assim as características biológicas e estruturais típicas do tecido nativo e reduzindo o tempo de exposição durante o processo de descelularização. Após o recebimento, as amostras foram lavadas e preparadas para o procedimento, obtendo-se fragmentos de pele limpa de 3 cm x 2,5 cm, livre de cabelos ou tecido adiposo (Figura 2 e Figura 3). O uso de de embutimento permitiu a minimização da ruptura tecidual (Figura 3), resultando em amostras com uma arquitetura mais intacta. A pele descelularizada não apresentava sinais de danos mecânicos ou químicos significativos após observação macroscópica. A epiderme foi descolada durante o procedimento de descelularização (Figura 4A,B), e as amostras mudaram de cor de bege, típico de todo o tecido nativo, para branco como a neve, indicando descelularização completa e bem-sucedida (Figura 4C).

Figura 1: Fluxo de trabalho do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas da preparação da amostra de pele após o recebimento. (A) Amostra recebida. (B, C) Avaliação macroscópica da amostra colocada em placa de dissecação. (D-F) Remoção do tecido adiposo com tesoura cirúrgica grande. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Dissecção e colocação de amostras de pele em de incorporação. (A) Cabelo removido por pinça fina. (BE) Amostras de pele dissecadas com bisturi para obter fragmentos de 3 cm x 2,5 cm para caber nos de inclusão. (F, G) Fragmento de pele colocado em de incorporação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Verificando o estado da amostra durante a descelularização. (A, B) Descolamento da epiderme da derme. (C) Mudança de cor da amostra indicando a ocorrência de descelularização. Barras de escala = 3 cm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Embora o protocolo descrito acima tenha sido otimizado e aprimorado em comparação com os protocolos publicados anteriormente, ele apresenta algumas etapas críticas que precisam de atenção e precisão. A formação de espuma deve ser evitada durante a preparação da solução descelularizante para evitar a diluição incorreta dos detergentes. Isso pode ser resolvido despejando suavemente as soluções e fazendo-as fluir ao longo do lado interno do cilindro. Além disso, deve-se ter cuidado ao remover manualmente o tecido adiposo das amostras, pois a descelularização com detergentes, como Triton X-100 e SDS, não elimina a gordura, e os restos lipídicos podem afetar negativamente a eficácia do método. Outra etapa crítica é a remoção da epiderme das amostras. Durante a descelularização, a epiderme se desprende gradualmente da superfície da pele. Nesta fase, é fundamental retirá-lo com uma pinça apenas quando estiver completamente varrido, evitando rasgá-lo ou triturá-lo e causar o aprisionamento de detritos nas amostras.

Este protocolo se concentra na redução do impacto da descelularização nas amostras por meio de duas estratégias principais: a redução do tempo de exposição ao procedimento usando dois detergentes em combinação ^28,35,36 e a proteção das amostras contra insultos mecânicos, encerrando-as em embutidos ³⁷. Além disso, o procedimento produziu resultados bem-sucedidos quando aplicado a outras amostras além da pele, como miocárdio humano e suíno e vasos sanguíneos. A avaliação da eficácia do protocolo aqui descrito é feita principalmente por uma observação macroscópica das amostras, o que mostraria uma mudança notável na cor, de bege para branco como a neve. Certamente, alguns outros aspectos devem ser avaliados para avaliar a qualidade da d-ECM, como a remoção de detritos celulares e material genético residual, a preservação do conteúdo de proteínas estruturais e biomoléculas e a retenção de propriedades mecânicas, conforme descrito em outro artigo 34,37,38. A remoção de detritos celulares e material genético é crucial para reduzir a imunogenicidade do construto. Assim, alguns critérios para avaliar a eficácia da remoção desses componentes estão bem estabelecidos na literatura: a d-ECM não deve ter mais de 50 ng de DNA de fita dupla (dsDNA)³⁹ por mg de peso seco da ECM, e nenhum material nuclear deve ser microscopicamente visível.

Para atender a esses critérios, deve-se realizar a avaliação do conteúdo de DNA residual e a coloração com hematoxilina e eosina, conforme descrito por Di Meglio et ^al.38 para apoiar os dados macroscópicos. Além disso, a avaliação da preservação da MEC pela detecção de proteínas estruturais, como colágeno, fibronectina e laminina, juntamente com glicosaminoglicanos e fatores de crescimento, também é apropriada³⁴. Finalmente, as propriedades mecânicas da d-ECM devem corresponder às do tecido nativo⁴⁰. Embora a eficácia e a viabilidade desse procedimento tenham sido demonstradas para a obtenção de tecido descelularizado desejável, o método apresenta algumas limitações. Por exemplo, permite a descelularização de apenas algumas amostras de cada vez (4 para cada copo), levando a um desperdício considerável de soluções. Por um lado, o uso de embutidos ajuda a proteger e preservar as amostras; por outro lado, obriga os operadores a descelularizar apenas amostras de tamanhos pequenos que cabem nos. Outra limitação é a possibilidade de contaminação microbiana do d-ECM obtido. Embora o procedimento envolva a adição de antibióticos, é altamente recomendável esterilizar o d-ECM por UV antes do uso. Finalmente, as incubações necessárias ao longo de todo o procedimento devem ser calculadas e organizadas com precisão para gerenciar o tempo de maneira ideal.

Este protocolo foi desenvolvido para abordar as desvantagens observadas durante o teste de outros protocolos em laboratório. Os protocolos existentes permitem um grau variável de descelularização sem garantir a integridade adequada do tecido, implicando uma perda considerável de moléculas biológicas essenciais e propriedades mecânicas⁴¹. A preservação da estrutura e composição da MEC após a descelularização são aspectos fundamentais, pois a d-MEC pode atuar como o andaime, que uma vez repovoado, suportará os mecanismos regenerativos celulares dentro do órgão. Ao otimizar o processo de descelularização, os andaimes biológicos derivados da pele humana podem ser utilizados na medicina regenerativa, ajudando a minimizar a lacuna entre doadores e pacientes que precisam de transplantes de órgãos. Além disso, os avanços nos métodos de recelularização e aplicações de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos melhorarão a distribuição dos tipos de células adequadas ^42,43 para permitir o processo de regeneração⁴⁴.

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Nenhum