Um modelo murino padronizado de regeneração de tecidos moles induzida por terapia extracorpórea por ondas de choque

Este artigo descreve um modelo murino padronizado de regeneração tecidual por meio do tratamento por ondas de choque.

A terapia por ondas de choque (SWT) mostra efeitos regenerativos promissores em vários tecidos diferentes. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes são pouco compreendidos. A angiogênese, um processo de formação de novos vasos sanguíneos, é um dos principais impulsionadores da regeneração em tecidos mais moles, bem como um efeito recentemente descoberto do SWT. Como o estímulo mecânico do SWT induz a angiogênese e a regeneração e quais vias estão envolvidas não é totalmente compreendido. Para melhorar ainda mais o uso clínico do SWT e obter informações valiosas sobre como a estimulação mecânica pode afetar o tecido e a regeneração do tecido, é necessário um modelo padronizado de SWT. Descrevemos, por meio deste, um modelo murino padronizado e de fácil implementação de regeneração induzida por terapia por ondas de choque, utilizando o modelo de isquemia de membros posteriores.

A terapia por ondas de choque (SWT) foi introduzida pela primeira vez na prática clínica como um meio de desintegrar cálculos renais por meio de aplicação extracorpórea. Na década de 1990, um achado incidental de espessamento da crista ilíaca em registros de raios-X após litotripsia repetida revelou um efeito morfogênico ósseo do SWT¹. Isso levou a uma onda de novas aplicações no uso ortopédico. O SWT evoluiu para uma opção de tratamento reconhecida para não consolidação de ossos longos, epicondilite lateral e tendinite de Aquiles 2,3,4,5. Evidências recentes agora ampliam novamente o espectro de aparelhos além da ortopedia, para tecidos mais moles e distúrbios de cicatrização de feridas ^6,7. Aqui, os estudos podem mostrar a eficácia do SWT em um conjunto heterogêneo de condições, incluindo, por exemplo, disfunção erétil ou espasticidade após acidente vascular cerebral ^8,9,10.

No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes ao SWT ainda não são totalmente compreendidos e requerem mais pesquisas. Com foco em doenças cardiovasculares, nosso trabalho anterior demonstra um efeito promissor do SWT em um modelo murino de infarto do miocárdio. Assim, a angiogênese foi descoberta como um dos principais impulsionadores da regeneração miocárdica após o SWT¹¹.

A angiogênese descreve o desenvolvimento de novos vasos por meio da germinação e divisão de vasos preexistentes. Em caso de lesão, esses novos vasos facilitam a restauração do fluxo sanguíneo para a área danificada e, portanto, a regeneração¹².

A angiogênese, portanto, representa uma marca registrada da regeneração tecidual e uma explicação potencial para os efeitos do SWT em tecidos mais moles. No entanto, a regeneração é um processo complexo com numerosos mecanismos indutores e efetores. Embora seja possível investigá-los em um ambiente isolado de cultura de células, os modelos animais são mais adequados para emular esses processos complexos. A isquemia de membros posteriores é um modelo bem estabelecido para investigar a angiogênese e a regeneração in vivo¹³. Para apoiar pesquisas futuras sobre o efeito regenerativo do SWT, apresentamos um modelo murino viável e padronizado de SWT na isquemia dos membros posteriores.

Os experimentos foram aprovados pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Médica de Innsbruck e pelo ministério da ciência austríaco (BMWF-66.011/0110-V/3b/2019).

1. Indução da anestesia e configuração operacional

1. Prepare um ambiente adequado para procedimentos com animais: esterilize equipamentos, desinfete superfícies, faça uso de máscaras descartáveis, aventais e luvas de isolamento.
2. Sedar um camundongo de 18 a 12 semanas de idade (tensão e sexo, dependendo do ambiente experimental) em uma câmara conectada a um vaporizador de isoflurano a 4%.
3. Verifique a sedação suficiente via reflexo do pedal ou do pavilhão auricular como indicadores para o reconhecimento da dor profunda.
4. Quando o animal estiver suficientemente sedado, desligue o fluxo de isoflurano e administre analgesia e anestésicos de acordo com o protocolo aprovado de cuidados e uso de animais, por exemplo, cloridrato de cetamina (80 mg / kg de peso corporal) como anestésico e cloridrato de xilazina (5 mg / kg de peso corporal) como analgésico intraperitoneal.
   NOTA: Prepare a seringa com medicação intraperitoneal antes de colocar o animal na câmara de anestesia.
5. Examine a profundidade da anestesia 5 min após a injeção, avaliando o reflexo de retirada do pedal.
6. Aplique pomada para os olhos (por exemplo, 0,5 g de Retinolpalmitat) para evitar danos à córnea.
7. Remova os pelos dentro e nas proximidades da área cirúrgica, em particular o membro posterior esquerdo e a virilha. O creme depilatório pode ser usado em vez de lâminas de barbear ou aparadores para evitar lesões na pele.
8. Fixe o animal em decúbito dorsal com os membros estendidos em uma placa de aquecimento usando fita adesiva.
9. Desinfete e limpe a área da cirurgia com iodopovidona a 10% ou desinfetante similar. Use campo estéril.

2. Procedimento

1. Use um microscópio com ampliação entre 10x e 20x para realizar a cirurgia.
2. Faça uma incisão na pele (~1,5 cm) proximal à articulação do joelho usando uma tesoura cirúrgica.
3. Separe suavemente a pele do tecido subjacente usando uma pinça romba.
4. Identifique os vasos femorais. Separe cuidadosamente a artéria, a veia e o nervo usando fórceps e tesouras.
5. Começando proximalmente no nível do ligamento inguinal, remova cuidadosamente o tecido conjuntivo circundante até que a artéria esteja bem exibida. Como desfecho distal, a ramificação arterial na artéria safena e poplítea deve ser visível.
6. Ligue a artéria femoral proximal ao nível do ligamento inguinal usando uma sutura de polipropileno 7-0.
7. Ocluir a extremidade distal da artéria femoral proximal à ramificação em artéria safena e poplítea usando uma sutura de polipropileno 7-0.
8. Extirpar o segmento da artéria femoral entre os nós distal e proximal usando a diatermia.
   NOTA: A excisão da artéria femoral por corte com tesoura cirúrgica também é possível. No entanto, o uso de uma diatermia oclui o vaso além da sutura, caso os nós falhem.
9. Certifique-se de que a artéria femoral esteja ocluída com segurança e que nenhum sangramento seja visível no campo de operação.
   NOTA: Recomenda-se uma distância estreita entre as suturas da pele para evitar a descontaminação ultrassônica do gel da ferida durante a aplicação do SWT.
10. Suturar a incisão na pele com pontos de nylon não absorvíveis 5-0 com nós simples.
11. Desinfete a área cirúrgica com cotonetes.

3. Aplicação de terapia por ondas de choque

1. Certifique-se de que a incisão na pele esteja totalmente fechada.
2. Defina os parâmetros de tratamento no dispositivo de ondas de choque. Neste cenário experimental, foi utilizada uma densidade de fluxo de energia de 0,1 mJ/^mm2 a uma frequência de 3 Hz para um total de 300 impulsos.
   NOTA: Os níveis de energia foram adotados a partir de resultados anteriores¹⁴ utilizando tratamento por ondas de choque extracorpóreas focadas.
3. Aplique gel ultrassônico na área de tratamento na parte interna da coxa para um acoplamento adequado.
4. Certifique-se de que não há bolhas de ar presas no gel.
   NOTA: O acoplamento adequado com gel suficiente é essencial para a aplicação adequada de SWT. Pequenas bolhas de ar dentro do gel absorvem as ondas de choque e diminuem seu efeito.
5. Aplique 300 impulsos alternando o pedal enquanto move lentamente o aplicador sobre a coxa.
   NOTA: Se o SWT não for aplicado imediatamente após a cirurgia, evite a possível absorção de energia por ondas de choque devido ao crescimento de pelos por remoção antes do tratamento.
6. Após o tratamento, limpe qualquer gel ultrassônico residual para evitar o resfriamento da coxa.
7. Mova o animal para uma gaiola de recuperação exposta a uma lâmpada de aquecimento para evitar hipotermia.
8. Monitore cuidadosamente o animal até acordar e administre uma dose de 0,05 mg / kg de peso corporal de buprenorfina, por via subcutânea, para analgesia adequada.
9. Monitore a saúde e o bem-estar dos animais diariamente até que a incisão cirúrgica esteja totalmente cicatrizada.
   NOTA: O tratamento pode ser limitado a uma sessão ou ser repetido várias vezes. Neste exemplo, uma única aplicação foi executada.

4. Medição do fluxo sanguíneo

1. Realize a medição do fluxo sanguíneo imediatamente após a cirurgia e em vários momentos posteriores, dependendo do ambiente experimental.
2. Sedar o animal em uma câmara conectada a um vaporizador de isoflurano a 4%.
3. Quando o animal estiver sedado, desligue o fluxo de isoflurano e administre anestésicos e analgésicos. De acordo com o protocolo aprovado de cuidados e uso de animais, aplique cloridrato de cetamina (80 mg / kg de peso corporal) e cloridrato de xilazina (5 mg / kg de peso corporal) por via intraperitoneal.
4. Examine a profundidade da anestesia 5 min após a injeção, avaliando o reflexo de retirada do pedal.
5. Utilize pomada para os olhos (por exemplo, 0,5 g de Retinolpalmitat) para evitar danos à córnea.
6. Fixe o animal em decúbito dorsal com os membros estendidos em uma placa de aquecimento usando fita adesiva.
7. Remova os pelos de ambos os membros posteriores meticulosamente.
8. Meça a perfusão do membro via laser doppler de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: A proporção do fluxo sanguíneo isquêmico do membro versus o fluxo sanguíneo não isquêmico do membro deve ser usada como parâmetro principal.

Utilizando este protocolo, diferenças significativas na perfusão dos membros posteriores podem ser observadas e monitoradas após a intervenção do SWT. Imagens representativas mostram uma diferença marcante nos membros tratados com SWT (Figura 1B) em comparação com os membros controle não tratados (Figura 1A). Aqui, a perfusão é retratada por meio de queima térmica com cores frias representando baixa perfusão e cores quentes representando alta perfusão. A quantificação das leituras do laser doppler mostra um aumento significativo na perfusão 4 semanas após a cirurgia. (Figura 1C), Concomitantemente, menos necrose pode ser observada em animais tratados com SWT (Figura 1D). A necrose foi avaliada conforme descrito anteriormente¹⁶.

Figura 1: Melhora da perfusão sanguínea após terapia por ondas de choque em modelo murino de isquemia de membros posteriores. Imagens representativas de doppler a laser de (A) animal não tratado e (B) membros isquêmicos 4 semanas após SW. (C) A quantificação de imagens doppler a laser realizadas semanalmente revelou aumento da perfusão do membro após SWT após 4 semanas. O fluxo sanguíneo é expresso na proporção de membro isquêmico versus membro não isquêmico. *p < 0,05. (D) A avaliação da necrose mostra uma melhora significativa em animais tratados com terapia por ondas de choque após 4 semanas. *p < 0,05. Essa figura foi modificada a partir de Holfeld et al¹⁵. CTR = controle não tratado, SWT = terapia por ondas de choque. Os resultados são expressos como média ± EPM (erro padrão da média). As comparações estatísticas foram realizadas pelo teste t de Student. Valores de p <,05 foram considerados estatisticamente significativos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O tratamento por ondas de choque mostra resultados promissores em vários cenários de regeneração de tecidos moles. No entanto, para aumentar, melhorar ou isolar ainda mais essas capacidades regenerativas, primeiro os fundamentos da regeneração induzida por SWT devem ser descobertos em nível molecular. A regeneração tecidual é complexa e envolve muitos processos biológicos, incluindo imunidade inata e adquirida, inflamação, progressão do ciclo celular, apoptose, diferenciação celular, angiogênese e outros^17,18. Mecanismos isolados de SWT podem ser estudados in vitro, utilizando uma aplicação em banho-maria, mas ficam aquém de emular de forma abrangente a regeneração in vivo. Assim, a investigação correta das vias ativadas pelo SWT só pode ser alcançada in vivo.

O modelo de camundongo com isquemia de membros posteriores está bem estabelecido e fácil de implementar. Além disso, apresenta baixa taxa de mortalidade e baixa gravidade em comparação com outros meios cirúrgicos para investigar a regeneração tecidual. Além disso, o modelo de isquemia de membros posteriores fornece fácil acesso ao tecido tratado para coleta de tecido ou outros meios de avaliação (por exemplo, avaliação ultrassônica, laser doppler etc.). Este modelo tem as seguintes limitações. Uma grande limitação é a natureza aguda da isquemia induzida pela remoção da artéria femoral, enquanto a maioria das doenças isquêmicas são processos crônicos. Além disso, devido à pouca idade e ao tecido colateral saudável, os roedores tendem a se curar em grande parte após a isquemia, mesmo sem intervenções terapêuticas.

As evidências para os efeitos do SWT são obtidas principalmente por meio de estudos médicos, mas geralmente carecem de pesquisas aprofundadas e avaliação de mecanismos moleculares. Um protocolo padronizado poderia, assim, apresentar um meio para os pesquisadores compararem seu trabalho em torno da regeneração SWT. Nesse sentido, esse protocolo foi projetado para representar uma base modificável, facilmente ajustável a diferentes tecidos, aplicadores de SWT, regimes de tratamento ou leituras. Assim, apenas algumas etapas deste protocolo podem ser consideradas cruciais (veja abaixo). Este protocolo, portanto, apresenta uma maneira fácil, viável e padronizada de induzir e estudar a regeneração por meio da terapia por ondas de choque in vivo.

Passos cruciais
Como em todos os modelos animais, é crucial evitar infecções, sofrimento desnecessário dos animais e promover dados limpos reproduzíveis. Portanto, os instrumentos devem ser desinfetados adequadamente. Todo o trabalho, incluindo animais de pesquisa, deve ser realizado por indivíduos capazes e treinados. A insuficiência de qualquer um dos pontos mencionados deve ser evitada. Certifique-se de não misturar a veia femoral com a artéria. Evite lesões musculares térmicas durante o uso da diatermia, pois isso pode influenciar os resultados do fluxo sanguíneo.

A familiarização com esta ferramenta antes do uso em um modelo animal é altamente recomendada. Certifique-se de não afetar o tecido circundante, verificando novamente se há tecido temperado na parte da pinça da diatermia antes da ativação. Ao realizar SWT, lembre-se de que diferentes dispositivos SWT funcionam de maneira diferente e que a terapia deve ser conduzida de acordo com o manual do usuário do dispositivo usado.

Holfeld J. e Grimm M. são acionistas da Heart Regeneration Technologies GmbH, uma spin-off da Universidade Médica de Innsbruck com o objetivo de promover a terapia por ondas de choque cardíaca (www.heart-regeneration.com). Todos os outros autores não têm nada a divulgar.

Este estudo foi apoiado por uma bolsa de pesquisa AUVA irrestrita para JH e CGT.