نموذج الفئران الموحد للعلاج بالموجات الصدمية خارج الجسم الناجم عن تجديد الأنسجة الرخوة

تصف هذه المقالة نموذجا قياسيا لتجديد الأنسجة عن طريق العلاج بالموجات الصدمية.

يظهر العلاج بالموجات الصدمية (SWT) تأثيرات تجديدية واعدة في العديد من الأنسجة المختلفة. ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الأساسية غير مفهومة جيدا. تكوين الأوعية الدموية ، وهي عملية تكوين أوعية دموية جديدة هي المحرك الرئيسي للتجديد في الأنسجة الرخوة بالإضافة إلى التأثير المكتشف مؤخرا ل SWT. كيف يحفز الحافز الميكانيكي ل SWT تكوين الأوعية الدموية وتجديدها والمسارات المتضمنة ليست مفهومة تماما. لزيادة تحسين الاستخدام السريري ل SWT واكتساب معلومات قيمة حول كيفية تأثير التحفيز الميكانيكي على تجديد الأنسجة والأنسجة ، هناك حاجة إلى نموذج موحد ل SWT. نحن ، بموجب هذا ، نصف نموذج فئران موحد وسهل التنفيذ للتجديد المستحث بالعلاج بالموجات الصدمية ، باستخدام نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية.

تم تقديم العلاج بالموجات الصدمية (SWT) لأول مرة في الممارسة السريرية كوسيلة لتفكيك حصوات الكلى عن طريق التطبيق خارج الجسم. في التسعينيات ، كشف اكتشاف عرضي لسماكة القمة الحرقفية في تسجيلات الأشعة السينية بعد تفتيت الحصوات المتكرر عن تأثير مورفوجيني للعظام ل SWT¹. أدى ذلك إلى زيادة التطبيقات الجديدة في استخدام العظام. SWT ، وبالتالي تطورت إلى خيار علاجي معترف به ، لعدم اتحادات العظام الطويلة ، والتهاب اللقيمة الجانبي ، وكذلك التهاب وتر العرقوب^2،3،4،5. توسع الأدلة الحديثة الآن مرة أخرى نطاق الأجهزة إلى ما وراء جراحة العظام ، إلى الأنسجة الرخوة واضطرابات التئام الجروح^6،7. هنا يمكن أن تظهر الدراسات فعالية SWT في مجموعة غير متجانسة من الحالات بما في ذلك على سبيل المثال ضعف الانتصاب أو التشنج بعد السكتة الدماغية^8،9،10.

ومع ذلك ، فإن الآليات الجزيئية الكامنة وراء SWT لا تزال غير مفهومة تماما وتتطلب مزيدا من البحث. مع التركيز على أمراض القلب والأوعية الدموية ، يوضح عملنا السابق تأثيرا واعدا ل SWT في نموذج الفئران لاحتشاء عضلة القلب. وبالتالي تم اكتشاف تكوين الأوعية كمحرك أساسي لتجديد عضلة القلب بعد SWT¹¹.

يصف تكوين الأوعية الدموية تطور أوعية جديدة من خلال إنبات وتقسيم الأوعية الموجودة مسبقا. في حالة الإصابة ، تسهل هذه الأوعية الجديدة استعادة تدفق الدم إلى المنطقة المتضررة وبالتالي التجدد¹².

لذلك ، يمثل تكوين الأوعية الدموية السمة المميزة لتجديد الأنسجة وتفسيرا محتملا لتأثيرات SWT في الأنسجة الرخوة. ومع ذلك ، فإن التجديد هو عملية معقدة مع العديد من آليات المحرض والمستجيب. على الرغم من إمكانية التحقيق فيها في بيئة زراعة الخلايا المعزولة ، فإن النماذج الحيوانية هي الأنسب لمحاكاة هذه العمليات المعقدة. نقص تروية الأطراف الخلفية هو نموذج راسخ للتحقيق في تكوين الأوعية وتجديدها في الجسم الحي¹³. لدعم المزيد من البحث حول التأثير التجديدي ل SWT ، نقدم بموجب هذا نموذجا ممكنا وموحدا للفئران ل SWT في نقص تروية الأطراف الخلفية.

تمت الموافقة على التجارب من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدامها في جامعة إنسبروك الطبية ووزارة العلوم النمساوية (BMWF-66.011 / 0110-V / 3b / 2019).

1. تحريض التخدير والإعداد التشغيلي

1. قم بإعداد بيئة مناسبة للإجراءات الحيوانية: تعقيم المعدات ، وتطهير الأسطح ، والاستفادة من الأقنعة التي تستخدم لمرة واحدة ، والعباءات العازلة والقفازات.
2. تخدير فأر عمره 18-12 أسبوعا (الإجهاد والجنس حسب الإعداد التجريبي) في غرفة متصلة بمبخر الأيزوفلوران بنسبة 4٪.
3. تحقق من التخدير الكافي عن طريق دواسة أو منعكس الصيوان كمؤشرات للتعرف العميق على الألم.
4. عندما يتم تخدير بشكل كاف ، قم بإيقاف تشغيل تدفق الأيزوفلوران وإعطاء التسكين والتخدير وفقا لبروتوكول رعاية المعتمد واستخدامه ، على سبيل المثال ، هيدروكلوريد الكيتامين (80 مجم / كجم من وزن الجسم) كمخدر وزيلازين هيدروكلوريد (5 مجم / كجم من وزن الجسم) كمسكن داخل الصفاق.
   ملاحظة: تحضير حقنة بالأدوية داخل الصفاق قبل وضع في غرفة التخدير.
5. افحص عمق التخدير بعد 5 دقائق من الحقن عن طريق تقييم منعكس سحب الدواسة.
6. ضع مرهم العين (على سبيل المثال ، 0.5 جم من الريتينول بالميتات) لتجنب تلف القرنية.
7. إزالة الشعر في المنطقة الجراحية وعلى مقربة منها، ولا سيما الطرف الخلفي الأيسر والفخذ. يمكن استخدام كريم إزالة الشعر بدلا من شفرات الحلاقة أو أدوات التشذيب لتجنب إصابة الجلد.
8. ثبت في وضع ضعيف مع أطراف ممتدة على لوح تسخين باستخدام شريط لاصق.
9. تطهير وتنظيف منطقة الجراحة باستخدام 10٪ بوفيدون اليود أو مطهر مشابه. استخدم ستارة مجال معقمة.

2. الإجراء

1. استخدم مجهرا يتراوح بين 10x و 20x لإجراء الجراحة.
2. قم بعمل شق جلدي (~ 1.5 سم) بالقرب من مفصل الركبة باستخدام مقص جراحي.
3. افصل الجلد برفق عن الأنسجة الأساسية باستخدام ملقط حاد.
4. تحديد الأوعية الفخذية. افصل الشريان والوريد والأعصاب بعناية باستخدام الملقط والمقص.
5. بدءا من مستوى الرباط الإربي ، قم بإزالة النسيج الضام المحيط بعناية حتى يتم عرض الشريان على النحو الأمثل. كنقطة نهاية بعيدة ، يجب أن يكون الشريان المتفرع إلى الشريان الصافن والمأبضي مرئيا.
6. اربط الشريان الفخذي القريب على مستوى الرباط الإربي باستخدام خياطة بولي بروبيلين 7-0.
7. انسداد الطرف البعيد للشريان الفخذي القريب من المتفرع إلى الشريان الصافن والمأبضي باستخدام خياطة البولي بروبيلين 7-0.
8. استئصال جزء الشريان الفخذي بين العقدة البعيدة والقريبة باستخدام الإنفاذ الحراري.
   ملاحظة: من الممكن أيضا استئصال الشريان الفخذي عن طريق القطع بمقص جراحي. ومع ذلك ، فإن استخدام الإنفاذ الحراري يسد الوعاء بالإضافة إلى الخيط في حالة فشل العقد.
9. تأكد من انسداد الشريان الفخذي بأمان وعدم وجود نزيف مرئي في مجال العملية.
   ملاحظة: يوصى بمسافة ضيقة بين خيوط الجلد لتجنب إزالة تلوث الجرح بالموجات فوق الصوتية أثناء تطبيق SWT.
10. خياطة شق الجلد باستخدام 5-0 خيوط نايلون غير قابلة للامتصاص بعقدة واحدة.
11. تطهير المنطقة الجراحية بمسحات قطنية.

3. تطبيق العلاج بالموجات الصدمية

1. تأكد من إغلاق شق الجلد بالكامل.
2. تحديد معلمات العلاج في جهاز الموجات الصدمية. في هذا الإعداد التجريبي ، تم استخدام كثافة تدفق الطاقة 0.1 mJ / mm² بتردد 3 هرتز لما مجموعه 300 نبضة.
   ملاحظة: تم اعتماد مستويات الطاقة من النتائج السابقة¹⁴ باستخدام علاج الموجات الصدمية المركز خارج الجسم.
3. ضع الجل بالموجات فوق الصوتية على منطقة العلاج على الفخذ الداخلي للاقتران المناسب.
4. تأكد من عدم وجود فقاعات هواء محتجزة داخل الجل.
   ملاحظة: يعد الاقتران المناسب مع كمية كافية من الجل ضروريا لتطبيق SWT المناسب. تمتص فقاعات الهواء الصغيرة داخل الجل موجات الصدمة وتقلل من تأثيرها.
5. ضع 300 نبضة عن طريق تبديل مفتاح القدم أثناء تحريك أداة التطبيق ببطء فوق الفخذ.
   ملاحظة: إذا لم يتم تطبيق SWT مباشرة بعد الجراحة ، فتجنب امتصاص طاقة الموجات الصدمية المحتمل بسبب إعادة نمو الشعر عن طريق إزالته قبل العلاج.
6. بعد العلاج ، امسح أي هلام بالموجات فوق الصوتية المتبقية لمنع تبريد الفخذ.
7. انقل إلى قفص استرداد معرض لمصباح تسخين لتجنب انخفاض حرارة الجسم.
8. راقب بعناية حتى الاستيقاظ وقم بإعطاء جرعة 0.05 ملغم/كغ من وزن الجسم من البوبرينورفين، تحت الجلد لتسكين الألم الكافي.
9. راقب صحة ورفاهية يوميا حتى يلتئم الشق الجراحي تماما.
   ملاحظة: يمكن أن يقتصر العلاج على جلسة واحدة أو يتكرر عدة مرات. في هذا المثال، تم تنفيذ تطبيق واحد.

4. قياس تدفق الدم

1. قم بإجراء قياس تدفق الدم مباشرة بعد الجراحة وفي نقاط زمنية مختلفة بعد ذلك اعتمادا على الإعداد التجريبي.
2. تخدير في غرفة متصلة بمبخر الأيزوفلوران بنسبة 4٪.
3. عندما يتم تخدير ، قم بإيقاف تشغيل تدفق الأيزوفلوران وإعطاء التخدير والمسكنات. وفقا لبروتوكول رعاية واستخدامه المعتمد ، يتم تطبيق هيدروكلوريد الكيتامين (80 مجم / كجم من وزن الجسم) والزيلازين هيدروكلوريد (5 مجم / كجم من وزن الجسم) داخل الصفاق.
4. افحص عمق التخدير بعد 5 دقائق من الحقن عن طريق تقييم منعكس سحب الدواسة.
5. استخدم مرهم العين (على سبيل المثال ، 0.5 جم من الريتينول بالميتا) لتجنب تلف القرنية.
6. ثبت في وضع ضعيف مع أطراف ممتدة على لوح تسخين باستخدام شريط لاصق.
7. إزالة الشعر من كلا الطرفين الخلفيين بدقة.
8. قم بقياس نضح الأطراف عن طريق دوبلر بالليزر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   ملاحظة: يجب استخدام نسبة تدفق الدم في الأطراف الإقفارية مقابل تدفق الدم غير الإقفاري كمعلمة رئيسية.

باستخدام هذا البروتوكول ، يمكن ملاحظة ومراقبة الاختلافات الكبيرة في تروية الأطراف الخلفية بعد تدخل SWT. تظهر الصور التمثيلية اختلافا ملحوظا في الأطراف المعالجة ب SWT (الشكل 1 ب) مقارنة بالأطراف الضابطة غير المعالجة (الشكل 1 أ). هنا ، يتم تصوير التروية عن طريق الحرق الحراري بألوان باردة تمثل نضح منخفض وألوانا دافئة تمثل نضحا عاليا. يظهر القياس الكمي لقراءات دوبلر الليزر زيادة كبيرة في التروية بعد 4 أسابيع من الجراحة. (الشكل 1 ج) ، يمكن ملاحظة نخر أقل في نفس الوقت في المعالجة SWT (الشكل 1 د). تم تقييم النخر كما هو موضح^{سابقا 16}.

الشكل 1: تحسين نضح الدم عند العلاج بالموجات الصدمية في نموذج الفئران لنقص تروية الأطراف الخلفية. صور دوبلر ليزر تمثيلية ل (أ) غير معالج و (ب) أطراف إقفارية بعد 4 أسابيع من SW. (ج) كشف القياس الكمي لتصوير دوبلر بالليزر الذي يتم إجراؤه أسبوعيا عن زيادة نضح الأطراف عند SWT بعد 4 أسابيع. يتم التعبير عن تدفق الدم بنسبة الطرف الإقفاري مقابل الطرف غير الإقفاري. * ص < 0.05. (د) يظهر تقييم النخر تحسنا ملحوظا في التي عولجت بالعلاج بالموجات الصدمية بعد 4 أسابيع. * ص < 0.05. تم تعديل هذا الرقم من Holfeld et al¹⁵. نسبة النقر إلى الظهور = التحكم غير المعالج ، SWT = العلاج بالموجات الصدمية. يتم التعبير عن النتائج بمتوسط ± SEM (الخطأ المعياري للمتوسط). تم إجراء المقارنات الإحصائية عن طريق اختبار t للطالب. اعتبرت قيم P <.05 ذات دلالة إحصائية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يظهر العلاج بالموجات الصدمية نتائج واعدة في العديد من إعدادات تجديد الأنسجة الرخوة. ومع ذلك ، لزيادة أو تحسين أو عزل هذه القدرات التجديدية ، يجب أولا الكشف عن أساسيات التجديد المستحث عن SWT على المستوى الجزيئي. تجديد الأنسجة معقد وينطوي على العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك المناعة الفطرية والمكتسبة ، والالتهاب ، وتطور دورة الخلية ، وموت الخلايا المبرمج ، والتمايز الخلوي ، وتكوين الأوعية الدموية وغيرها^17،18. يمكن دراسة الآليات المعزولة ل SWT في المختبر ، باستخدام تطبيق حمام مائي ، ولكنها لا تقصر في محاكاة التجديد في الجسم الحي بشكل شامل. وبالتالي لا يمكن تحقيق التحقيق الصحيح للمسارات التي يتم تنشيطها بواسطة SWT إلا في الجسم الحي.

نموذج فأر نقص تروية الطرف الخلفي راسخ وسهل التنفيذ. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يظهر معدل وفيات منخفض وشدة منخفضة مقارنة بالوسائل الجراحية الأخرى للتحقيق في تجديد الأنسجة. علاوة على ذلك ، يوفر نموذج نقص تروية الأطراف الخلفية وصولا سهلا إلى الأنسجة المعالجة لجمع الأنسجة أو غيرها من وسائل التقييم (على سبيل المثال ، التقييم بالموجات فوق الصوتية ، دوبلر الليزر ، إلخ). يحتوي هذا النموذج على القيود التالية. أحد القيود الرئيسية هو الطبيعة الحادة لنقص التروية الناجم عن إزالة الشريان الفخذي في حين أن معظم الأمراض الإقفارية هي عمليات مزمنة. علاوة على ذلك ، نظرا لصغر السن والأنسجة الجانبية الصحية ، تميل القوارض إلى الشفاء إلى حد كبير بعد نقص التروية حتى بدون تدخلات علاجية.

يتم الحصول على أدلة على آثار SWT في الغالب من خلال الدراسات الطبية ولكنها عادة ما تفتقر إلى البحث المتعمق وتقييم الآليات الجزيئية. يمكن لبروتوكول موحد ، وبالتالي تقديم وسيلة للباحثين لمقارنة عملهم المحيط بتجديد SWT. في هذا الصدد ، تم تصميم هذا البروتوكول لتمثيل أساس قابل للتعديل ، قابل للتعديل بسهولة للأنسجة المختلفة ، أو أدوات تطبيق SWT ، أو أنظمة العلاج ، أو القراءات. وفقا لذلك ، يمكن اعتبار بضع خطوات فقط في هذا البروتوكول حاسمة (انظر أدناه). وهكذا يقدم هذا البروتوكول طريقة سهلة وعملية وموحدة للحث على التجديد ودراسته عبر العلاج بالموجات الصدمية في الجسم الحي.

خطوات حاسمة
كما هو الحال في جميع النماذج الحيوانية ، من الضروري تجنب العدوى والمعاناة غير الضرورية للحيوانات وتعزيز البيانات النظيفة القابلة لإعادة الإنتاج. لذلك ، يجب تطهير الأدوات بشكل صحيح. يجب أن يتم تنفيذ جميع الأعمال بما في ذلك البحث من قبل أفراد مؤهلين ومدربين. يجب تجنب عدم كفاية أي من النقطتين المذكورتين. تأكد من عدم خلط الوريد الفخذي مع الشريان. تجنب إصابة العضلات الحرارية أثناء استخدام الإنفاذ الحراري ، لأنها قد تؤدي إلى تحيز نتائج تدفق الدم.

يوصى بشدة بالتعرف على هذه الأداة قبل استخدامها في نموذج حيواني. تأكد من عدم التأثير على الأنسجة المحيطة ، عن طريق التحقق المزدوج من الأنسجة المروية في جزء الملقط من الحرارة قبل التنشيط. عند إجراء SWT ، ضع في اعتبارك أن أجهزة SWT المختلفة تعمل بشكل مختلف وأن العلاج يجب أن يتم وفقا لدليل المستخدم الخاص بالجهاز المستخدم.

هولفيلد جيه وجريم إم هما مساهمان في Heart Regeneration Technologies GmbH ، وهي شركة عرضية لجامعة إنسبروك الطبية تهدف إلى تعزيز العلاج بالموجات الصدمية القلبية (www.heart-regeneration.com). جميع المؤلفين الآخرين ليس لديهم ما يكشفون عنه.

تم دعم هذه الدراسة من خلال منحة بحثية غير مقيدة من AUVA إلى JH و CGT.