Un modelo murino estandarizado de terapia con ondas de choque extracorpóreas indujo la regeneración de tejidos blandos

Este artículo describe un modelo murino estandarizado de regeneración de tejidos mediante tratamiento con ondas de choque.

La terapia con ondas de choque (SWT) muestra efectos regenerativos prometedores en varios tejidos diferentes. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes son poco conocidos. La angiogénesis, un proceso de formación de nuevos vasos sanguíneos, es uno de los principales impulsores de la regeneración en los tejidos más blandos, así como un efecto recientemente descubierto de SWT. No se comprende completamente cómo el estímulo mecánico de SWT induce la angiogénesis y la regeneración y qué vías están involucradas. Para mejorar aún más el uso clínico de SWT y obtener información valiosa sobre cómo la estimulación mecánica puede afectar el tejido y la regeneración de tejidos, se necesita un modelo estandarizado de SWT. Por la presente, describimos un modelo murino estandarizado y fácil de implementar de regeneración inducida por terapia con ondas de choque, utilizando el modelo de isquemia de las extremidades posteriores.

La terapia con ondas de choque (SWT) se introdujo por primera vez en la práctica clínica como un medio para desintegrar los cálculos renales mediante aplicación extracorpórea. En la década de 1990, un hallazgo incidental de engrosamiento de la cresta ilíaca en las radiografías después de una litotricia repetida reveló un efecto morfogénico óseo de SWT¹. Esto provocó un aumento de nuevas aplicaciones en el uso ortopédico. Por lo tanto, la SWT se convirtió en una opción de tratamiento reconocida para las pseudoartrosis de los huesos largos, la epicondilitis lateral y la tendinitis de Aquiles 2,3,4,5. La evidencia reciente vuelve a ampliar el espectro de aparatos más allá de la ortopedia, hacia tejidos más blandos y trastornos de la cicatrización de heridas ^6,7. En este caso, los estudios podrían demostrar la eficacia de la SWT en un conjunto heterogéneo de afecciones, como la disfunción eréctil o la espasticidad después de un accidente cerebrovascular ^8,9,10.

Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la SWT aún no se comprenden completamente y requieren más investigación. Con un enfoque en la enfermedad cardiovascular, nuestro trabajo previo demuestra un efecto prometedor de SWT en un modelo murino de infarto de miocardio. De este modo, se descubrió que la angiogénesis era un factor clave de la regeneración miocárdica tras el SWT¹¹.

La angiogénesis describe el desarrollo de nuevos vasos a través de la brotación y división de vasos preexistentes. En el caso de lesión, estos nuevos vasos facilitan el restablecimiento del flujo sanguíneo a la zona dañada y, por lo tanto, la regeneración¹².

La angiogénesis, por lo tanto, representa un sello distintivo de la regeneración de tejidos y una posible explicación de los efectos de SWT en tejidos más blandos. Sin embargo, la regeneración es un proceso complejo con numerosos mecanismos inductores y efectores. A pesar de la posibilidad de investigarlos en un entorno de cultivo celular aislado, los modelos animales son los más adecuados para emular estos procesos complejos. La isquemia de las extremidades posteriores es un modelo bien establecido para investigar la angiogénesis y la regeneración in vivo¹³. Para apoyar la investigación adicional del efecto regenerativo de SWT, presentamos un modelo murino factible, estandarizado y factible de SWT en la isquemia de las extremidades posteriores.

Los experimentos fueron aprobados por el comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad Médica de Innsbruck y por el Ministerio de Ciencia de Austria (BMWF-66.011/0110-V/3b/2019).

1. Inducción de la anestesia y puesta en marcha

1. Preparar un ambiente adecuado para los procedimientos con animales: esterilizar el equipo, desinfectar las superficies, hacer uso de mascarillas desechables, batas de aislamiento y guantes.
2. Sedar a un ratón de 18-12 semanas de edad (la cepa y el sexo dependen del entorno experimental) en una cámara conectada a un vaporizador de isoflurano al 4%.
3. Compruebe la sedación suficiente a través del reflejo del oído auricular como indicadores para el reconocimiento del dolor profundo.
4. Cuando el animal esté suficientemente sedado, apague el flujo de isoflurano y administre analgesia y anestésicos según el protocolo aprobado de cuidado y uso de animales, por ejemplo, clorhidrato de ketamina (80 mg/kg de peso corporal) como anestésico y clorhidrato de xilacina (5 mg/kg de peso corporal) como analgésico intraperitoneal.
   NOTA: Prepare la jeringa con medicación intraperitoneal antes de colocar al animal en la cámara de anestesia.
5. Examinar la profundidad de la anestesia 5 min después de la inyección evaluando el reflejo de retirada del pedal.
6. Aplique ungüento para los ojos (por ejemplo, 0,5 g de Retinolpalmitat) para evitar daños en la córnea.
7. Eliminar el vello en la zona quirúrgica y en sus proximidades, en particular la extremidad posterior izquierda y la ingle. La crema depilatoria se puede usar en lugar de maquinillas de afeitar o recortadoras para evitar lesiones en la piel.
8. Fije al animal en posición supina con las extremidades extendidas sobre una placa calefactora con cinta adhesiva.
9. Desinfectar y limpiar el área de la cirugía con povidona yodada al 10% o desinfectante similar. Utilice un paño de campo estéril.

2. Procedimiento

1. Utilice un microscopio con un aumento de entre 10x y 20x para realizar la cirugía.
2. Haga una incisión en la piel (~1,5 cm) proximal a la articulación de la rodilla con unas tijeras quirúrgicas.
3. Separe suavemente la piel del tejido subyacente con pinzas romas.
4. Identificar los vasos femorales. Separe cuidadosamente la arteria, la vena y el nervio con pinzas y tijeras.
5. Comenzando proximalmente a nivel del ligamento inguinal, retire con cuidado el tejido conectivo circundante hasta que la arteria se muestre de manera óptima. Como criterio de valoración distal, la ramificación arterial hacia la arteria safena y poplítea debe ser visible.
6. Libar la arteria femoral proximal a nivel del ligamento inguinal mediante una sutura de polipropileno 7-0.
7. Ocluir el extremo distal de la arteria femoral proximal a la ramificación en arteria safena y poplítea mediante una sutura de polipropileno 7-0.
8. Extirpar el segmento de la arteria femoral entre los nudos distal y proximal mediante diatermia.
   NOTA: También es posible extirpar la arteria femoral mediante cortes con tijeras quirúrgicas. Sin embargo, el uso de una diatermia ocluye el vaso además de la sutura en caso de que los nudos fallen.
9. Asegúrese de que la arteria femoral esté ocluida de forma segura y que no haya hemorragias visibles en el campo de operación.
   NOTA: Se recomienda una distancia estrecha entre las suturas cutáneas para evitar la descontaminación ultrasónica de la herida con gel durante la aplicación de SWT.
10. Sutura la incisión cutánea con suturas de nailon no absorbible 5-0 con nudos individuales.
11. Desinfecte el área quirúrgica con hisopos de algodón.

3. Aplicación de la terapia de ondas de choque

1. Asegúrese de que la incisión en la piel esté completamente cerrada.
2. Defina los parámetros de tratamiento en el dispositivo de onda de choque. En este entorno experimental, se utilizó una densidad de flujo de energía de 0,1 mJ/^mm2 a una frecuencia de 3 Hz para un total de 300 impulsos.
   NOTA: Los niveles de energía se adoptaron de los resultados anteriores¹⁴ utilizando un tratamiento con ondas de choque extracorpóreas focalizadas.
3. Aplique gel ultrasónico en el área de tratamiento en la parte interna del muslo para un acoplamiento adecuado.
4. Asegúrese de que no haya burbujas de aire atrapadas dentro del gel.
   NOTA: El acoplamiento adecuado con suficiente gel es esencial para una aplicación adecuada de SWT. Las pequeñas burbujas de aire dentro del gel absorberán las ondas de choque y disminuirán su efecto.
5. Aplique 300 impulsos alternando el interruptor de pie mientras mueve lentamente el aplicador sobre el muslo.
   NOTA: Si SWT no se aplica inmediatamente después de la cirugía, evite la posible absorción de energía de onda de choque debido a la regeneración del vello mediante la eliminación antes del tratamiento.
6. Después del tratamiento, limpie cualquier gel ultrasónico residual para evitar el enfriamiento del muslo.
7. Traslade al animal a una jaula de recuperación expuesta a una lámpara de calefacción para evitar la hipotermia.
8. Vigilar atentamente al animal hasta que esté despierto y administrar una dosis de 0,05 mg/kg de peso corporal de buprenorfina, por vía subcutánea para una analgesia adecuada.
9. Monitoree la salud y el bienestar de los animales diariamente hasta que la incisión quirúrgica se cure por completo.
   NOTA: El tratamiento puede limitarse a una sesión o repetirse varias veces. En este ejemplo, se realizó una sola aplicación.

4. Medición del flujo sanguíneo

1. Realizar la medición del flujo sanguíneo inmediatamente después de la cirugía y en varios momentos posteriores dependiendo del entorno experimental.
2. Sedar al animal en una cámara conectada a un vaporizador de isoflurano al 4%.
3. Cuando el animal esté sedado, corte el flujo de isoflurano y administre anestésicos y analgésicos. De acuerdo con el protocolo aprobado de cuidado y uso de animales, aplique clorhidrato de ketamina (80 mg/kg de peso corporal) y clorhidrato de xilacina (5 mg/kg de peso corporal) por vía intraperitoneal.
4. Examine la profundidad de la anestesia 5 min después de la inyección evaluando el reflejo de retirada del pedal.
5. Utilice un ungüento para los ojos (por ejemplo, 0,5 g de Retinolpalmitat) para evitar daños en la córnea.
6. Fije al animal en posición supina con las extremidades extendidas sobre una placa calefactora con cinta adhesiva.
7. Retire el vello de ambas extremidades traseras meticulosamente.
8. Mida la perfusión de las extremidades a través de láser Doppler de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   NOTA: La relación entre el flujo sanguíneo de la extremidad isquémica y el flujo sanguíneo de la extremidad no isquémica debe utilizarse como parámetro principal.

Utilizando este protocolo, se pueden observar y monitorear diferencias significativas en la perfusión de las extremidades traseras después de la intervención de SWT. Las imágenes representativas muestran una marcada diferencia en las extremidades tratadas con SWT (Figura 1B) en comparación con las extremidades de control no tratadas (Figura 1A). Aquí, la perfusión se representa a través de llamaradas térmicas con colores fríos que representan baja perfusión y colores cálidos que representan alta perfusión. La cuantificación de las lecturas de doppler láser muestra un aumento significativo de la perfusión 4 semanas después de la cirugía. (Figura 1C), se puede observar concomitantemente menos necrosis en los animales tratados con SWT (Figura 1D). La necrosis se evaluó como se describió anteriormente¹⁶.

Figura 1: Mejora de la perfusión sanguínea tras la terapia con ondas de choque en un modelo murino de isquemia de las extremidades posteriores. Imágenes representativas de láser Doppler de (A) animales no tratados y (B) extremidades isquémicas 4 semanas después de SW. (C) La cuantificación de las imágenes láser Doppler semanales reveló un aumento de la perfusión de las extremidades después de SWT después de 4 semanas. El flujo sanguíneo se expresa en la relación entre la extremidad isquémica y la extremidad no isquémica. *p < 0,05. (D) La evaluación de la necrosis muestra una mejoría significativa en los animales tratados con terapia con ondas de choque después de 4 semanas. *p < 0,05. Esta figura ha sido modificada a partir de Holfeld et al¹⁵. CTR = control no tratado, SWT = terapia con ondas de choque. Los resultados se expresan como media ± SEM (error estándar de la media). Las comparaciones estadísticas se realizaron mediante la prueba t de Student. Los valores de p <,05 se consideraron estadísticamente significativos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El tratamiento con ondas de choque muestra resultados prometedores en varios entornos de regeneración de tejidos blandos. Sin embargo, para aumentar, mejorar o aislar aún más estas capacidades regenerativas, primero se deben descubrir los conceptos básicos de la regeneración inducida por SWT a nivel molecular. La regeneración de tejidos es compleja e involucra muchos procesos biológicos, incluyendo inmunidad innata y adquirida, inflamación, progresión del ciclo celular, apoptosis, diferenciación celular, angiogénesis y otros^17,18. Los mecanismos aislados de SWT pueden estudiarse in vitro, utilizando una aplicación de baño de agua, pero se quedan cortos para emular de manera integral la regeneración in vivo. Por lo tanto, la investigación correcta de las vías activadas por SWT solo se puede lograr in vivo.

El modelo de ratón de isquemia de las extremidades traseras está bien establecido y es fácil de implementar. Además, muestra una baja tasa de mortalidad y una baja gravedad en comparación con otros medios quirúrgicos para investigar la regeneración de tejidos. Además, el modelo de isquemia de las extremidades traseras proporciona un fácil acceso al tejido tratado para la recolección de tejido u otros medios de evaluación (por ejemplo, evaluación ultrasónica, doppler láser, etc.). Este modelo tiene las siguientes limitaciones. Una limitación importante es la naturaleza aguda de la isquemia inducida por la extirpación de la arteria femoral, mientras que la mayoría de las enfermedades isquémicas son procesos crónicos. Además, debido a la corta edad y a la salud del tejido colateral, los roedores tienden a curarse en gran medida después de la isquemia, incluso sin intervenciones terapéuticas.

La evidencia de los efectos de SWT se obtiene principalmente a través de estudios médicos, pero generalmente carecen de investigación y evaluación en profundidad de los mecanismos moleculares. Un protocolo estandarizado podría, por lo tanto, presentar un medio para que los investigadores comparen su trabajo en torno a la regeneración de SWT. En este sentido, este protocolo fue diseñado para representar una base modificable, fácilmente ajustable a diferentes tejidos, aplicadores de SWT, regímenes de tratamiento o lecturas. En consecuencia, solo unos pocos pasos de este protocolo pueden considerarse cruciales (véase más adelante). Por lo tanto, este protocolo presenta una forma fácil, factible y estandarizada de inducir y estudiar la regeneración a través de la terapia de ondas de choque in vivo.

Pasos cruciales
Como en todos los modelos animales, es crucial evitar infecciones, sufrimiento innecesario de los animales y promover datos limpios y reproducibles. Por lo tanto, los instrumentos deben desinfectarse adecuadamente. Todos los trabajos, incluidos los animales de investigación, deben ser realizados por personas capacitadas y capacitadas. Debe evitarse la insuficiencia de cualquiera de los puntos mencionados. Asegúrese de no mezclar la vena femoral con la arteria. Evite las lesiones musculares térmicas mientras usa la diatermia, ya que podría sesgar los resultados del flujo sanguíneo.

Se recomienda encarecidamente familiarizarse con esta herramienta antes de usarla en un modelo animal. Asegúrese de no afectar al tejido circundante, comprobando dos veces si hay tejido templado en la parte de las pinzas de la diatermia antes de la activación. Al realizar SWT, tenga en cuenta que los diferentes dispositivos SWT funcionan de manera diferente y que la terapia debe realizarse de acuerdo con el manual del usuario del dispositivo utilizado.

Holfeld J. y Grimm M. son accionistas de Heart Regeneration Technologies GmbH, una empresa derivada de la Universidad de Medicina de Innsbruck cuyo objetivo es promover la terapia de ondas de choque cardíacas (www.heart-regeneration.com). Todos los demás autores no tienen nada que revelar.

Este estudio fue apoyado por una beca de investigación AUVA sin restricciones a JH y CGT.