Un modèle murin standardisé de thérapie par ondes de choc extracorporelles induit par la régénération des tissus mous

Cet article décrit un modèle murin standardisé de régénération tissulaire par onde de choc.

La thérapie par ondes de choc (SWT) montre des effets régénérateurs prometteurs dans plusieurs tissus différents. Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents sont mal compris. L’angiogenèse, un processus de formation de nouveaux vaisseaux sanguins, est l’un des principaux moteurs de la régénération des tissus mous ainsi qu’un effet récemment découvert de la SWT. On ne comprend pas entièrement comment le stimulus mécanique de la SWT induit l’angiogenèse et la régénération et quelles voies sont impliquées. Pour améliorer encore l’utilisation clinique de la SWT et obtenir des informations précieuses sur la façon dont la stimulation mécanique peut affecter les tissus et la régénération des tissus, un modèle standardisé de SWT est nécessaire. Nous décrivons par la présente un modèle murin standardisé et facile à mettre en œuvre de régénération induite par la thérapie par ondes de choc, en utilisant le modèle d’ischémie des membres postérieurs.

La thérapie par ondes de choc (SWT) a été introduite pour la première fois dans la pratique clinique comme moyen de désintégrer les calculs rénaux par application extracorporelle. Dans les années 1990, la découverte fortuite d’un épaississement de la crête iliaque dans des enregistrements radiographiques à la suite de lithotripsies répétées a révélé un effet morphogénique osseux de SWT¹. Cela a suscité une vague de nouvelles applications dans l’utilisation orthopédique. SWT, est ainsi devenu une option de traitement reconnue pour les non-consolidation des os longs, l’épicondylite latérale, ainsi que la tendinite d’Achille 2,3,4,5. Des preuves récentes élargissent à nouveau le spectre des appareils au-delà de l’orthopédie, dans les tissus plus mous et les troubles de cicatrisation^des plaies ^6,7. Ici, des études ont pu montrer l’efficacité de la SWT dans un ensemble hétérogène de conditions, y compris, par exemple, la dysfonction érectile ou la spasticité après un AVC ^8,9,10.

Cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents à la SWT ne sont pas encore entièrement compris et nécessitent des recherches supplémentaires. En mettant l’accent sur les maladies cardiovasculaires, nos travaux antérieurs démontrent un effet prometteur de la SWT dans un modèle murin d’infarctus du myocarde. Ainsi, l’angiogenèse a été découverte comme un moteur essentiel de la régénération myocardique après SWT¹¹.

L’angiogenèse décrit le développement de nouveaux vaisseaux par germination et division de vaisseaux préexistants. En cas de blessure, ces nouveaux vaisseaux facilitent le rétablissement du flux sanguin vers la zone endommagée et donc la régénération¹².

L’angiogenèse représente donc une caractéristique de la régénération tissulaire et une explication potentielle des effets de la SWT dans les tissus plus mous. Cependant, la régénération est un processus complexe avec de nombreux mécanismes d’inductance et d’effecteur. Bien qu’il soit possible de les étudier dans un cadre de culture cellulaire isolée, les modèles animaux sont les mieux adaptés pour imiter ces processus complexes. L’ischémie des membres postérieurs est un modèle bien établi pour étudier l’angiogenèse et la régénération in vivo¹³. Pour soutenir la poursuite des recherches sur l’effet régénérateur de la SWT, nous présentons par la présente un modèle murin réalisable et standardisé de la SWT dans l’ischémie des membres postérieurs.

Les expériences ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de médecine d’Innsbruck et par le ministère autrichien des Sciences (BMWF-66.011/0110-V/3b/2019).

1. Induction de l’anesthésie et mise en place opérationnelle

1. Préparez un environnement approprié pour les procédures animales : stérilisez le matériel, désinfectez les surfaces, utilisez des masques jetables, des blouses d’isolement et des gants.
2. Endormir une souris de 18 à 12 semaines (souche et sexe selon le milieu expérimental) dans une chambre fixée à un vaporisateur d’isoflurane à 4 %.
3. Vérifiez si la sédation est suffisante par la pédale ou le réflexe du pavillon de l’oreille comme indicateurs de reconnaissance de la douleur profonde.
4. Lorsque l’animal est suffisamment sédatif, coupez le flux d’isoflurane et administrez l’analgésie et les anesthésiques conformément au protocole approuvé de soins et d’utilisation des animaux, utilisez par exemple du chlorhydrate de kétamine (80 mg/kg de poids corporel) comme anesthésique et du chlorhydrate de xylazine (5 mg/kg de poids corporel) comme analgésique intrapéritonéal.
   REMARQUE : Préparez la seringue avec un médicament intra-péritonéal avant de placer l’animal dans la chambre d’anesthésie.
5. Examinez la profondeur de l’anesthésie 5 minutes après l’injection en évaluant le réflexe de retrait de la pédale.
6. Appliquez une pommade oculaire (par exemple, 0,5 g de rétinolpalmitat) pour éviter d’endommager la cornée.
7. Enlever les poils à l’intérieur et à proximité de la zone chirurgicale, en particulier le membre postérieur gauche et l’aine. La crème dépilatoire peut être utilisée à la place des rasoirs ou des tondeuses pour éviter les blessures cutanées.
8. Fixez l’animal en position couchée avec les membres étendus sur une plaque chauffante à l’aide de ruban adhésif.
9. Désinfectez et nettoyez la zone de chirurgie avec 10 % de povidone iode ou un désinfectant similaire. Utilisez un champ stérile.

2. Procédure

1. Utilisez un microscope avec un grossissement de 10x à 20x pour effectuer la chirurgie.
2. Faites une incision cutanée (~1,5 cm) à proximité de l’articulation du genou à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
3. Séparez doucement la peau des tissus sous-jacents à l’aide d’une pince émoussée.
4. Identifiez les vaisseaux fémoraux. Séparez soigneusement l’artère, la veine et le nerf à l’aide d’une pince et de ciseaux.
5. En commençant par la partie proximale au niveau du ligament inguinal, retirez soigneusement le tissu conjonctif environnant jusqu’à ce que l’artère soit exposée de manière optimale. Comme paramètre distal, la ramification artérielle dans l’artère saphène et poplitée devrait être visible.
6. Lister l’artère fémorale proximale au niveau du ligament inguinal à l’aide d’une suture en polypropylène 7-0.
7. Occlure l’extrémité distale de l’artère fémorale proximale à la ramification en artère saphène et poplitée à l’aide d’une suture en polypropylène 7-0.
8. Exciser le segment de l’artère fémorale entre les nœuds distal et proximal à l’aide de la diathermie.
   REMARQUE : L’excision de l’artère fémorale par coupe avec des ciseaux chirurgicaux est également possible. Cependant, l’utilisation d’une diathermie obstrue le vaisseau en plus de la suture en cas d’échec des nœuds.
9. Assurez-vous que l’artère fémorale est obstruée en toute sécurité et qu’aucun saignement n’est visible sur le terrain de l’opération.
   REMARQUE : Une distance étroite entre les sutures cutanées est recommandée pour éviter la décontamination de la plaie par gel par ultrasons lors de l’application SWT.
10. Suturez l’incision cutanée à l’aide de sutures en nylon non résorbables 5-0 avec des nœuds simples.
11. Désinfectez la zone chirurgicale à l’aide de cotons-tiges.

3. Application de la thérapie par ondes de choc

1. Assurez-vous que l’incision cutanée est complètement fermée.
2. Définir les paramètres de traitement de l’appareil à ondes de choc. Dans ce cadre expérimental, une densité de flux d’énergie de 0,1 mJ/^mm2 à une fréquence de 3 Hz pour un total de 300 impulsions a été utilisée.
   REMARQUE : Les niveaux d’énergie ont été adoptés des résultats précédents¹⁴ en utilisant un traitement par ondes de choc extracorporelles ciblées.
3. Appliquez du gel à ultrasons sur la zone de traitement à l’intérieur de la cuisse pour un bon couplage.
4. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air n’est piégée dans le gel.
   REMARQUE : Un couplage approprié avec suffisamment de gel est essentiel pour une application adéquate de SWT. De petites bulles d’air à l’intérieur du gel absorberont les ondes de choc et diminueront leur effet.
5. Appliquez 300 impulsions en basculant la pédale tout en déplaçant lentement l’applicateur sur la cuisse.
   REMARQUE : Si SWT n’est pas appliqué immédiatement après la chirurgie, évitez une éventuelle absorption d’énergie par ondes de choc due à la repousse des cheveux par l’épilation avant le traitement.
6. Après le traitement, essuyez tout gel à ultrasons résiduel pour éviter le refroidissement de la cuisse.
7. Placez l’animal dans une cage de récupération exposée à une lampe chauffante pour éviter l’hypothermie.
8. Surveillez attentivement l’animal jusqu’à ce qu’il soit réveillé et administrez-lui une dose de 0,05 mg/kg de poids corporel de buprénorphine, par voie sous-cutanée, pour une analgésie adéquate.
9. Surveillez quotidiennement la santé et le bien-être des animaux jusqu’à ce que l’incision chirurgicale soit complètement guérie.
   REMARQUE : Le traitement peut être limité à une séance ou être répété plusieurs fois. Dans cet exemple, une seule application a été exécutée.

4. Mesure du débit sanguin

1. Effectuer une mesure du débit sanguin immédiatement après l’opération et à différents moments par la suite en fonction du cadre expérimental.
2. Endormir l’animal dans une chambre fixée à un vaporisateur d’isoflurane à 4 %.
3. Lorsque l’animal est sous sédation, coupez le flux d’isoflurane et administrez des anesthésiques et des analgésiques. Conformément au protocole approuvé de soin et d’utilisation des animaux, appliquer du chlorhydrate de kétamine (80 mg/kg de poids corporel) et du chlorhydrate de xylazine (5 mg/kg de poids corporel) par voie intrapéritonéale.
4. Examinez la profondeur de l’anesthésie 5 min après l’injection en évaluant le réflexe de retrait de la pédale.
5. Utilisez une pommade oculaire (par exemple, 0,5 g de rétinolpalmitat) pour éviter les lésions cornéennes.
6. Fixez l’animal en position couchée avec les membres étendus sur une plaque chauffante à l’aide de ruban adhésif.
7. Retirez méticuleusement les poils des deux membres postérieurs.
8. Mesurez la perfusion des membres à l’aide d’un doppler laser selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE : Le rapport entre le débit sanguin du membre ischémique et celui du membre non ischémique doit être utilisé comme paramètre principal.

En utilisant ce protocole, des différences significatives dans la perfusion des membres postérieurs peuvent être observées et surveillées après l’intervention SWT. Des images représentatives montrent une différence marquée entre les membres traités par SWT (figure 1B) et les membres témoins non traités (figure 1A). Ici, la perfusion est représentée par un torchage thermique, les couleurs froides représentant une faible perfusion et les couleurs chaudes représentant une forte perfusion. La quantification des lectures laser Doppler montre une augmentation significative de la perfusion 4 semaines après l’opération. (Figure 1C), une nécrose concomitante moindre peut être observée chez les animaux traités par SWT (Figure 1D). La nécrose a été évaluée comme décrit précédemment¹⁶.

Figure 1 : Amélioration de la perfusion sanguine lors de la thérapie par ondes de choc dans un modèle murin d’ischémie des membres postérieurs. Des images doppler laser représentatives de (A) l’animal non traité et (B) des membres ischémiques 4 semaines après SW. (C) La quantification de l’imagerie laser Doppler réalisée chaque semaine a révélé une augmentation de la perfusion des membres lors de la SWT après 4 semaines. Le flux sanguin est exprimé dans le rapport entre le membre ischémique et le membre non ischémique. *p < 0,05. (D) L’évaluation de la nécrose montre une amélioration significative chez les animaux traités par thérapie par ondes de choc après 4 semaines. *p < 0,05. Cette figure a été modifiée à partir de Holfeld et al¹⁵. CTR = contrôle non traité, SWT = thérapie par ondes de choc. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SEM (erreur type de la moyenne). Des comparaisons statistiques ont été effectuées par le test t de l’élève. Les valeurs p <,05 ont été considérées comme statistiquement significatives. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Le traitement par ondes de choc donne des résultats prometteurs dans plusieurs contextes de régénération des tissus mous. Cependant, pour augmenter, améliorer ou isoler davantage ces capacités de régénération, il faut d’abord découvrir les bases de la régénération induite par la SWT au niveau moléculaire. La régénération tissulaire est complexe et implique de nombreux processus biologiques, notamment l’immunité innée et acquise, l’inflammation, la progression du cycle cellulaire, l’apoptose, la différenciation cellulaire, l’angiogenèse et d’autres^17,18. Les mécanismes isolés de la SWT peuvent être étudiés in vitro, en utilisant une application de bain d’eau, mais ne parviennent pas à émuler complètement la régénération in vivo. Ainsi, l’étude correcte des voies activées par SWT ne peut être réalisée qu’in vivo.

Le modèle murin d’ischémie des membres postérieurs est bien établi, facile à mettre en œuvre. De plus, il montre un faible taux de mortalité et une faible gravité par rapport à d’autres moyens chirurgicaux d’étudier la régénération tissulaire. De plus, le modèle d’ischémie des membres postérieurs permet d’accéder facilement aux tissus traités pour le prélèvement de tissus ou d’autres moyens d’évaluation (par exemple, évaluation par ultrasons, laser Doppler, etc.). Ce modèle présente les limitations suivantes. L’une des principales limitations est la nature aiguë de l’ischémie induite par l’ablation de l’artère fémorale, alors que la plupart des maladies ischémiques sont des processus chroniques. De plus, en raison de leur jeune âge et de leurs tissus collatéraux sains, les rongeurs ont tendance à guérir dans une large mesure après une ischémie, même en l’absence d’interventions thérapeutiques.

Les preuves des effets de la SWT sont principalement obtenues par le biais d’études médicales, mais manquent généralement de recherches approfondies et d’évaluation des mécanismes moléculaires. Un protocole standardisé pourrait ainsi permettre aux chercheurs de comparer leurs travaux sur la régénération des SWT. À cet égard, ce protocole a été conçu pour représenter une base modifiable, facilement ajustable à différents tissus, applicateurs SWT, régimes de traitement ou lectures. Par conséquent, seules quelques étapes de ce protocole peuvent être considérées comme cruciales (voir ci-dessous). Ce protocole présente donc un moyen facile, réalisable et standardisé d’induire et d’étudier la régénération par thérapie par ondes de choc in vivo.

Étapes cruciales
Comme dans tous les modèles animaux, il est crucial d’éviter les infections, les souffrances inutiles des animaux et de promouvoir des données propres et reproductibles. Par conséquent, les instruments doivent être désinfectés correctement. Tous les travaux, y compris les animaux de recherche, doivent être effectués par des personnes compétentes et formées. L’insuffisance de l’un ou l’autre des points mentionnés doit être évitée. Assurez-vous de ne pas confondre la veine fémorale avec l’artère. Évitez les blessures musculaires thermiques lors de l’utilisation de la diathermie, car cela pourrait biaiser les résultats de la circulation sanguine.

Il est fortement recommandé de se familiariser avec cet outil avant de l’utiliser dans un modèle animal. Assurez-vous de ne pas affecter les tissus environnants, en vérifiant qu’il n’y a pas de tissu trempé dans la partie forceps de la diathermie avant l’activation. Lorsque vous effectuez une SWT, gardez à l’esprit que différents appareils SWT fonctionnent différemment et que le traitement doit être effectué conformément au manuel d’utilisation de l’appareil utilisé.

Holfeld J. et Grimm M. sont actionnaires de Heart Regeneration Technologies GmbH, une spin-off de l’Université de médecine d’Innsbruck visant à promouvoir la thérapie par ondes de choc cardiaques (www.heart-regeneration.com). Tous les autres auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette étude a été soutenue par une subvention de recherche AUVA sans restriction à JH et CGT.