Ein standardisiertes Mausmodell der extrakorporalen Stoßwellentherapie-induzierten Weichteilregeneration

Dieser Artikel beschreibt ein standardisiertes Mausmodell der Geweberegeneration mittels Stoßwellenbehandlung.

Die Stoßwellentherapie (SWT) zeigt vielversprechende regenerative Effekte in verschiedenen Geweben. Die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen sind jedoch nur unzureichend verstanden. Die Angiogenese, ein Prozess der Bildung neuer Blutgefäße, ist ein führender Treiber der Regeneration in weicheren Geweben sowie eine kürzlich entdeckte Wirkung von SWT. Wie der mechanische Stimulus der SWT die Angiogenese und Regeneration induziert und welche Signalwege daran beteiligt sind, ist nicht vollständig verstanden. Um den klinischen Einsatz von SWT weiter zu verbessern und wertvolle Informationen darüber zu gewinnen, wie sich mechanische Stimulation auf das Gewebe und die Geweberegeneration auswirken kann, wird ein standardisiertes Modell der SWT benötigt. Wir beschreiben hiermit ein standardisiertes, einfach zu implementierendes Mausmodell der Stoßwellentherapie-induzierten Regeneration unter Verwendung des Ischämiemodells der Hintergliedmaßen.

Die Stoßwellentherapie (SWT) wurde erstmals in der klinischen Praxis als Mittel zum Zerfall von Nierensteinen durch extrakorporale Anwendung eingeführt. In den 1990er Jahren ergab ein zufälliger Befund einer Verdickung des Beckenkamms in Röntgenaufnahmen nach wiederholter Lithotripsie eine knochenmorphogene Wirkung von SWT¹. Dies führte zu einer Flut neuer Anwendungen in der Orthopädie. SWT hat sich damit zu einer anerkannten Behandlungsoption für Pseudarthrosen aus dem Langen Knochen, laterale Epicondylitis sowie Achillessehnenentzündung^entwickelt 2,3,4,5. Neuere Erkenntnisse erweitern nun wieder das Spektrum der Apparaturen über die Orthopädie hinaus auf weichere Gewebe und Wundheilungsstörungen ^6,7. Hier konnten Studien die Wirksamkeit von SWT bei einer heterogenen Ansammlung von Erkrankungen zeigen, darunter z.B. erektile Dysfunktion oder Spastik nach Schlaganfall ^8,9,10.

Die molekularen Mechanismen, die der SWT zugrunde liegen, sind jedoch noch nicht vollständig verstanden und bedürfen weiterer Forschung. Mit dem Schwerpunkt auf kardiovaskulären Erkrankungen zeigen unsere bisherigen Arbeiten einen vielversprechenden Effekt von SWT in einem Mausmodell des Myokardinfarkts. Dabei wurde die Angiogenese als zentraler Treiber der Myokardregeneration nach SWT¹¹ entdeckt.

Die Angiogenese beschreibt die Entwicklung neuer Gefäße durch Keimen und Spalten bereits vorhandener Gefäße. Im Falle einer Verletzung erleichtern diese neuen Gefäße die Wiederherstellung der Durchblutung des geschädigten Bereichs und damit die Regeneration¹².

Die Angiogenese stellt daher ein Kennzeichen der Geweberegeneration und eine mögliche Erklärung für SWT-Effekte in weicheren Geweben dar. Die Regeneration ist jedoch ein komplexer Prozess mit zahlreichen Induktor- und Effektormechanismen. Trotz der Möglichkeit, sie in einer isolierten Zellkultur zu untersuchen, sind Tiermodelle am besten geeignet, um diese komplexen Prozesse nachzubilden. Die Ischämie der Hintergliedmaßen ist ein gut etabliertes Modell zur Untersuchung der Angiogenese und Regeneration in vivo¹³. Um die weitere Erforschung der regenerativen Wirkung von SWT zu unterstützen, stellen wir hiermit ein praktikables, standardisiertes, murines Modell der SWT bei Ischämie der hinteren Gliedmaßen vor.

Die Versuche wurden von der institutionellen Kommission für Tierpflege und -nutzung der Medizinischen Universität Innsbruck und vom österreichischen Wissenschaftsministerium genehmigt (BMWF-66.011/0110-V/3b/2019).

1. Einleitung der Narkose und Betriebseinrichtung

1. Bereiten Sie eine geeignete Umgebung für Tiereingriffe vor: Sterilisieren Sie Geräte, desinfizieren Sie Oberflächen, verwenden Sie Einwegmasken, Isolationskittel und Handschuhe.
2. Betäuben Sie eine 18-12 Wochen alte Maus (Stamm und Geschlecht je nach Versuchsumgebung) in einer Kammer, die an einen Isofluran-Verdampfer angeschlossen ist, bei 4%.
3. Achten Sie auf eine ausreichende Sedierung über Pedal oder Ohrmuschelreflex als Indikatoren für die tiefe Schmerzerkennung.
4. Wenn das Tier ausreichend sediert ist, schalten Sie den Isofluranfluss aus und verabreichen Sie Analgesie und Anästhetika gemäß dem zugelassenen Tierpflege- und Verwendungsprotokoll, z. B. Ketaminhydrochlorid (80 mg/kg Körpergewicht) als Anästhetikum und Xylazinhydrochlorid (5 mg/kg Körpergewicht) als intraperitoneales Analgetikum.
   HINWEIS: Bereiten Sie die Spritze mit intraperitonealer Medikation vor, bevor Sie das Tier in die Anästhesiekammer legen.
5. Untersuchen Sie die Tiefe der Anästhesie 5 Minuten nach der Injektion, indem Sie den Pedalentzugsreflex beurteilen.
6. Tragen Sie eine Augensalbe (z. B. 0,5 g Retinolpalmitat) auf, um Hornhautschäden zu vermeiden.
7. Entfernen Sie Haare in und in der Nähe des Operationsbereichs, insbesondere der linken Hintergliedmaße und der Leiste. Enthaarungscreme kann anstelle von Rasierern oder Trimmern verwendet werden, um Hautverletzungen zu vermeiden.
8. Fixieren Sie das Tier in Rückenlage mit ausgestreckten Gliedmaßen mit Klebeband auf einer Heizplatte.
9. Desinfizieren und reinigen Sie den OP-Bereich mit 10% Povidon-Jod oder ähnlichem Desinfektionsmittel. Verwenden Sie ein steriles Feldtuch.

2. Vorgehensweise

1. Verwenden Sie ein Mikroskop zwischen 10- und 20-facher Vergrößerung, um die Operation durchzuführen.
2. Machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen Hautschnitt (~1,5 cm) proximal zum Kniegelenk.
3. Trennen Sie die Haut vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette vom darunterliegenden Gewebe.
4. Identifiziere die Oberschenkelgefäße. Trennen Sie Arterie, Vene und Nerv vorsichtig mit Pinzette und Schere.
5. Proximal beginnend auf Höhe des Leistenbandes das umgebende Bindegewebe vorsichtig entfernen, bis die Arterie optimal dargestellt ist. Als distaler Endpunkt sollte die arterielle Verzweigung in die Arteria saphena und die Arteria poplitea sichtbar sein.
6. Lilizieren Sie die Arteria femoralis proximalis auf Höhe des Leistenbandes mit einer 7-0-Polypropylen-Naht.
7. Verschluss des distalen Endes der Arteria femoralis proximal der Verzweigung in die Arteria saphena und Poplitea mit einer 7-0 Polypropylen-Naht.
8. Das Segment der Arteria femoralis zwischen den distalen und proximalen Knoten wird mit Hilfe der Diathermie herausgeschnitten.
   HINWEIS: Das Exzidieren der Oberschenkelarterie durch Schneiden mit einer chirurgischen Schere ist ebenfalls möglich. Bei Verwendung einer Diathermie wird jedoch zusätzlich zur Naht auch das Gefäß verschlossen, falls die Knoten versagen.
9. Stellen Sie sicher, dass die Oberschenkelarterie sicher verschlossen ist und keine Blutungen im Operationsfeld sichtbar sind.
   HINWEIS: Es wird ein geringer Abstand zwischen den Hautnähten empfohlen, um eine Dekontamination der Wunde durch Ultraschallgel während der SWT-Anwendung zu vermeiden.
10. Vernähen Sie den Hautschnitt mit 5-0 nicht resorbierbaren Nylonnähten mit einfachen Knoten.
11. Desinfizieren Sie den Operationsbereich mit Wattestäbchen.

3. Anwendung der Stoßwellentherapie

1. Stellen Sie sicher, dass der Hautschnitt vollständig geschlossen ist.
2. Definieren Sie die Behandlungsparameter am Stoßwellengerät. In diesem Versuchsaufbau wurde eine Energieflussdichte von 0,1 mJ/^mm2 bei einer Frequenz von 3 Hz für insgesamt 300 Impulse verwendet.
   HINWEIS: Die Energieniveaus wurden aus früheren Ergebnissen¹⁴ unter Verwendung einer fokussierten extrakorporalen Stoßwellenbehandlung übernommen.
3. Tragen Sie Ultraschallgel auf den Behandlungsbereich an der Innenseite des Oberschenkels auf, um eine korrekte Kopplung zu gewährleisten.
4. Stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen im Gel eingeschlossen sind.
   HINWEIS: Die richtige Kopplung mit ausreichend Gel ist für eine adäquate SWT-Anwendung unerlässlich. Kleine Luftbläschen im Inneren des Gels absorbieren Stoßwellen und verringern deren Wirkung.
5. Wenden Sie 300 Impulse an, indem Sie den Fußschalter umschalten, während Sie den Applikator langsam über den Oberschenkel bewegen.
   HINWEIS: Wenn SWT nicht unmittelbar nach der Operation angewendet wird, vermeiden Sie eine mögliche Absorption von Stoßwellenenergie durch nachgewachsenes Haar, indem Sie es vor der Behandlung entfernen.
6. Wischen Sie nach der Behandlung alle Reste des Ultraschallgels ab, um ein Abkühlen des Oberschenkels zu verhindern.
7. Bringen Sie das Tier in einen Auffangkäfig, der einer Heizlampe ausgesetzt ist, um Unterkühlung zu vermeiden.
8. Überwachen Sie das Tier sorgfältig, bis es wach ist, und verabreichen Sie eine Dosis von 0,05 mg/kg Körpergewicht Buprenorphin subkutan, um eine angemessene Analgesie zu gewährleisten.
9. Überwachen Sie täglich die Gesundheit und das Wohlbefinden der Tiere, bis der chirurgische Schnitt vollständig verheilt ist.
   HINWEIS: Die Behandlung kann auf eine Sitzung beschränkt oder mehrmals wiederholt werden. In diesem Beispiel wurde eine einzelne Anwendung ausgeführt.

4. Messung des Blutflusses

1. Führen Sie die Blutflussmessung unmittelbar nach der Operation und je nach Versuchsumgebung zu verschiedenen Zeitpunkten danach durch.
2. Sedieren Sie das Tier in einer Kammer, die an einem Isofluran-Verdampfer befestigt ist, bei 4%.
3. Wenn das Tier sediert ist, schalten Sie den Isofluranfluss aus und verabreichen Sie Anästhetika und Analgetika. Gemäß dem genehmigten Tierpflege- und Verwendungsprotokoll Ketaminhydrochlorid (80 mg/kg Körpergewicht) und Xylazinhydrochlorid (5 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal auftragen.
4. Untersuchen Sie die Narkosetiefe 5 Minuten nach der Injektion, indem Sie den Pedalrückzugsreflex beurteilen.
5. Verwenden Sie Augensalbe (z. B. 0,5 g Retinolpalmitat), um Hornhautschäden zu vermeiden.
6. Fixieren Sie das Tier in Rückenlage mit ausgestreckten Gliedmaßen mit Klebeband auf einer Heizplatte.
7. Entfernen Sie sorgfältig Haare von beiden Hintergliedmaßen.
8. Messen Sie die Perfusion der Gliedmaßen mittels Laserdoppler nach Herstellerangabe.
   HINWEIS: Als Primparameter sollte das Verhältnis des Blutflusses der ischämischen Gliedmaßen zu den nicht-ischämischen Gliedmaßen verwendet werden.

Mit Hilfe dieses Protokolls können signifikante Unterschiede in der Perfusion der hinteren Gliedmaßen nach SWT-Intervention beobachtet und überwacht werden. Repräsentative Bilder zeigen einen deutlichen Unterschied bei den mit SWT behandelten Gliedmaßen (Abbildung 1B) im Vergleich zu unbehandelten Kontrollgliedmaßen (Abbildung 1A). Hier wird die Perfusion durch thermisches Auffackeln dargestellt, wobei kalte Farben für geringe Perfusion und warme Farben für hohe Perfusion stehen. Die Quantifizierung der Laser-Doppler-Messwerte zeigt eine signifikante Steigerung der Perfusion 4 Wochen nach der Operation. (Abbildung 1C), Gleichzeitig kann bei SWT-behandelten Tieren eine geringere Nekrose beobachtet werden (Abbildung 1D). Die Nekrose wurde wie zuvor beschrieben beurteilt¹⁶.

Abbildung 1: Verbesserung der Durchblutung nach Stoßwellentherapie in einem murinen Modell der Ischämie der Hintergliedmaßen. Repräsentative Laser-Doppler-Bilder von (A) unbehandelten Tieren und (B) ischämischen Gliedmaßen 4 Wochen nach SW. (C) Die Quantifizierung der wöchentlich durchgeführten Laser-Doppler-Bildgebung ergab eine erhöhte Perfusion der Gliedmaßen nach SWT nach 4 Wochen. Der Blutfluss wird im Verhältnis zwischen ischämischen Gliedmaßen und nicht ischämischen Gliedmaßen ausgedrückt. *p < 0,05. (D) Die Bewertung der Nekrose zeigt eine signifikante Verbesserung bei Tieren, die nach 4 Wochen mit einer Stoßwellentherapie behandelt wurden. *p < 0,05. Diese Abbildung wurde von Holfeld et al.¹⁵ modifiziert. CTR = unbehandelte Kontrolle, SWT = Stoßwellentherapie. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM (Standardfehler des Mittelwerts) ausgedrückt. Statistische Vergleiche wurden mit dem t-Test der Studierenden durchgeführt. P-Werte <,05 wurden als statistisch signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Stoßwellenbehandlung zeigt vielversprechende Ergebnisse in verschiedenen Bereichen der Weichteilregeneration. Um diese Regenerationsfähigkeit jedoch weiter zu verstärken, zu verbessern oder zu isolieren, sollten zunächst die Grundlagen der SWT-induzierten Regeneration auf molekularer Ebene aufgedeckt werden. Die Geweberegeneration ist komplex und umfasst viele biologische Prozesse, darunter angeborene und erworbene Immunität, Entzündungen, Zellzyklusprogression, Apoptose, zelluläre Differenzierung, Angiogenese und andere^17,18. Isolierte Mechanismen der SWT können in vitro unter Verwendung einer Wasserbadanwendung untersucht werden, reichen jedoch nicht aus, um die In-vivo-Regeneration umfassend zu emulieren. Dabei kann die korrekte Untersuchung der durch SWT aktivierten Signalwege nur in vivo erreicht werden.

Das Modell der Ischämie-Maus der Hintergliedmaßen ist gut etabliert und einfach zu implementieren. Darüber hinaus zeigt es eine niedrige Mortalitätsrate und einen geringen Schweregrad im Vergleich zu anderen chirurgischen Mitteln zur Untersuchung der Geweberegeneration. Darüber hinaus bietet das Ischämie-Modell der hinteren Gliedmaßen einen einfachen Zugang zu behandeltem Gewebe für die Gewebeentnahme oder andere Mittel zur Bewertung (z. B. Ultraschalluntersuchung, Laserdoppler usw.). Für dieses Modell gelten die folgenden Einschränkungen. Eine wesentliche Einschränkung ist die akute Natur der Ischämie, die durch die Entfernung der Oberschenkelarterie induziert wird, während die meisten ischämischen Erkrankungen chronische Prozesse sind. Darüber hinaus neigen Nagetiere aufgrund ihres jungen Alters und ihres gesunden Kollateralgewebes dazu, nach einer Ischämie auch ohne therapeutische Eingriffe weitgehend zu heilen.

Die Evidenz für die Wirkung von SWT wird meist durch medizinische Studien gewonnen, aber es fehlt in der Regel an eingehender Forschung und Bewertung der molekularen Mechanismen. Ein standardisiertes Protokoll könnte den Forschern somit die Möglichkeit bieten, ihre Arbeit rund um die SWT-Regeneration zu vergleichen. In dieser Hinsicht wurde dieses Protokoll so konzipiert, dass es eine modifizierbare Grundlage darstellt, die leicht an verschiedene Gewebe, SWT-Applikatoren, Behandlungsschemata oder Messwerte angepasst werden kann. Dementsprechend können nur wenige Schritte in diesem Protokoll als entscheidend angesehen werden (siehe unten). Dieses Protokoll stellt somit eine einfache, praktikable und standardisierte Möglichkeit dar, die Regeneration mittels Stoßwellentherapie in vivo zu induzieren und zu untersuchen.

Entscheidende Schritte
Wie bei allen Tiermodellen ist es entscheidend, Infektionen und unnötiges Leiden der Tiere zu vermeiden und reproduzierbare saubere Daten zu fördern. Daher sollten Instrumente ordnungsgemäß desinfiziert werden. Alle Arbeiten, einschließlich Versuchstiere, sollten von fähigen, geschulten Personen ausgeführt werden. Eine Unzulänglichkeit der genannten Punkte ist zu vermeiden. Achten Sie darauf, die Oberschenkelvene nicht mit der Arterie zu verwechseln. Vermeiden Sie thermische Muskelverletzungen, während Sie die Diathermie verwenden, da dies die Ergebnisse des Blutflusses beeinträchtigen könnte.

Es wird dringend empfohlen, sich vor dem Einsatz im Tiermodell mit diesem Werkzeug vertraut zu machen. Achten Sie darauf, das umgebende Gewebe nicht zu beeinträchtigen, indem Sie vor der Aktivierung im Pinzettenteil der Diathermie nach abgeschrecktem Gewebe suchen. Beachten Sie bei der Durchführung der SWT, dass verschiedene SWT-Geräte unterschiedlich funktionieren und dass die Therapie in Übereinstimmung mit der Bedienungsanleitung des verwendeten Geräts durchgeführt werden sollte.

Holfeld J. und Grimm M. sind Gesellschafter der Heart Regeneration Technologies GmbH, einer Ausgründung der Medizinischen Universität Innsbruck zur Förderung der kardialen Stoßwellentherapie (www.heart-regeneration.com). Alle anderen Autoren haben nichts offenzulegen.

Diese Studie wurde durch ein uneingeschränktes AUVA-Forschungsstipendium an JH und CGT unterstützt.