体外冲击波疗法诱导软组织再生的标准化小鼠模型

本文介绍了一种通过冲击波处理进行组织再生的标准化小鼠模型。

冲击波疗法 （SWT） 在几种不同的组织中显示出有希望的再生效果。然而，对潜在的分子机制知之甚少。血管生成是新血管形成的过程，是较软组织再生的主要驱动力，也是最近发现的 SWT 作用。SWT 的机械刺激如何诱导血管生成和再生以及涉及哪些途径尚不完全清楚。为了进一步改善 SWT 的临床使用并获得有关机械刺激如何影响组织和组织再生的宝贵信息，需要一个标准化的 SWT 模型。我们在此描述了一种标准化的、易于实施的冲击波疗法诱导再生的小鼠模型，利用后肢缺血模型。

冲击波疗法 （SWT） 最初是在临床实践中引入的，作为一种通过体外应用分解肾结石的方法。在 1990 年代，在反复碎石术后的 X 射线记录中偶然发现髂嵴增厚，揭示了 SWT¹ 的骨形态发生作用。这促使骨科应用的新应用激增。SWT 因此演变成公认的长骨不连、外上髁炎以及跟腱炎的治疗选择 2,3,4,5。现在，最近的证据再次将矫治器的范围从骨科扩展到较软的组织和伤口愈合障碍 ^6,7。在这里，研究可以显示 SWT 在异质性组合中的有效性，例如，中风后勃起功能障碍或痉挛 ^8,9,10。

然而，SWT 的分子机制仍未完全了解，需要进一步研究。我们之前的工作以心血管疾病为重点，证明了 SWT 在心肌梗死小鼠模型中的有希望的效果。因此，发现血管生成是 SWT¹¹ 后心肌再生的核心驱动因素。

血管生成描述了通过先前存在的血管的发芽和分裂而形成新血管。在受伤的情况下，这些新血管有助于恢复流向受损区域的血流，从而促进再生¹²。

因此，血管生成代表了组织再生的标志，也是较软组织中 SWT 效应的潜在解释。然而，再生是一个复杂的过程，具有许多感应器和效应器机制。尽管可以在分离的细胞培养环境中研究它们，但动物模型最适合模拟这些复杂的过程。后肢缺血是研究体内血管生成和再生的成熟模型 ¹³。为了支持对 SWT 再生作用的进一步研究，我们特此提出一种可行的、标准化的 SWT 小鼠模型在后肢缺血中的作用。

这些实验得到了因斯布鲁克医科大学机构动物护理和使用委员会和奥地利科学部 （BMWF-66.011/0110-V/3b/2019） 的批准。

1. 麻醉诱导和手术设置

1. 为动物程序准备合适的环境：对设备进行消毒，对表面进行消毒，使用一次性口罩、隔离衣和手套。
2. 在 4% 的异氟醚蒸发器上连接的腔室中镇静 18-12 周龄的小鼠（品系和性别取决于实验设置）。
3. 通过踏板或耳廓反射检查镇静是否足够，作为深部疼痛识别的指标。
4. 当动物得到充分镇静时，关闭异氟醚流并根据批准的动物护理和使用方案使用镇痛和麻醉剂，例如，盐酸氯胺酮（80 mg/kg 体重）作为麻醉剂和盐酸甲苯噻嗪（5 mg/kg 体重）作为腹膜内镇痛剂。
   注意：在将动物放入麻醉室之前，请准备装有腹膜内药物的注射器。
5. 通过评估踏板撤退反射，检查注射后 5 分钟的麻醉深度。
6. 涂抹眼药膏（例如 0.5 克视黄醇棕榈油）以避免角膜损伤。
7. 去除手术区域内部和附近的毛发，尤其是左后肢和腹股沟。可以使用脱毛霜代替剃须刀或修剪器，以避免皮肤受伤。
8. 使用胶带将动物固定在仰卧位，四肢伸展在加热板上。
9. 用 10% 聚维酮碘或类似消毒剂对手术区域进行消毒和清洁。使用无菌现场覆盖。

2.作步骤

1. 使用 10 倍到 20 倍放大倍率的显微镜进行手术。
2. 使用手术剪刀在膝关节近端做一个皮肤切口 （~1.5 cm）。
3. 使用钝镊子轻轻地将皮肤与皮下组织分开。
4. 识别股血管。使用镊子和剪刀小心分离动脉、静脉和神经。
5. 从腹股沟韧带水平的近端开始，小心地去除周围的结缔组织，直到动脉处于最佳状态。作为远端终点，应可以看到分支到大隐动脉和腘动脉的动脉。
6. 使用 7-0 聚丙烯缝合线在腹股沟韧带水平结扎股动脉近端动脉。
7. 使用 7-0 聚丙烯缝合线闭塞股动脉远端，靠近分支进入大隐动脉和腘动脉。
8. 使用透热疗法切除远端和近端结之间的股动脉段。
   注意：也可以通过用手术剪刀切割来切除股动脉。然而，使用透热疗法除了缝合外，还会阻塞血管，以防打结失败。
9. 确保股动脉安全闭塞，并且在手术区域内看不到出血。
   注意：建议皮肤缝合线之间的距离较窄，以避免在 SWT 应用期间对伤口进行超声波凝胶去污。
10. 使用 5-0 单结不可吸收尼龙缝合线缝合皮肤切口。
11. 用棉签对手术区域进行消毒。

3. 冲击波疗法应用

1. 确保皮肤切口完全闭合。
2. 在 Shockwave 设备上定义治疗参数。在这个实验设置中，在 3 Hz 的频率下使用了 0.1 mJ/mm² 的能量通量密度，总共 300 个脉冲。
   注意：能量水平采用之前的结果¹⁴ 使用聚焦体外冲击波治疗。
3. 将超声波凝胶涂抹在大腿内侧的治疗区域，以正确连接。
4. 确保凝胶内没有气泡。
   注意：与足够的凝胶正确偶联对于适当的 SWT 应用至关重要。凝胶内的小气泡会吸收冲击波并降低其效果。
5. 通过切换脚踏开关施加 300 次脉冲，同时在大腿上缓慢移动涂抹器。
   注意：如果手术后没有立即应用 SWT，请在治疗前去除毛发，以避免因重新长出的头发而可能产生的冲击波能量吸收。
6. 治疗后，擦去任何残留的超声波凝胶，以防止大腿冷却。
7. 将动物移入暴露在加热灯下的恢复笼中，以避免体温过低。
8. 仔细监测动物直至醒来，并皮下注射 0.05 mg/kg 体重的丁丙诺啡，以充分镇痛。
9. 每天监测动物的健康状况，直到手术切口完全愈合。
   注意：治疗可以仅限于一次治疗或多次重复。在此示例中，执行了单个应用程序。

4. 血流测量

1. 手术后立即进行血流测量，并在手术后的不同时间点进行血流测量，具体取决于实验设置。
2. 在连接到 4% 异氟醚蒸发器的腔室中对动物进行镇静。
3. 当动物被镇静时，关闭异氟醚流动并给予麻醉剂和镇痛药。根据批准的动物护理和使用方案，腹膜内涂抹盐酸氯胺酮（80 mg/kg 体重）和盐酸甲苯噻嗪（5 mg/kg 体重）。
4. 通过评估踏板撤退反射，检查注射后 5 分钟的麻醉深度。
5. 使用眼药膏（例如 0.5 g 视黄醇棕榈油）以避免角膜损伤。
6. 使用胶带将动物固定在仰卧位，四肢伸展在加热板上。
7. 小心翼翼地去除双后肢的毛发。
8. 根据制造商的说明通过激光多普勒测量肢体灌注。
   注意：缺血性肢体与非缺血性肢体血流的比率应作为主要参数。

利用该方案，可以在 SWT 干预后观察和监测后肢灌注的显着差异。代表性图像显示，与未处理的对照肢体（图 1A）相比，用 SWT 治疗的肢体（图 1B）存在显着差异。在这里，灌注是通过热扩口描绘的，冷色代表低灌注，暖色代表高灌注。激光多普勒读数的量化显示手术后 4 周灌注显着增加。（图 1C），在 SWT 处理的动物中可以观察到较少的坏死（图 1D）。坏死评估如前所述¹⁶.

图 1：后肢缺血小鼠模型冲击波治疗后血液灌注的改善。 SW 后 4 周 （A） 未经治疗的动物和 （B） 缺血肢体的代表性激光多普勒图像。（C） 每周进行的激光多普勒成像的量化显示 4 周后 SWT 时肢体灌注增加。血流以缺血肢体与非缺血肢体的比率表示。*p < 0.05。（D） 坏死评估显示 4 周后接受冲击波疗法治疗的动物有显着改善。*p < 0.05。该图是从 Holfeld 等人¹⁵ 修改而来的。CTR = 未治疗的对照，SWT = 冲击波疗法。结果表示为 SEM ±平均值（平均值的标准误差）。通过学生的 t 检验进行统计比较。P 值 <.05 被认为具有统计学意义。 请单击此处查看此图的较大版本。

冲击波治疗在几种软组织再生环境中显示出有希望的结果。然而，为了进一步增强、改进或隔离这些再生能力，首先应在分子水平上揭示 SWT 诱导再生的基础知识。组织再生很复杂，涉及许多生物过程，包括先天免疫和获得性免疫、炎症、细胞周期进程、细胞凋亡、细胞分化、血管生成等^17,18。SWT 的孤立机制可以利用水浴应用在体外进行研究，但无法全面模拟体内再生。因此，对 SWT 激活的通路的正确研究只能在体内实现。

后肢缺血小鼠模型已经建立起来，易于实施。此外，与其他研究组织再生的手术方法相比，它显示出低死亡率和低严重程度。此外，后肢缺血模型提供了对处理过的组织进行组织采集或其他评估手段（例如，超声评估、激光多普勒等）的便捷访问。此模型具有以下限制。一个主要限制是切除股动脉引起的缺血的急性性质，而大多数缺血性疾病是慢性过程。此外，由于年龄小且侧支组织健康，即使没有治疗干预，啮齿动物在缺血后也往往会在很大程度上愈合。

SWT 效果的证据主要通过医学研究获得，但通常缺乏对分子机制的深入研究和评估。标准化协议可以为研究人员提供一种方法来比较他们围绕 SWT 再生的工作。在这方面，该协议旨在代表一个可修改的基础，易于适应不同的组织、SWT 涂抹器、治疗方案或读数。因此，该协议中只有几个步骤可以被认为是关键的（见下文）。因此，该协议提供了一种简单、可行且标准化的方法，可以通过 体内冲击波疗法诱导和研究再生。

关键步骤
与所有动物模型一样，避免感染、动物不必要的痛苦和促进可复制的清洁数据至关重要。因此，器械应进行适当消毒。所有工作，包括研究动物，都应由有能力、训练有素的人员进行。必须避免上述任何一点的不足。确保不要将股静脉与动脉混淆。使用透热疗法时避免肌肉热损伤，因为它可能会使血流结果产生偏差。

强烈建议在动物模型中使用之前熟悉此工具。确保在激活之前仔细检查透热疗法的镊子部分是否有淬灭组织，从而不影响周围组织。进行 SWT 时，请记住，不同的 SWT 设备的工作方式不同，应根据所用设备的用户手册进行治疗。

Holfeld J. 和 Grimm M. 是 Heart Regeneration Technologies GmbH 的股东，该公司是因斯布鲁克医科大学的衍生公司，旨在推广心脏冲击波疗法 （www.heart-regeneration.com）。所有其他作者都没有什么可披露的。

这项研究得到了对 JH 和 CGT 的无限制 AUVA 研究资助的支持。