Engenharia de sensores de proteínas intracelulares em células de mamíferos

Aqui, apresentamos um protocolo para engenharia de sensores-atuadores-de-proteínas intracelulares codificados geneticamente. O dispositivo detecta especificamente proteínas-alvo por meio de anticorpos intracelulares (intracorpos) e responde ativando a saída transcricional do gene. Uma estrutura geral é construída para substituir rapidamente os intracorpos, permitindo a detecção rápida de qualquer proteína desejada, sem alterar a arquitetura geral.

As proteínas podem funcionar como biomarcadores de condições patológicas, como doenças neurodegenerativas, infecções ou síndromes metabólicas. A engenharia de células para detectar e responder a esses biomarcadores pode ajudar na compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes às patologias, bem como no desenvolvimento de novas terapias baseadas em células. Embora vários sistemas que detectam proteínas extracelulares tenham sido desenvolvidos, faltava uma estrutura modular que pudesse ser facilmente reprojetada para detectar diferentes proteínas intracelulares.

Aqui, descrevemos um protocolo para implementar uma plataforma genética modular que detecta proteínas intracelulares e ativa uma resposta celular específica. O dispositivo opera com anticorpos intracelulares ou pequenos peptídeos para detectar com alta especificidade a proteína de interesse, desencadeando a ativação transcricional de genes de saída, por meio de um módulo de atuação baseado em protease TEV (TEVp). O TEVp é uma protease viral que cliva seletivamente peptídeos cognatos curtos e é amplamente utilizada em biotecnologia e biologia sintética por sua alta ortogonalidade ao local de clivagem. Especificamente, projetamos dispositivos que reconhecem e respondem a biomarcadores de proteínas de infecções virais e doenças genéticas, incluindo huntingtina mutada, serina-protease NS3, proteínas Tat e Nef para detectar a doença de Huntington, vírus da hepatite C (HCV) e infecções pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), respectivamente. É importante ressaltar que o sistema pode ser adaptado manualmente para o resultado funcional de entrada e saída desejado, como leituras fluorescentes para biossensores, estimulação da apresentação de antígenos para resposta imune ou início de apoptose para eliminar células não saudáveis.

O estudo e a modulação das respostas celulares por meio de circuitos genéticos controlados são os principais objetivos da biologia sintética ^1,2,3 para o desenvolvimento de ferramentas prospectivas com aplicações biológicas ou médicas relevantes em câncer 4, infecções⁵, doenças metabólicas⁶ e imunologia⁷.

A reprogramação das funções celulares em resposta a sinais específicos requer o design de interfaces inteligentes que vinculam a detecção de mudanças dinâmicas extracelulares ou intracelulares (entrada) ao processamento a jusante, acionando uma saída específica para fins de diagnóstico (ou seja, genes repórteres) ou para religar a resposta celular (terapêutica). As entradas detectadas pelo módulo de detecção podem ser pequenos analitos⁸, proteínas ^9,10,11 ou microRNAs 11,12,13, específicos para o início ou progressão de uma doença. Além disso, a regulação de circuitos complexos pode ser alcançada pelo processamento de informações de múltiplas entradas, aumentando o controle rígido sobre a expressão do transgene em resposta às condições definidas 14,15,16. Por exemplo, sensores baseados em microRNA podem identificar tipos específicos de células, como células cancerígenas, induzindo sua depuração com a expressão de um gene apoptótico¹³. Como os microRNAs são facilmente implementáveis em circuitos sintéticos de maneira modular, eles representam uma entrada amplamente utilizada para biossensores geneticamente codificados^{12 , 13 , 17} . As proteínas também são um biomarcador válido para mutações genéticas, câncer e infecções e, de fato, vários dispositivos extracelulares de detecção de proteínas foram relatados^18,19.

Muitos dos circuitos que detectam proteínas extracelulares dependem do uso de receptores projetados, que ligam um fator de transcrição (TF) à membrana, fundido a um local de clivagem responsivo ao TEVp (TCS). Uma grande vantagem do TEVp é a especificidade da clivagem e a falta de interferência no processamento endógeno de proteínas. Nesses sistemas, o TEVp é fundido a um segundo peptídeo que interage com o receptor projetado após a ligação das moléculas extracelulares. Assim, as entradas externas induzem clivagem mediada por TEVp e liberação de TF. Os sistemas que funcionam com esse mecanismo são Tango/TEVp¹⁸, induzido por luz²⁰ e Modular Extracellular Sensor Architecture (MESA)¹⁹. Apesar do progresso na detecção de proteínas extracelulares, a tecnologia para detectar proteínas intracelulares de forma modular nunca foi realizada antes, com a limitação de passar por muitas iterações de construção e teste para dispositivos únicos responsivos a uma proteína específica.

Nosso sistema é a primeira plataforma para detecção de proteínas intracelulares²¹. A modularidade é garantida pelo uso de intracorpos que definem a especificidade para o alvo, enquanto a reprogramação celular é mediada por TEVp. Especificamente, um intracorpo é ligado à membrana e fundido ao C-terminal a uma proteína fluorescente mKate, um TCS e um TF (proteína de fusão 1); o segundo intracorpo é fundido ao TEVp e localizado no citosol (proteína de fusão 2) (Figura 1).

Assim, a interação entre dois intracorpos e a proteína alvo ocorre no citoplasma e leva à clivagem do TCS pelo TEVp, resultando na translocação de TF para o núcleo para ativar a saída funcional. O dispositivo de detecção e acionamento foi testado com sucesso para quatro proteínas intracelulares específicas da doença: serina protease NS3 expressa pelo vírus HCV²², proteínas Tat e Nef da infecção pelo HIV^23,24 e huntingtina mutada (HTT) da doença de Huntington²⁵. A expressão de saída inclui repórteres fluorescentes, gene apoptótico (hBax)²⁶ e imunomoduladores (XCL-1)²⁷. Demonstramos que o sistema também pode prejudicar a funcionalidade patológica de seus alvos. Por exemplo, o dispositivo responsivo a Nef interfere na disseminação da infecção viral, sequestrando a proteína-alvo e revertendo a modulação negativa do receptor HLA-I nas células T infectadas²⁴. A plataforma de sensoriamento descrita é a primeira desse tipo para a detecção de proteínas intracelulares e pode ser potencialmente implementada para detectar a expressão anormal de proteínas, modificações pós-traducionais ou epigenéticas, para fins diagnósticos e terapêuticos²⁰.

1. Princípios de design para construção e teste do dispositivo sensor-atuador

1. Selecione uma proteína de interesse.
   NOTA: Projetamos um sistema para proteínas localizadas no citoplasma ou transportadas entre o citoplasma e outros compartimentos.
2. Selecione dois intracorpos ligando diferentes epítopos da proteína alvo. Em nosso estudo, selecionamos proteínas para as quais os intracorpos já foram desenvolvidos e testados 28,29,30,31. Quando os intracorpos não estão disponíveis, eles devem ser desenvolvidos recentemente.
   NOTA: Uma alternativa aos intracorpos pode ser outras moléculas que interagem com a proteína de interesse. Por exemplo, o dispositivo de detecção Nef inclui um intracorpo (sdAb19) e o domínio SH3 de uma proteína tirosina quinase p59fyn³².
3. Projete in silico os plasmídeos com sequências de DNA que codificam as proteínas de fusão.
   NOTA: O software para design de plasmídeo está disponível gratuitamente ou pode ser adquirido.
   1. Gere sequências que incluam os seguintes módulos: etiqueta de membrana, marcador fluorescente (por exemplo, mKate), intracorpo, TCS e TF para a proteína de fusão 1 e intracorpo e TEVp para a proteína de fusão 2.
      NOTA: A construção de uma nova arquitetura baseada na interação de vários componentes requer atenção aos parâmetros que podem maximizar a ativação do sinal quando a proteína alvo é detectada. Especificamente, nos concentramos na atividade do TEVp e na flexibilidade das proteínas quiméricas para facilitar a interação proteína-proteína (Tabela 1). Todos esses recursos são especificados nos pontos a seguir.
   2. Insira um domínio de ligação glicina-serina flexível (LD) entre o intracorpo-TCS e/ou TEVp-intracorpo. O LD pode ser de comprimento variável (0, 10 ou 15 aminoácidos-AA).
   3. Proteína de fusão 1: Variantes de design que incluem o TCS de alta afinidade (S) ou o TCS de baixa afinidade (L) para regular a atividade de clivagem do TEVp. A expressão desse construto é impulsionada por um promotor constitutivo. Inclua o fator de transcrição GAL4VP16 no terminal C do TCS para permitir a translocação para o núcleo após a clivagem do TEVp.
      NOTA: Usamos o promotor hEF1a, mas outros promotores constitutivos podem ser escolhidos.
   4. Proteína de fusão 2: Use um promotor constitutivo (hEF1a) ou induzível por doxiclicina (pTET) para ajustar a transcrição do TEVp. Use um domínio de degradação (DD) regulado pelo escudo de molécula pequena para modular a estabilidade da proteína.
      NOTA: Outros sistemas induzíveis que ajustam a expressão da proteína podem ser potencialmente escolhidos.
   5. Saída: Coloque um gene repórter a jusante do promotor UAS que responde a GAL4VP16 fator de transcrição. Escolha a saída de acordo com a aplicação do dispositivo (ou seja, proteína fluorescente, citocina, etc.).
4. Execute a clonagem com qualquer estratégia preferida. Aqui, construímos plasmídeos com tecnologias Golden Gate ou gateway.
5. Teste as várias configurações do dispositivo nas linhas celulares desejadas por transfecção transitória. Co-transfectar as células com os plasmídeos obtidos para as proteínas de fusão 1 e 2 e gene repórter fluorescente, como UAS-EYFP. A proteína de fusão 1 inclui uma proteína fluorescente vermelha (mkate) usada como marcador de transfecção.
   NOTA: Comece com linhagens celulares simples de transfectar, como células HEK293FT, para testar os dispositivos.
   1. Transfecção em células HEK293FT. Semeie 2 x 10⁵ células em uma placa de 24 poços com 500 μL de DMEM. Transfectar células com 300 ng de DNA total usando reagente de transfecção, vórtice a mistura e incubar em RT por 20 minutos.
      1. Colocar as células numa incubadora a 37 °C/5% de CO₂ . Adicionar meio de cultura fresco 24 h após a transfecção.
   2. Transfecção em células de Jurkat. Use 3 x 10⁵ células em 500 μL de meio de cultura de células RPMI para placa de 24 poços. Realize a eletroporação seguindo as instruções do fabricante. Use 2-4 μg de DNA total para cada amostra. Adicionar 500 μL de meios de cultura de células frescas 24 h após a transfecção.
      1. Durante a eletroporação, coloque as células e a mistura de DNA no gelo. Em seguida, coloque as células na incubadora a 37 °C/5% de CO₂ .
         NOTA: Diferentes linhagens celulares e métodos de transfecção podem ser escolhidos de acordo com a aplicação específica do dispositivo.
6. Adquira imagens de microscópio para obter uma compreensão qualitativa da funcionalidade do dispositivo. Confirme a localização da membrana da proteína de fusão 1 detectando o sinal fluorescente (mkate) nas proximidades da membrana celular. Visualize a saída fluorescente (EYFP) na presença ou ausência (controle negativo-NC) da proteína alvo.
   1. Use o sistema de imagem celular equipado com cubos de luz Tx Red e GFP para detectar proteínas fluorescentes mKate e EYFP. Use o objetivo 10x ou 20x.
      NOTA: Use células não transfectadas para garantir que não haja autofluorescência.
7. Analise a transfecção com citometria de fluxo (FACS).
   NOTA: Consulte o Protocolo 2 para preparação de amostras.
   1. Avaliar os dispositivos na presença da proteína-alvo. Criar uma matriz experimental que combine variantes das proteínas de fusão 1 e 2, modulando o TEVp com (i) promotor constitutivo de hEf1a (ii) promotor TET induzível por doxiciclina e (iii) escudo para estabilidade proteica. Adicione doxiciclina e proteja em concentrações (0-1000 nM).
   2. Realize a análise FACS para comparar a indução de dobras de EYFP entre amostras com ou sem proteína de interesse.
      NOTA: A indução de dobra mais alta corresponde à maior sensibilidade de entrada em ON (presença da proteína alvo) em comparação com o modo OFF (ausência da proteína alvo).
8. Teste a funcionalidade do dispositivo em relação aos aplicativos desejados.
   1. Execute a análise FACS para medir os níveis de proteínas de saída ou apoptose, ou outros ensaios relevantes.
   2. Realize a análise de RT PCR se a parte de saída do dispositivo regular os níveis de expressão dos genes-alvo. Calcule o ^2-ddCT em relação ao gene de manutenção (GAPDH ou equivalente) e compare a mudança de dobra da expressão de saída nos modos ON e OFF.

2. Preparação da amostra para análise por citometria de fluxo

1. Realize a análise quantitativa de dispositivos de proteínas com citômetro de fluxo (FACS) 48 h após a transfecção.
   1. Aspire o meio DMEM e lave HEK293FT células com 300 μL de PBS. Adicione 100 μL de tripsina e deixe na incubadora a 37 °C / 5% CO₂ por 2-4 minutos.
      NOTA: As células Jurkat não requerem tripsina.
   2. Adicione 400 μL de meio DMEM sem vermelho de fenol e ressuspenda as células para evitar a formação de aglomerados. Transferência em tubos FACS.
   3. Use um citômetro de fluxo equipado com lasers de 405, 488 e 561 nm.
   4. Colete de 30.000 a 100.000 eventos selecionados da população de células vivas usando as seguintes configurações de citômetro: laser de 488 nm e filtro passa-banda de 530/30 nm para EYFP/EGFP, laser de 561 nm e filtro de 610/20 nm para mKate e laser de 405 nm, filtro 450/50 para EBFP.
      NOTA: Para configurar o citômetro de fluxo, inclua células não transfectadas e células transfectadas com proteínas fluorescentes únicas.
   5. Realize a análise das amostras coletadas usando o software preferido (por exemplo, software DIVA, Flowjo ou método TASBE³³).

3. Caracterização do dispositivo sensor-atuador HCV

1. Selecione intracorpos para detectar a proteína NS3. scFv35 e scFv162 ligam-se a dois epítopos diferentes e, portanto, foram escolhidos.
2. Projete e teste variantes do dispositivo responsivo a NS3 seguindo o racional descrito na etapa 1.3 (por exemplo, proteína de fusão 1: etiqueta de membrana, mKate, fragmento de cadeia única intracorporal scFv35, LD0, TCS-L e TF GAL4VP16; Proteína de fusão 2: fragmento de cadeia única intracorporal scFv162, LD0 e TEVp; Saída: UAS-EYFP ou UAS-hBax (apoptose); NS3 (ver Tabela 2)).
3. Teste as construções em HEK293FT células.
   NOTA: Para cada experimento, defina um controle negativo que é a entrega do dispositivo e a quantificação de saída na ausência da proteína de interesse.
   1. Testar os dispositivos para TEVp sob um promotor constitutivo na presença ou ausência de NS3. Realize a transfecção da proteína de fusão 1 (etapa 1.3.3), proteína de fusão 2 (etapa 1.3.4) e etapa de saída do EYFP (1.3.5) em HEK293FT células, conforme descrito na etapa 1.5.1. Analise as amostras 48 h após a transfecção medindo o repórter fluorescente (EYFP) por citometria de fluxo (Protocolo 2).
   2. Avalie a interação intracorpo-NS3 por colocalização de mKate e BFP usando a proteína de fusão BFP-NS3. Células transfectas com proteína de fusão 1 que inclui mKate e com BFP-NS3. 48 h após a transfecção, observe as células no microscópio confocal (objetiva de 63x) para testar a co-localização de proteínas fluorescentes.
      NOTA: Use um BFP (não fundido ao NS3) como controle negativo. Nessa condição, o BFP deve mostrar localização celular difusa e não deve co-localizar com o mKate ligado à membrana.
   3. Testar os dispositivos para TEVp sob o promotor pTET na presença ou ausência de NS3. Compare o EYFP na ausência e na presença de NS3. Co-transfectar células com proteína de fusão 1 (etapa 1.3.3), proteína de fusão 2 (etapa 1.3.4) e saída EYFP (etapa 1.3.5) usando o protocolo descrito na etapa 1.5.1. As transfecções são realizadas na presença ou ausência de NS3. Analise as amostras 48 h após a transfecção medindo o repórter fluorescente (EYFP) por citometria de fluxo (Protocolo 2).
4. Teste a eliminação de células impulsionada pelo dispositivo NS3.
   1. Substitua a saída do EYFP pelo gene apoptótico hBax.
   2. Repita a etapa 3.3.3. Colete as células 48 h após a transfecção e lave com PBS antes de iniciar o ensaio.
   3. Realize o ensaio de apoptose com Anexina V conjugada ao Azul do Pacífico. Células coradas com marcador apoptótico Anexina V (conjugada com 2,5 μL de azul de Pacífico) diluídas em tampão de ligação (proporção de volume de 1:20) por 10 min à temperatura ambiente.
   4. Analise as células por citometria de fluxo. Calcule o nível de apoptose na população como número de células positivas para o Azul-Pacífico (Anexina V).

4. Caracterização do dispositivo sensor-atuador de HIV responsivo a Nef

1. Selecione intracorpos que se ligam a Nef. Domínio único intracorpo sdAb19 e SH3 foram escolhidos por se ligarem a diferentes epítopos.
   NOTA: SH3 não é um intracorpo, mas um domínio da proteína tirosina quinase p59^fyn que interage fisiologicamente com Nef.
2. Projete e teste variantes do dispositivo responsivo a Nef seguindo o racional descrito na etapa 1.3 (por exemplo, proteína de fusão 1: etiqueta de membrana, mKate, sdAb19, LD0, TCS-L e GAL4-VP16; Proteína de fusão 2: SH3, LD0 e TEVp; Saída: UAS-EYFP; Nef (ver Tabela 3)).
3. Teste os dispositivos em células T HEK293FT e Jurkat.
   NOTA: Para cada experimento, definimos um controle negativo que é a entrega do dispositivo e a quantificação da saída na ausência da proteína de interesse
   1. Transfecção de HEK293FT: Siga o procedimento descrito na etapa 1.5.1 na presença ou ausência de Nef.
   2. Transfecção de células T Jurkat: Siga o procedimento descrito na etapa 1.5.2 na presença ou ausência de Nef.
   3. 48h após a transfecção, analisar as amostras com citômetro de fluxo conforme descrito no Protocolo 2.
4. Infecte células Jurkat com cepas de HIV LAI para detecção de HIV.
   1. Preparar estoques virais pelo menos 48 h antes do experimento. Use vírus obtidos da transfecção de células HEK-293T com os clones moleculares infecciosos (programa de reagentes do NIH AIDS) e reagentes comerciais usando as instruções do fabricante. Concentre o vírus após 40 h por ultracentrifugação por 1 h, 64.074 x g, 4 ° C em sacarose a 20% para evitar proteínas livres de partículas virais. Titule estoques virais com HIV-1 p24 ELISA.
   2. Infecte células com cepas de HIV-1 com 500 ng de inóculo p24. 40 h após a infecção, quantificar a porcentagem de células infectadas detectando a proteína viral p24 com anticorpo conjugado KC57-FITC e realizando análise de citometria de fluxo.
   3. Pinte as células com anticorpos conjugados AlexaFluor 647 clone W6/32 contra HLA-A, B, C. Fixe as células e analise em um citômetro de fluxo. Nef mediava a modulação negativa de HLA-I em células T Jurkat na presença ou ausência do dispositivo sensor de proteína.

Uma arquitetura para detecção modular de proteínas intracelulares
Conforme mostrado na Figura 1, o dispositivo é composto por: 1) intracorpo 1 conectado ao marcador fluorescente ligado à membrana (mKate) e ao local de clivagem do TEVp (TCS), seguido por um ativador de transcrição GAL4VP16 (TF); 2) intracorpo 2 fundido à protease TEV (TEVp), livre no citosol; 3) um promotor sintético responsivo ao GAL4VP16, impulsionando a express...

Até recentemente, interrogar células com base no ambiente intracelular era realizado com sistemas desenvolvidos de novo para alvos específicos. O presente protocolo descreve um exemplo da abordagem de engenharia celular mais recente para detecção e atuação de proteínas em um dispositivo, que pode ser rapidamente adaptada a novos biomarcadores desejados.

Este sistema pioneiro detecta proteínas intracelulares e fornece uma saída específica para detect...

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Este trabalho foi apoiado pelo Istituto Italiano di Tecnologia.