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Method Article
Qui, presentiamo un protocollo per l'ingegnerizzazione di sensori-attuatori proteici intracellulari geneticamente codificati. Il dispositivo rileva in modo specifico le proteine bersaglio attraverso gli anticorpi intracellulari (intracorpi) e risponde attivando l'output trascrizionale genico. Viene costruito un quadro generale per sostituire rapidamente gli intracorpi, consentendo il rilevamento rapido di qualsiasi proteina desiderata, senza alterare l'architettura generale.
Le proteine possono funzionare come biomarcatori di condizioni patologiche, come malattie neurodegenerative, infezioni o sindromi metaboliche. L'ingegnerizzazione delle cellule per rilevare e rispondere a questi biomarcatori può aiutare la comprensione dei meccanismi molecolari alla base delle patologie, nonché per sviluppare nuove terapie cellulari. Sebbene siano stati sviluppati diversi sistemi in grado di rilevare le proteine extracellulari, mancava una struttura modulare che potesse essere facilmente reingegnerizzata per rilevare diverse proteine intracellulari.
Qui, descriviamo un protocollo per implementare una piattaforma genetica modulare che rileva le proteine intracellulari e attiva una specifica risposta cellulare. Il dispositivo opera su anticorpi intracellulari o piccoli peptidi per rilevare con elevata specificità la proteina di interesse, innescando l'attivazione trascrizionale dei geni in uscita, attraverso un modulo di attuazione basato sulla proteasi TEV (TEVp). La TEVp è una proteasi virale che scorpore selettivamente i peptidi corti affini ed è ampiamente utilizzata in biotecnologia e biologia sintetica per la sua elevata ortogonalità al sito di scissione. In particolare, abbiamo ingegnerizzato dispositivi che riconoscono e rispondono ai biomarcatori proteici delle infezioni virali e delle malattie genetiche, tra cui l'huntingtina mutata, la serina-proteasi NS3, le proteine Tat e Nef per rilevare rispettivamente la malattia di Huntington, il virus dell'epatite C (HCV) e il virus dell'immunodeficienza umana (HIV). È importante sottolineare che il sistema può essere adattato a mano per il risultato funzionale input-output desiderato, come le letture fluorescenti per i biosensori, la stimolazione della presentazione dell'antigene per la risposta immunitaria o l'inizio dell'apoptosi per eliminare le cellule malsane.
Lo studio e la modulazione delle risposte cellulari tramite circuiti genici ingegnerizzati controllabili sono obiettivi importanti in biologia sintetica 1,2,3 per lo sviluppo di strumenti prospettici con applicazioni biologiche o mediche rilevanti nel cancro 4, nelle infezioni5, nelle malattie metaboliche6 e nell'immunologia7.
La riprogrammazione delle funzioni cellulari in risposta a segnali specifici richiede la progettazione di interfacce intelligenti che colleghino il rilevamento di cambiamenti dinamici extracellulari o intracellulari (input) all'elaborazione a valle, innescando un output specifico sia per scopi diagnostici (ad esempio, geni reporter) che per ricablare la risposta cellulare (terapie). Gli input rilevati dal modulo di rilevamento possono essere piccoli analiti8, proteine 9,10,11 o microRNA 11,12,13, specifici per l'insorgenza o la progressione di una malattia. Inoltre, la regolazione di circuiti complessi può essere ottenuta mediante l'elaborazione di più informazioni in ingresso, aumentando lo stretto controllo sull'espressione del transgene in risposta alle condizioni definite 14,15,16. Ad esempio, i sensori basati su microRNA possono identificare tipi di cellule specifici, come le cellule tumorali, inducendone l'eliminazione con l'espressione di un gene apoptotico13. Poiché i microRNA sono facilmente implementabili in circuiti sintetici in modo modulare, rappresentano un input ampiamente utilizzato per i biosensori geneticamente codificati 12,13,17. Le proteine sono anche un valido biomarcatore per mutazioni genetiche, cancro e infezioni, e infatti sono stati riportati numerosi dispositivi extracellulari sensibili alle proteine18,19.
Molti dei circuiti che rilevano le proteine extracellulari si basano sull'uso di recettori ingegnerizzati, che legano un fattore di trascrizione (TF) alla membrana, fuso a un sito di scissione (TCS) responsivo a TEVp. Uno dei principali vantaggi del TEVp è la specificità della scissione e la mancanza di interferenza con l'elaborazione endogena delle proteine. In questi sistemi, TEVp è fuso con un secondo peptide che interagisce con il recettore ingegnerizzato dopo il legame delle molecole extracellulari. Pertanto, gli input esterni inducono la scissione mediata da TEVp e il rilascio di TF. I sistemi che funzionano con questo meccanismo sono Tango/TEVp18, light-induced20 e MESA (Modular Extracellular Sensor Architecture)19. Nonostante i progressi nel rilevamento delle proteine extracellulari, la tecnologia per il rilevamento delle proteine intracellulari in modo modulare non è mai stata realizzata prima, con la limitazione di passare attraverso molte iterazioni di costruzione e test per singoli dispositivi che rispondono a una proteina specifica.
Il nostro sistema è la prima piattaforma per il rilevamento intracellulare delle proteine21. La modularità è garantita dall'uso di intracorpi che definiscono la specificità al bersaglio, mentre la riprogrammazione cellulare è mediata da TEVp. In particolare, un intracorpo è legato alla membrana e fuso al C-terminale con una proteina fluorescente mKate, un TCS e un TF (proteina di fusione 1); il secondo intracorpo è fuso al TEVp e localizzato nel citosol (proteina di fusione 2) (Figura 1).
Pertanto, l'interazione tra due intracorpi e la proteina bersaglio avviene nel citoplasma e porta alla scissione del TCS da parte di TEVp, con conseguente traslocazione del TF nel nucleo per attivare l'output funzionale. Il dispositivo di rilevamento è stato testato con successo per quattro proteine intracellulari specifiche della malattia: la serina proteasi NS3 espressa dal virus HCV22, le proteine Tat e Nef dall'infezione da HIV23,24 e l'huntingtina mutata (HTT) della malattia di Huntington25. L'espressione in output include reporter fluorescenti, gene apoptotico (hBax)26 e immunomodulatori (XCL-1)27. Dimostriamo che il sistema può anche compromettere la funzionalità patologica dei suoi bersagli. Ad esempio, il dispositivo Nef-responsive interferisce con la diffusione dell'infezione virale sequestrando la proteina bersaglio e invertendo la downmodulazione del recettore HLA-I sulle cellule T infette24. La piattaforma di sensing-actuating descritta è la prima di questo tipo per la rilevazione di proteine intracellulari e può essere potenzialmente implementata per rilevare l'espressione anomala di proteine, modificazioni post-traduzionali o epigenetiche, per scopi diagnostici e terapeutici20.
1. Principi di progettazione per la costruzione e il collaudo del dispositivo sensore-attuatore
2. Preparazione del campione per l'analisi della citometria a flusso
3. Caratterizzazione del dispositivo sensore-attuatore HCV
4. Caratterizzazione del dispositivo sensore-attuatore HIV Nef-responsive
Un'architettura per la rilevazione modulare delle proteine intracellulari
Come mostrato in Figura 1, il dispositivo è composto da: 1) intrabody 1 collegato al marcatore fluorescente legato alla membrana (mKate) e al sito di clivaggio TEVp (TCS), seguito da un GAL4VP16 attivatore di trascrizione (TF); 2) intracorpo 2 fuso alla proteasi TEV (TEVp), libero nel citosol; 3) un promotore sintetico sensibile al GAL4VP16, che guida l'espressione...
Fino a poco tempo fa, l'interrogazione delle cellule basata sull'ambiente intracellulare veniva eseguita con sistemi sviluppati de novo per bersagli specifici. Il presente protocollo descrive un esempio del più recente approccio di ingegneria cellulare per il rilevamento e l'attuazione delle proteine in un unico dispositivo, che può essere rapidamente adattato ai nuovi biomarcatori desiderati.
Questo sistema pionieristico rileva le proteine intracellulari e ...
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Italiano di Tecnologia.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AlexaFluor 647 mouse anti-human HLA-A, B, C antibody clone W6/32 | Biolegend | 311414 | Antibodies |
Annexin V | LifeTechnologies | A35122 | Apoptosis marker |
Attractene | Qiagen | 301005 | Transfection reagent |
BD Falcon Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352053 | FACS tubes |
Doxycycline | Clonetech | - | Cell Culture: Drugs |
Dulbecco's modified Eagle medium | Cellgro | 10-013-CM | Cell Culture: Medium |
Evos Cell Imaging System | Life Technology | EVOS M5000 | Imaging systems; Infectious molecular clones |
FACSDiva8 software | BD Biosciences | 659523 | FACS software |
Fast SYBR Green Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4385612 | qPCR reaction |
FBS (Fetal Bovin Serum) | Atlanta BIO | S11050 | Cell Culture: Medium |
Gateway System | Life Technologies | - | Plasmid Construction |
Golden Gate System | in-house | - | Plasmid Construction |
HEK 293FT | Invitrogen | R70007 | Cell Culture: Cells |
Infusion Cloning System | Clonetech | 638920 | Plasmid Construction |
JetPRIME reagent | Polyplus transfection | 114-15 | Transcfection reagent |
Jurkat Cells | ATCC | TIB-152 | Cell Culture: Cells |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | Cell Culture: Medium |
Lipofectamine LTX with Plus Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15338030 | Transfection reagent |
LSR Fortessa flow cytometer (405, 488, and 561 nm lasers) | BD Biosciences | 649225 | Flow cytometer |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate (0.1 mL) | ThermoFisher Scientific | 4346907 | qPCR reaction |
Neon Transfection System | Life Technologies | MPK10025 | Transfection reagent |
Non-essential amino acids | HyClone | SH3023801 | Cell Culture: Medium |
Opti-MEM I reduced serum medium | Life Technologies | 31985070 | Transfection medium |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | Cell Culture: Medium |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205313 | Rev Transcriptase kit |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction kit |
RPMI-1640 | ATCC | ATCC 302001 | Cell Culture: Medium |
Shield | Clonetech | 632189 | Cell Culture: Drugs |
SpheroTech RCP-30-5-A beads | Spherotech | RCP-30- 5A-2 | Compensation set up |
StepOnePlus 7500 Fast machine | Applied Biosystems | 4351106 | qPCR reaction |
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