Progettazione di sensori proteici intracellulari in cellule di mammifero

Qui, presentiamo un protocollo per l'ingegnerizzazione di sensori-attuatori proteici intracellulari geneticamente codificati. Il dispositivo rileva in modo specifico le proteine bersaglio attraverso gli anticorpi intracellulari (intracorpi) e risponde attivando l'output trascrizionale genico. Viene costruito un quadro generale per sostituire rapidamente gli intracorpi, consentendo il rilevamento rapido di qualsiasi proteina desiderata, senza alterare l'architettura generale.

Le proteine possono funzionare come biomarcatori di condizioni patologiche, come malattie neurodegenerative, infezioni o sindromi metaboliche. L'ingegnerizzazione delle cellule per rilevare e rispondere a questi biomarcatori può aiutare la comprensione dei meccanismi molecolari alla base delle patologie, nonché per sviluppare nuove terapie cellulari. Sebbene siano stati sviluppati diversi sistemi in grado di rilevare le proteine extracellulari, mancava una struttura modulare che potesse essere facilmente reingegnerizzata per rilevare diverse proteine intracellulari.

Qui, descriviamo un protocollo per implementare una piattaforma genetica modulare che rileva le proteine intracellulari e attiva una specifica risposta cellulare. Il dispositivo opera su anticorpi intracellulari o piccoli peptidi per rilevare con elevata specificità la proteina di interesse, innescando l'attivazione trascrizionale dei geni in uscita, attraverso un modulo di attuazione basato sulla proteasi TEV (TEVp). La TEVp è una proteasi virale che scorpore selettivamente i peptidi corti affini ed è ampiamente utilizzata in biotecnologia e biologia sintetica per la sua elevata ortogonalità al sito di scissione. In particolare, abbiamo ingegnerizzato dispositivi che riconoscono e rispondono ai biomarcatori proteici delle infezioni virali e delle malattie genetiche, tra cui l'huntingtina mutata, la serina-proteasi NS3, le proteine Tat e Nef per rilevare rispettivamente la malattia di Huntington, il virus dell'epatite C (HCV) e il virus dell'immunodeficienza umana (HIV). È importante sottolineare che il sistema può essere adattato a mano per il risultato funzionale input-output desiderato, come le letture fluorescenti per i biosensori, la stimolazione della presentazione dell'antigene per la risposta immunitaria o l'inizio dell'apoptosi per eliminare le cellule malsane.

Lo studio e la modulazione delle risposte cellulari tramite circuiti genici ingegnerizzati controllabili sono obiettivi importanti in biologia sintetica ^1,2,3 per lo sviluppo di strumenti prospettici con applicazioni biologiche o mediche rilevanti nel cancro 4, nelle infezioni⁵, nelle malattie metaboliche⁶ e nell'immunologia⁷.

La riprogrammazione delle funzioni cellulari in risposta a segnali specifici richiede la progettazione di interfacce intelligenti che colleghino il rilevamento di cambiamenti dinamici extracellulari o intracellulari (input) all'elaborazione a valle, innescando un output specifico sia per scopi diagnostici (ad esempio, geni reporter) che per ricablare la risposta cellulare (terapie). Gli input rilevati dal modulo di rilevamento possono essere piccoli analiti⁸, proteine ^9,10,11 o microRNA 11,12,13, specifici per l'insorgenza o la progressione di una malattia. Inoltre, la regolazione di circuiti complessi può essere ottenuta mediante l'elaborazione di più informazioni in ingresso, aumentando lo stretto controllo sull'espressione del transgene in risposta alle condizioni definite 14,15,16. Ad esempio, i sensori basati su microRNA possono identificare tipi di cellule specifici, come le cellule tumorali, inducendone l'eliminazione con l'espressione di un gene apoptotico¹³. Poiché i microRNA sono facilmente implementabili in circuiti sintetici in modo modulare, rappresentano un input ampiamente utilizzato per i biosensori geneticamente codificati 12,13,17. Le proteine sono anche un valido biomarcatore per mutazioni genetiche, cancro e infezioni, e infatti sono stati riportati numerosi dispositivi extracellulari sensibili alle proteine^18,19.

Molti dei circuiti che rilevano le proteine extracellulari si basano sull'uso di recettori ingegnerizzati, che legano un fattore di trascrizione (TF) alla membrana, fuso a un sito di scissione (TCS) responsivo a TEVp. Uno dei principali vantaggi del TEVp è la specificità della scissione e la mancanza di interferenza con l'elaborazione endogena delle proteine. In questi sistemi, TEVp è fuso con un secondo peptide che interagisce con il recettore ingegnerizzato dopo il legame delle molecole extracellulari. Pertanto, gli input esterni inducono la scissione mediata da TEVp e il rilascio di TF. I sistemi che funzionano con questo meccanismo sono Tango/TEVp¹⁸, light-induced²⁰ e MESA (Modular Extracellular Sensor Architecture)¹⁹. Nonostante i progressi nel rilevamento delle proteine extracellulari, la tecnologia per il rilevamento delle proteine intracellulari in modo modulare non è mai stata realizzata prima, con la limitazione di passare attraverso molte iterazioni di costruzione e test per singoli dispositivi che rispondono a una proteina specifica.

Il nostro sistema è la prima piattaforma per il rilevamento intracellulare delle proteine²¹. La modularità è garantita dall'uso di intracorpi che definiscono la specificità al bersaglio, mentre la riprogrammazione cellulare è mediata da TEVp. In particolare, un intracorpo è legato alla membrana e fuso al C-terminale con una proteina fluorescente mKate, un TCS e un TF (proteina di fusione 1); il secondo intracorpo è fuso al TEVp e localizzato nel citosol (proteina di fusione 2) (Figura 1).

Pertanto, l'interazione tra due intracorpi e la proteina bersaglio avviene nel citoplasma e porta alla scissione del TCS da parte di TEVp, con conseguente traslocazione del TF nel nucleo per attivare l'output funzionale. Il dispositivo di rilevamento è stato testato con successo per quattro proteine intracellulari specifiche della malattia: la serina proteasi NS3 espressa dal virus HCV²², le proteine Tat e Nef dall'infezione da HIV^23,24 e l'huntingtina mutata (HTT) della malattia di Huntington²⁵. L'espressione in output include reporter fluorescenti, gene apoptotico (hBax)²⁶ e immunomodulatori (XCL-1)²⁷. Dimostriamo che il sistema può anche compromettere la funzionalità patologica dei suoi bersagli. Ad esempio, il dispositivo Nef-responsive interferisce con la diffusione dell'infezione virale sequestrando la proteina bersaglio e invertendo la downmodulazione del recettore HLA-I sulle cellule T infette²⁴. La piattaforma di sensing-actuating descritta è la prima di questo tipo per la rilevazione di proteine intracellulari e può essere potenzialmente implementata per rilevare l'espressione anomala di proteine, modificazioni post-traduzionali o epigenetiche, per scopi diagnostici e terapeutici²⁰.

1. Principi di progettazione per la costruzione e il collaudo del dispositivo sensore-attuatore

1. Seleziona una proteina di interesse.
   NOTA: Abbiamo progettato un sistema per le proteine localizzate nel citoplasma o che fanno la spola tra il citoplasma e altri compartimenti.
2. Selezionare due intracorpi che legano diversi epitopi della proteina bersaglio. Nel nostro studio abbiamo selezionato proteine per le quali gli intracorpi erano già stati sviluppati e testati 28,29,30,31. Quando gli intracorpi non sono disponibili, dovrebbero essere sviluppati ex novo.
   NOTA: Un'alternativa agli intracorpi possono essere altre molecole che interagiscono con la proteina di interesse. Ad esempio, il dispositivo di rilevamento Nef include un intracorpo (sdAb19) e il dominio SH3 di una proteina p59fyn tirosin-chinasi³².
3. Progettare in silico i plasmidi con sequenze di DNA codificanti le proteine di fusione.
   NOTA: I software per la progettazione di plasmidi sono disponibili gratuitamente o possono essere acquistati.
   1. Generare sequenze che includono i seguenti moduli: tag di membrana, marcatore fluorescente (ad es. mKate), intracorporeo, TCS e TF per la proteina di fusione 1 e intrabody e TEVp per la proteina di fusione 2.
      NOTA: La costruzione di una nuova architettura basata sull'interazione di diversi componenti richiede attenzione ai parametri che possono massimizzare l'attivazione del segnale quando viene rilevata la proteina bersaglio. In particolare, ci siamo concentrati sull'attività TEVp e sulla flessibilità delle proteine chimeriche per facilitare l'interazione proteina-proteina (Tabella 1). Tutte queste caratteristiche sono specificate nei punti seguenti.
   2. Inserire un dominio flessibile del linker glicina-serina (LD) tra l'intracorpo-TCS e/o il TEVp-intracorpo. La LD può essere di lunghezza variabile (0, 10 o 15 aminoacidi-AA).
   3. Proteina di fusione 1: progettano varianti che includono il TCS (S) ad alta affinità o il TCS (L) a bassa affinità per regolare l'attività di scissione del TEVp. L'espressione di questo costrutto è guidata da un promotore costitutivo. Includere il fattore di trascrizione GAL4VP16 al C-terminale del TCS per consentire la traslocazione al nucleo dopo la scissione del TEVp.
      NOTA: Abbiamo utilizzato il promotore hEF1a, ma possono essere scelti altri promotori costitutivi.
   4. Proteina di fusione 2: utilizzare un promotore costitutivo (hEF1a) o doxiclicine-inducibile (pTET) per regolare la trascrizione di TEVp. Utilizzare un dominio di degradazione (DD) regolato dallo scudo di piccole molecole per modulare la stabilità delle proteine.
      NOTA: Possono essere scelti altri sistemi inducibili che regolano l'espressione proteica.
   5. Output: Posizionare un gene reporter a valle del promotore UAS che risponde a GAL4VP16 fattore di trascrizione. Scegliere l'output in base all'applicazione del dispositivo (ad esempio, proteina fluorescente, citochina, ecc.).
4. Esegui la clonazione con la strategia che preferisci. Qui abbiamo costruito plasmidi con tecnologie golden gate o gateway.
5. Testare le varie configurazioni del dispositivo nelle linee cellulari desiderate mediante trasfezione transitoria. Co-trasfettare le cellule con i plasmidi ottenuti per le proteine di fusione 1 e 2 e il gene reporter fluorescente, come UAS-EYFP. La proteina di fusione 1 include una proteina fluorescente rossa (mkate) utilizzata come marcatore di trasfezione.
   NOTA: Iniziare con linee cellulari semplici da trasfettare come celle HEK293FT per testare i dispositivi.
   1. Trasfezione in cellule HEK293FT. Seminare 2 x 10⁵ cellule in una piastra a 24 pozzetti con 500 μL di DMEM. Tranfettare le cellule con 300 ng di DNA totale utilizzando il reagente di trasfezione, agitare la miscela e incubare a RT per 20 minuti.
      1. Porre le cellule in un incubatore a 37 °C/5% di CO₂ . Aggiungere il terreno di coltura fresco 24 ore dopo la trasfezione.
   2. Trasfezione in cellule Jurkat. Utilizzare 3 x 10⁵ cellule in 500 μL di terreno di coltura cellulare RPMI per piastre a 24 pozzetti. Eseguire l'elettroporazione seguendo le istruzioni del produttore. Utilizzare 2-4 μg di DNA totale per ogni campione. Aggiungere 500 μl di terreno di coltura cellulare fresco 24 ore dopo la trasfezione.
      1. Durante l'elettroporazione, posizionare le cellule e la miscela di DNA sul ghiaccio. Quindi, posizionare le cellule nell'incubatore a 37 °C/5% CO₂ .
         NOTA: Diverse linee cellulari e metodi di trasfezione possono essere scelti in base all'applicazione specifica del dispositivo.
6. Acquisire immagini al microscopio per ottenere una comprensione qualitativa della funzionalità del dispositivo. Confermare la localizzazione di membrana della proteina di fusione 1 rilevando il segnale fluorescente (mkate) in prossimità della membrana cellulare. Visualizzare l'output fluorescente (EYFP) in presenza o assenza (controllo negativo-NC) della proteina bersaglio.
   1. Utilizza il sistema di imaging cellulare dotato di cubi luminosi Tx Red e GFP per rilevare le proteine fluorescenti mKate e EYFP. Usa l'obiettivo 10x o 20x.
      NOTA: Utilizzare cellule non trasfettate per assicurarsi che non vi sia autofluorescenza.
7. Analizzare la trasfezione con la citometria a flusso (FACS).
   NOTA: Vedere il Protocollo 2 per la preparazione del campione.
   1. Valutare i dispositivi in presenza della proteina bersaglio. Creare una matrice sperimentale che combini varianti delle proteine di fusione 1 e 2, modulando TEVp con (i) promotore costitutivo di hEf1a, (ii) promotore di TET inducibile dalla doxiciclina e (iii) scudo per la stabilità della proteina. Aggiungere doxiciclina e schermare a concentrazioni (0-1000 nM).
   2. Eseguire l'analisi FACS per confrontare l'induzione del fold di EYFP tra campioni con o senza proteina di interesse.
      NOTA: L'induzione del ripiegamento più alta corrisponde alla massima sensibilità di input in ON (presenza della proteina bersaglio) rispetto alla modalità OFF (assenza della proteina bersaglio).
8. Testare la funzionalità del dispositivo rispetto alle applicazioni desiderate.
   1. Eseguire l'analisi FACS per misurare i livelli di proteine in uscita o l'apoptosi, o altri saggi pertinenti.
   2. Eseguire l'analisi RT PCR se la parte di output del dispositivo regola i livelli di espressione dei geni bersaglio. Calcolare il ^2-ddCT rispetto al gene house-keeping (GAPDH o equivalente) e confrontare la variazione di piega dell'espressione dell'output in modalità ON e OFF.

2. Preparazione del campione per l'analisi della citometria a flusso

1. Eseguire l'analisi quantitativa dei dispositivi proteici con il citometro a flusso (FACS) 48 ore dopo la trasfezione.
   1. Aspirare il terreno DMEM e lavare HEK293FT celle con 300 μl di PBS. Aggiungere 100 μL di tripsina e lasciare nell'incubatore a 37 °C/5% CO₂ per 2-4 minuti.
      NOTA: Le cellule Jurkat non richiedono tripsina.
   2. Aggiungere 400 μl di terreno DMEM senza rosso fenolo e risospendere le cellule per evitare la formazione di grumi. Trasferimento in provette FACS.
   3. Utilizzare un citometro a flusso dotato di laser a 405, 488 e 561 nm.
   4. Raccogli da 30.000 a 100.000 eventi selezionati dalla popolazione di cellule vive utilizzando le seguenti impostazioni del citometro: laser a 488 nm e filtro passa-banda a 530/30 nm per EYFP/EGFP, laser a 561 nm e filtro a 610/20 nm per mKate e laser a 405 nm, filtro 450/50 per EBFP.
      NOTA: Per impostare il citometro a flusso, includere cellule non trasfettate e cellule trasfettate con singole proteine fluorescenti.
   5. Eseguire l'analisi dei campioni raccolti utilizzando il software preferito (ad esempio, il software DIVA, Flowjo o il metodo TASBE³³).

3. Caratterizzazione del dispositivo sensore-attuatore HCV

1. Selezionare gli intracorpi per rilevare la proteina NS3. scFv35 e scFv162 si legano a due epitopi diversi e sono stati quindi scelti.
2. Progettazione e test di varianti del dispositivo NS3-responsive seguendo il razionale descritto nella fase 1.3 (ad esempio, proteina di fusione 1: tag di membrana, mKate, frammento intracorporeo a catena singola scFv35, LD0, TCS-L e TF GAL4VP16; Proteina di fusione 2: frammento intracorporeo a catena singola scFv162, LD0 e TEVp; Output: UAS-EYFP o UAS-hBax (apoptosi); NS3 (cfr. tabella 2)).
3. Testare i costrutti in HEK293FT celle.
   NOTA: Per ogni esperimento, impostare un controllo negativo che è la consegna del dispositivo e la quantificazione dell'output in assenza della proteina di interesse.
   1. Testare i dispositivi per TEVp sotto un promotore costitutivo in presenza o assenza di NS3. Eseguire la trasfezione della proteina di fusione 1 (fase 1.3.3), della proteina di fusione 2 (fase 1.3.4) e della fase di output EYFP (1.3.5) in cellule HEK293FT come descritto nella fase 1.5.1. Analizzare i campioni 48 ore dopo la trasfezione misurando il reporter fluorescente (EYFP) mediante citometria a flusso (Protocollo 2).
   2. Valutare l'interazione intracorpo-NS3 mediante mKate e la colocalizzazione di BFP utilizzando la proteina di fusione BFP-NS3. Trasfettare le cellule con la proteina di fusione 1 che include mKate e con un BFP-NS3. 48 ore dopo la trasfezione, osservare le cellule al microscopio confocale (obiettivo 63x) per testare la co-localizzazione delle proteine fluorescenti.
      NOTA: Utilizzare un BFP (non fuso con NS3) come controllo negativo. In questa condizione la BFP dovrebbe mostrare una localizzazione cellulare diffusa e non dovrebbe co-localizzarsi con l'mKate legato alla membrana.
   3. Testare i dispositivi per TEVp sotto il promotore pTET in presenza o assenza di NS3. Confrontare l'EYFP in assenza e presenza di NS3. Co-trasfettare le cellule con la proteina di fusione 1 (fase 1.3.3), la proteina di fusione 2 (fase 1.3.4) e l'output EYFP (fase 1.3.5) utilizzando il protocollo descritto nella fase 1.5.1. Le trasfezioni vengono eseguite in presenza o in assenza di NS3. Analizzare i campioni 48 ore dopo la trasfezione misurando il reporter fluorescente (EYFP) mediante citometria a flusso (Protocollo 2).
4. Uccisione di cellule di prova guidata dal dispositivo NS3.
   1. Sostituire l'output EYFP con il gene apoptotico hBax.
   2. Ripetere il passaggio 3.3.3. Raccogliere le cellule 48 ore dopo la trasfezione e lavare con PBS prima di iniziare il saggio.
   3. Eseguire il saggio dell'apoptosi con l'annessina V coniugata al blu del Pacifico. Cellule coloranti con marcatore apoptotico Annexina V (coniugata con 2,5 μL di Blu del Pacifico) diluite in tampone legante (rapporto 1:20 in volume) per 10 minuti a temperatura ambiente.
   4. Analizzare le cellule mediante citometria a flusso. Calcola il livello di apoptosi all'interno della popolazione come numero di cellule positive al blu del Pacifico (annessina V).

4. Caratterizzazione del dispositivo sensore-attuatore HIV Nef-responsive

1. Selezionare gli intracorpi che si legano a Nef. Sono stati scelti sdAb19 e SH3 intracorpali a dominio singolo in quanto si legano a diversi epitopi.
   NOTA: SH3 non è un intracorpo ma un dominio della proteina p59^fyn tirosin-chinasi che interagisce fisiologicamente con Nef.
2. Progettazione e test di varianti di dispositivo Nef-responsive seguendo il razionale descritto nel passaggio 1.3 (ad esempio, Proteina di fusione 1: tag di membrana, mKate, sdAb19, LD0, TCS-L e GAL4-VP16; Proteina di fusione 2: SH3, LD0 e TEVp; Uscita: UAS-EYFP; Nef (vedi tabella 3)).
3. Testare i dispositivi in cellule T HEK293FT e Jurkat.
   NOTA: Per ogni esperimento impostiamo un controllo negativo che è la consegna del dispositivo e la quantificazione dell'output in assenza della proteina di interesse
   1. Trasfezione di HEK293FT: Seguire la procedura descritta al punto 1.5.1 in presenza o in assenza di Nef.
   2. Trasfezione di cellule T Jurkat: seguire la procedura descritta al punto 1.5.2 in presenza o in assenza di Nef.
   3. 48 ore dopo la trasfezione, analizzare i campioni con il citometro a flusso come descritto nel Protocollo 2.
4. Infettare le cellule Jurkat con ceppi HIV LAI per il rilevamento dell'HIV.
   1. Preparare le scorte virali almeno 48 ore prima dell'esperimento. Utilizzare il virus ottenuto dalla trasfezione di cellule HEK-293T con cloni molecolari infettivi (programma di reagenti NIH AIDS) e reagenti commerciali utilizzando le istruzioni del produttore. Concentrare il virus dopo 40 ore mediante ultracentrifugazione per 1 ora, 64.074 x g, 4°C su saccarosio al 20% per evitare l'uso di proteine prive di particelle virali. Titoli virali con HIV-1 p24 ELISA.
   2. Infettare le cellule con ceppi di HIV-1 con 500 ng di inoculo p24. 40 ore dopo l'infezione, quantificare la percentuale di cellule infette rilevando la proteina virale p24 con l'anticorpo coniugato KC57-FITC ed eseguendo l'analisi della citometria a flusso.
   3. Colorare le cellule con gli anticorpi coniugati AlexaFluor 647 clone W6/32 contro HLA-A, B, C. Fissare le cellule e analizzarle su un citometro a flusso. Downmodulazione mediata da Nef di HLA-I nelle cellule T Jurkat in presenza o assenza del dispositivo sensore proteico.

Un'architettura per la rilevazione modulare delle proteine intracellulari
Come mostrato in Figura 1, il dispositivo è composto da: 1) intrabody 1 collegato al marcatore fluorescente legato alla membrana (mKate) e al sito di clivaggio TEVp (TCS), seguito da un GAL4VP16 attivatore di trascrizione (TF); 2) intracorpo 2 fuso alla proteasi TEV (TEVp), libero nel citosol; 3) un promotore sintetico sensibile al GAL4VP16, che guida l'espressione...

Fino a poco tempo fa, l'interrogazione delle cellule basata sull'ambiente intracellulare veniva eseguita con sistemi sviluppati de novo per bersagli specifici. Il presente protocollo descrive un esempio del più recente approccio di ingegneria cellulare per il rilevamento e l'attuazione delle proteine in un unico dispositivo, che può essere rapidamente adattato ai nuovi biomarcatori desiderati.

Questo sistema pionieristico rileva le proteine intracellulari e ...

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo lavoro è stato sostenuto dall'Istituto Italiano di Tecnologia.