Engineering Intracellular Protein Sensors in Mammalian Cells(포유류 세포의 세포 내 단백질 센서 엔지니어링)

여기에서는 유전적으로 암호화된 세포 내 단백질 센서 액추에이터를 엔지니어링하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 장치는 세포 내 항체(intrabody)를 통해 표적 단백질을 특이적으로 검출하고 유전자 전사 출력을 켜서 반응합니다. 일반적인 프레임워크는 체내(intrabody)를 빠르게 대체하도록 구축되어 일반적인 구조를 변경하지 않고도 원하는 단백질을 빠르게 검출할 수 있습니다.

단백질은 신경퇴행성 질환, 감염 또는 대사 증후군과 같은 병리학적 상태의 바이오마커로 기능할 수 있습니다. 이러한 바이오마커를 감지하고 반응하도록 세포를 엔지니어링하면 병리학의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하고 새로운 세포 기반 치료법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다. 세포 외 단백질을 감지하는 여러 시스템이 개발되었지만, 다양한 세포 내 단백질을 감지하기 위해 쉽게 재설계할 수 있는 모듈식 프레임워크는 부족했습니다.

여기에서는 세포 내 단백질을 감지하고 특정 세포 반응을 활성화하는 모듈식 유전자 플랫폼을 구현하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 장치는 세포 내 항체 또는 작은 펩타이드에서 작동하여 관심 단백질을 높은 특이도로 감지하여 TEV 프로테아제(TEVp) 기반 작동 모듈을 통해 출력 유전자의 전사 활성화를 트리거합니다. TEVp는 짧은 동족 펩타이드를 선택적으로 절단하는 바이러스 프로테아제이며 절단 부위에 대한 높은 직교성으로 인해 생명공학 및 합성 생물학에서 널리 사용됩니다. 특히, 당사는 헌팅턴병, C형 간염 바이러스(HCV) 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 감염을 각각 검출하기 위해 돌연변이 헌팅틴, NS3 세린 프로테아제, Tat 및 Nef 단백질을 포함하여 바이러스 감염 및 유전 질환의 단백질 바이오마커를 인식하고 반응하는 장치를 설계했습니다. 중요한 것은 이 시스템을 바이오센서에 대한 형광 판독, 면역 반응을 위한 항원 제시 자극 또는 건강하지 않은 세포를 제거하기 위한 세포사멸 시작과 같은 원하는 입력-출력 기능 결과에 맞게 수동으로 조정할 수 있다는 것입니다.

제어 가능한 유전자 회로를 통한 세포 반응의 연구와 조절은 암⁴, 감염⁵, 대사질환⁶, 면역학⁷ 분야에서 생물학적, 의학적 응용을 할 수 있는 유망한 도구를 개발하기 위한 합성생물학 ^1,2,3의 주요 목표이다.

특정 신호에 대한 반응으로 세포 기능을 재프로그래밍하려면 세포 외 또는 세포 내 동적 변화(입력) 감지를 다운스트림 처리에 연결하여 진단 목적(예: 리포터 유전자) 또는 세포 반응 재배선(치료학)을 위해 특정 출력을 트리거하는 스마트 인터페이스를 설계해야 합니다. 감지 모듈에 의해 감지된 입력은 질병의 발병 또는 진행에 특이적인 작은 분석물⁸, 단백질 ^9,10,11 또는 microRNA 11,12,13일 수 있습니다. 더욱이, 복잡한 회로 조절은 다중 입력 정보 처리에 의해 달성될 수 있으며, 정의된 조건 ^14,15,16에 대한 응답으로 전이유전자 발현에 대한 엄격한 제어를 증가시킬 수 있습니다. 예를 들어, microRNA 기반 센서는 암세포와 같은 특정 세포 유형을 식별하여 세포사멸 유전자(apoptotic gene)의 발현으로 세포를 제거할 수 있습니다¹³. microRNA는 모듈 방식으로 합성 회로에서 쉽게 구현할 수 있기 때문에 유전적으로 인코딩된 바이오 센서에 널리 사용되는 입력입니다 12,13,17. 단백질은 또한 유전적 돌연변이, 암 및 감염에 대한 유효한 바이오마커이며, 실제로 많은 세포 외 단백질 감지 장치가 보고되었습니다^18,19.

세포외 단백질을 감지하는 많은 회로는 전사 인자(TF)를 막에 묶고 TEVp 반응성 절단 부위(TCS)에 융합하는 공학적 수용체의 사용에 의존합니다. TEVp의 주요 장점은 분열의 특이성과 내인성 단백질 처리에 대한 간섭이 없다는 것입니다. 이러한 시스템에서 TEVp는 세포외 분자의 결합 시 엔지니어링된 수용체와 상호 작용하는 두 번째 펩타이드에 융합됩니다. 따라서 외부 입력은 TEVp 매개 분열 및 TF 방출을 유도합니다. 이 메커니즘으로 작동하는 시스템은 Tango/TEVp¹⁸, light-induced²⁰ 및 Modular Extracellular Sensor Architecture (MESA)¹⁹입니다. 세포 외 단백질 검출의 진전에도 불구하고, 모듈식 방식으로 세포 내 단백질을 감지하는 기술은 특정 단백질에 반응하는 단일 장치에 대해 많은 빌드 및 테스트 반복을 거쳐야 하는 한계와 함께 이전에는 실현되지 않았습니다.

당사의 시스템은 세포 내 단백질 감지를 위한 최초의 플랫폼입니다²¹. 모듈성은 표적에 대한 특이성을 정의하는 intrabody를 사용하여 보장되는 반면, 세포 재프로그래밍은 TEVp 매개 변수입니다. 구체적으로, 하나의 몸 내 막이 결합되어 형광 단백질 mKate, TCS 및 TF (융합 단백질 1)에 C 말단에 융합됩니다. 두 번째 intrabody는 TEVp에 융합되어 세포질(융합 단백질 2)에 위치합니다(그림 1).

따라서 두 intrabody와 표적 단백질 간의 상호 작용은 세포질에서 발생하고 TEVp에 의한 TCS 절단으로 이어지며 TF 전좌를 초래하여 기능적 출력을 활성화합니다. 감지-작동 장치는 HCV 바이러스에 의해 발현되는 NS3 세린 프로테아제²², HIV 감염으로 인한 Tat 및 Nef 단백질^23,24, 헌팅턴병의 돌연변이 헌팅틴(HTT)²⁵ 등 4가지 세포 내 질병 특이적 단백질에 대해 성공적으로 테스트되었습니다. 출력 발현에는 형광 리포터, 자가사멸 유전자(hBax)²⁶ 및 면역조절제(XCL-1)²⁷가 포함됩니다. 우리는 시스템이 표적의 병리학적 기능도 손상시킬 수 있음을 보여줍니다. 예를 들어, Nef-responsive device는 표적 단백질을 격리하고 감염된 T 세포에서 HLA-I 수용체의 하향 조절을 되돌려 바이러스 감염의 확산을 방해합니다²⁴. 설명된 감지 작동 플랫폼은 세포 내 단백질을 검출하기 위한 최초의 제품이며, 진단 및 치료 목적으로 비정상적인 단백질 발현, 번역 후 또는 후성유전학적 변형을 감지하기 위해 잠재적으로 구현될 수 있습니다²⁰.

1. 센서 액추에이터 장치의 구성 및 테스트를 위한 설계 원칙

1. 관심 단백질을 선택합니다.
   참고: 우리는 세포질에 위치하거나 세포질과 다른 구획 사이를 왕복하는 단백질을 위한 시스템을 설계했습니다.
2. 타겟 단백질의 서로 다른 epitopes와 결합하는 두 개의 intrabody를 선택합니다. 본 연구에서는 intrabody가 이미 개발되고 테스트된 단백질을 선택했습니다 ^28,29,30,31. intrabody를 사용할 수 없는 경우 새로 개발해야 합니다.
   참고: intrabody의 대안은 관심 단백질과 상호 작용하는 다른 분자일 수 있습니다. 예를 들어, Nef 감지 장치는 하나의 몸내(sdAb19) 및 p59fyn 단백질 티로신 키나아제³²의 SH3 도메인을 포함합니다.
3. 융합 단백질을 인코딩하는 DNA 염기서열로 플라스미드를 in silico로 설계합니다.
   참고: 플라스미드 설계를 위한 소프트웨어는 무료로 제공되거나 구매될 수 있습니다.
   1. 멤브레인 태그, 형광 마커(예: mKate), 융합 단백질 1의 경우 intrabody, TCS 및 TF, 융합 단백질 2의 경우 intrabody 및 TEVp 모듈을 포함하는 염기서열을 생성합니다.
      참고: 여러 구성 요소의 상호 작용을 기반으로 새로운 아키텍처를 구축하려면 표적 단백질이 검출될 때 신호 활성화를 최대화할 수 있는 매개변수에 주의를 기울여야 합니다. 특히, 단백질-단백질 상호 작용을 촉진하기 위해 키메라 단백질의 TEVp 활성과 유연성에 중점을 두었습니다(표 1). 이러한 모든 기능은 다음 사항에 지정되어 있습니다.
   2. 몸내-TCS 및/또는 TEVp-몸내 사이에 유연한 글리신-세린 링커 도메인(LD)을 삽입합니다. LD는 가변 길이 (0, 10 또는 15 아미노산 -AA) 일 수 있습니다.
   3. 융합 단백질 1: TEVp 분할 활성을 조절하기 위해 높은 친화성 TCS(S) 또는 낮은 친화성 TCS(L)를 포함하는 변형을 설계합니다. 이 구성의 표현은 구성적 프로모터에 의해 주도됩니다. TEVp 절단 시 핵으로의 전좌를 허용하기 위해 TCS의 C-말단에 GAL4VP16 전사 인자를 포함시킵니다.
      참고: hEF1a promoter를 사용했지만 다른 구성 promoter를 선택할 수 있습니다.
   4. 융합 단백질 2: 구성(hEF1a) 또는 독시클리신 유도성(pTET) 프로모터를 사용하여 TEVp 전사를 조정합니다. 단백질 안정성을 조절하기 위해 소분자 실드에 의해 조절되는 분해 도메인(DD)을 사용합니다.
      참고: 단백질 발현을 조정하는 다른 유도 가능한 시스템을 잠재적으로 선택할 수 있습니다.
   5. 출력: 전사 인자에 반응하는 리포터 유전자 다운스트림 UAS 프로모터GAL4VP16 배치합니다. 장치의 용도에 따라 출력을 선택합니다(예: 형광 단백질, 사이토카인 등).
4. 선호하는 전략으로 복제를 수행합니다. 여기에서 우리는 골든 게이트 또는 게이트웨이 기술로 플라스미드를 구축했습니다.
5. transient transfection에 의해 원하는 세포주에서 장치의 다양한 구성을 테스트합니다. 얻어진 융합 단백질 1 및 2 및 UAS-EYFP 같은 형광 리포터 유전자에 대한 플라스미드와 세포를 동시 transfection합니다. 융합 단백질 1은 형질주입 마커로 사용되는 적색 형광 단백질(mkate)을 포함한다.
   참고: HEK293FT 세포와 같이 transfection이 간편한 세포주부터 시작하여 장치를 테스트합니다.
   1. HEK293FT 세포에서의 transfection. 2 x 10⁵ 세포를 500μL의 DMEM이 있는 24웰 플레이트에 시딩합니다. transfection 시약을 사용하여 총 300ng의 DNA로 세포를 transfection하고 혼합물을 소용돌이치며 RT에서 20분 동안 배양합니다.
      1. 37°C/5% CO₂ 인큐베이터에 세포를 넣습니다. transfection 후 24시간 후에 신선한 배양 배지를 추가합니다.
   2. Jurkat 세포에서의 형질주입(Transfection). 24-well 플레이트에 대해 500μL의 RPMI 세포 배양 배지에 3 x 10⁵ 세포를 사용합니다. 제조업체의 지시에 따라 electroporation을 수행하십시오. 각 샘플에 대해 총 DNA의 2-4 μg을 사용합니다. transfection 24시간 후 500μL의 신선한 세포 배양 배지를 추가합니다.
      1. 전기천공법(electroporation) 중에는 세포와 DNA 혼합물을 얼음 위에 올려 놓습니다. 그런 다음 세포를 37 °C/5% CO₂ 인큐베이터에 넣습니다.
         참고: 다양한 세포주 및 transfection 방법은 장치의 특정 용도에 따라 선택될 수 있습니다.
6. 장치의 기능에 대한 정성적 이해를 얻기 위해 현미경 이미지를 획득합니다. 세포막에 근접한 형광 신호(mkate)를 검출하여 융합 단백질 1의 막 국소화를 확인합니다. 표적 단백질의 존재 또는 부재(negative control-NC)에서 형광 출력(EYFP)을 시각화합니다.
   1. Tx Red 및 GFP 라이트 큐브가 장착된 세포 이미징 시스템을 사용하여 mKate 및 EYFP 형광 단백질을 검출할 수 있습니다. 10x 또는 20x 대물렌즈를 사용합니다.
      참고: 형질 주입되지 않은 세포를 사용하여 자가형광이 없는지 확인합니다.
7. 유세포분석법(FACS)을 사용한 transfection을 분석합니다.
   참고: 샘플 준비는 프로토콜 2를 참조하십시오.
   1. 타겟 단백질이 있는 상태에서 장치를 평가합니다. 융합 단백질 1 및 2의 변이체를 결합한 실험 매트릭스를 생성하고, TEVp를 (i) 구성적 hEf1a 프로모터, (ii) 독시사이클린 유도성 TET 프로모터 및 (iii) 단백질 안정성을 위한 보호막으로 조절합니다. 농도(0-1000nM)에서 독시사이클린과 쉴드를 추가합니다.
   2. FACS 분석을 수행하여 관심 단백질이 있거나 없는 샘플 간 EYFP의 접힘 유도를 비교합니다.
      참고: 가장 높은 폴드 유도는 OFF(표적 단백질의 부재) 모드와 비교하여 ON(표적 단백질의 존재)에서 가장 큰 입력 감도에 해당합니다.
8. 원하는 응용 프로그램과 관련하여 장치의 기능을 테스트합니다.
   1. FACS 분석을 실행하여 출력 단백질 또는 세포사멸 또는 기타 관련 분석법의 수준을 측정합니다.
   2. 장치의 출력 부분이 표적 유전자의 발현 수준을 조절하는 경우 RT PCR 분석을 수행합니다. 하우스키핑 유전자(GAPDH 또는 이에 상응하는 유전자)에 대해 ^2-ddCT 를 계산하고 ON 및 OFF 모드에서 출력 발현의 폴드 변화를 비교합니다.

2. 유세포 분석을 위한 시료 전처리

1. transfection 48시간 후 유세포분석기(FACS)를 사용하여 단백질 장치의 정량 분석을 수행합니다.
   1. DMEM 배지를 흡입하고 300μL의 PBS로 HEK293FT 세포를 세척합니다. 트립신 100μL를 넣고 37°C/5% CO₂ 인큐베이터에 2-4분 동안 그대로 둡니다.
      참고: Jurkat 세포는 트립신을 필요로 하지 않습니다.
   2. 페놀 레드가 없는 DMEM 배지 400μL를 추가하고 세포를 재현탁시켜 응집 형성을 방지합니다. FACS 튜브로 전송합니다.
   3. 405, 488 및 561nm 레이저가 장착된 유세포 분석기를 사용합니다.
   4. EYFP/EGFP의 경우 488nm 레이저 및 530/30nm 대역통과 필터, mKate의 경우 561nm 레이저 및 610/20nm 필터, EBFP의 경우 405nm 레이저, 450/50 필터와 같은 세포분석기 설정을 사용하여 살아있는 세포 집단에서 선택한 30,000 – 100,000개의 이벤트를 수집합니다.
      참고: 유세포 분석기를 설정하려면 transfection되지 않은 세포와 단일 형광 단백질로 transfection된 세포를 포함합니다.
   5. 선호하는 소프트웨어(예: DIVA 소프트웨어, Flowjo 또는 TASBE³³ 방법)를 사용하여 수집된 샘플의 분석을 수행합니다.

3. HCV 센서-액추에이터 장치의 특성화

1. NS3 단백질을 검출할 intrabody를 선택합니다. scFv35 및 scFv162는 두 개의 서로 다른 항원결정기에 결합하므로 선택되었습니다.
2. 1.3단계에서 설명한 합리적에 따라 NS3 반응 장치의 변형을 설계 및 테스트합니다(예: 융합 단백질 1: 멤브레인 태그, mKate, 단쇄 단편 intrabody scFv35, LD0, TCS-L 및 TF GAL4VP16; 융합 단백질 2: 단쇄 단편 몸내 scFv162, LD0 및 TEVp; 출력: UAS-EYFP 또는 UAS-hBax (세포사멸); NS3( 표 2 참조)).
3. HEK293FT 셀에서 구문을 테스트합니다.
   참고: 각 실험에 대해 negative control(음성 대조군)을 설정하는데, 이는 관심 단백질이 없는 경우 장치 및 출력 정량화를 제공합니다.
   1. NS3의 존재 또는 부재 상태에서 구성 프로모터 아래에서 TEVp에 대해 장치를 테스트합니다. 1.5.1단계에서 설명한 대로 HEK293FT 세포에서 융합 단백질 1(단계 1.3.3), 융합 단백질 2(단계 1.3.4) 및 EYFP 출력 단계(1.3.5)의 형질주입을 수행합니다. 유세포 분석법(프로토콜 2)으로 형광 리포터(EYFP)를 측정하여 transfection 48시간 후 샘플을 분석합니다.
   2. BFP-NS3 융합 단백질을 사용하여 mKate 및 BFP 공동 국소화에 의한 intrabody-NS3 상호 작용을 평가합니다. mKate를 포함하는 융합 단백질 1 및 BFP-NS3로 세포를 transfection합니다. transfection 후 48시간 동안 컨포칼 현미경(63x 대물렌즈)에서 세포를 관찰하여 형광 단백질의 공동 국소화를 테스트합니다.
      참고: BFP(NS3에 융합되지 않음)를 네거티브 컨트롤로 사용합니다. 이 조건에서 BFP는 확산 세포 국소화를 보여야 하며 막 결합 mKate와 공동 국소화되어서는 안 됩니다.
   3. NS3의 존재 여부에 관계없이 pTET 프로모터 아래에서 TEVp에 대한 장치를 테스트합니다. NS3의 부재 및 존재 시 EYFP를 비교합니다. 1.5.1단계에 설명된 프로토콜을 사용하여 융합 단백질 1(단계 1.3.3), 융합 단백질 2(단계 1.3.4) 및 EYFP 출력(단계 1.3.5)과 세포를 동시 형질주입합니다. Transfection은 NS3의 존재 또는 부재 상태에서 수행됩니다. 유세포 분석법(프로토콜 2)으로 형광 리포터(EYFP)를 측정하여 transfection 48시간 후 샘플을 분석합니다.
4. NS3 장치에 의해 구동되는 테스트 셀 살해.
   1. EYFP 출력을 apoptotic 유전자 hBax로 대체합니다.
   2. 3.3.3단계를 반복합니다. transfection 48시간 후 세포를 수집하고 분석을 시작하기 전에 PBS로 세척합니다.
   3. Pacific Blue에 접합된 Annexin V로 세포사멸 분석을 수행합니다. 실온에서 10분 동안 결합 완충액(1:20 부피 비율)에 희석된 apoptotic marker Annexin V(2.5μL의 Pacific Blue와 접합)가 있는 세포를 염색합니다.
   4. 유세포 분석으로 세포를 분석합니다. 집단 내 세포사멸 수준을 Pacific-Blue(Annexin V) 양성 세포의 수로 계산합니다.

4. Nef 반응성 HIV 센서 액추에이터 장치의 특성화

1. Nef에 바인딩하는 본체 내부를 선택합니다. 단일 도메인 intrabody sdAb19 및 SH3는 서로 다른 에피토프에 결합할 때 선택되었습니다.
   참고: SH3는 체내 세포가 아니라 Nef와 생리학적으로 상호 작용하는 p59^fyn 단백질 티로신 키나아제의 도메인입니다.
2. 1.3단계에서 설명한 합리적에 따라 Nef 반응 장치의 변형을 설계 및 테스트합니다(예: 융합 단백질 1: 멤브레인 태그, mKate, sdAb19, LD0, TCS-L 및 GAL4-VP16; 융합 단백질 2: SH3, LD0 및 TEVp; 출력: UAS-EYFP; Nef( 표 3 참조).
3. HEK293FT 및 Jurkat T 세포에서 장치를 테스트합니다.
   참고: 각 실험에 대해 우리는 관심 단백질이 없는 경우 장치 및 출력 정량화를 전달하는 음성 대조군을 설정합니다
   1. HEK293FT의 형질주입: Nef의 유무에 관계없이 1.5.1단계에 설명된 절차를 따릅니다.
   2. Jurkat T 세포의 형질주입: Nef의 유무에 관계없이 1.5.2단계에 설명된 절차를 따릅니다.
   3. transfection 후 48시간, 프로토콜 2에 설명된 대로 유세포 분석기로 샘플을 분석합니다.
4. HIV 검출을 위해 Jurkat 세포를 HIV LAI 균주로 감염시킵니다.
   1. 실험 최소 48시간 전에 바이러스 스톡을 준비합니다. HEK-293T 세포를 감염성 분자 클론(NIH AIDS 시약 프로그램) 및 제조업체 지침에 따라 상용 시약과 함께 형질 주입하여 얻은 바이러스를 사용합니다. 바이러스 입자가 없는 단백질을 피하기 위해 20% 자당에 1시간, 64,074 x g, 4°C 동안 초원심분리하여 40시간 후 바이러스를 농축합니다. HIV-1 p24 ELISA를 가진 역가 바이러스 주식.
   2. HIV-1 균주에 감염된 세포를 500ng의 p24 접종물로 감염시킵니다. 감염 후 40시간 동안 KC57-FITC 접합 항체로 바이러스 단백질 p24를 검출하고 유세포 분석을 수행하여 감염된 세포의 비율을 정량화합니다.
   3. AlexaFluor 647 복합 항체 클론 W6/32를 HLA-A, B, C에 대해 염색합니다.세포를 고정하고 유세포 분석기에서 분석합니다. 단백질 센서 장치의 유무에 따라 Jurkat T 세포에서 HLA-I의 Nef 매개 하향 조절.

모듈식 세포 내 단백질 검출을 위한 아키텍처
그림 1에서 볼 수 있듯이, 장치는 다음과 같이 구성됩니다 : 1) 멤브레인 테더 형광 마커 (mKate) 및 TEVp 절단 부위 (TCS)에 연결된 intrabody 1, 이어서 전사 활성화제 GAL4VP16 (TF); 2) 세포질에서 자유로운TEV 프로테아제(TEVp)에 융합된 몸내 2; 3) GAL4VP16에 반응하여 리포터 유전자의 발현을 유도하는 합...

최근까지, 세포 내 환경을 기반으로 한 세포 조사는 특정 표적을 위해 de novo로 개발된 시스템으로 수행되었습니다. 본 프로토콜은 원하는 새로운 바이오마커에 빠르게 적용할 수 있는 하나의 장치에서 단백질을 감지하고 작동하기 위한 가장 최근의 세포 엔지니어링 접근 방식의 예를 설명합니다.

이 선구적인 시스템은 세포 내 단백질을 감지하고 질?...

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없다고 선언합니다.

이 작업은 Istituto Italiano di Tecnologia의 지원을 받았습니다.