JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להנדסת חיישנים-מפעילים של חלבון תוך תאי מקודד גנטית. המכשיר מזהה באופן ספציפי חלבוני מטרה באמצעות נוגדנים תוך-תאיים (תוך-גופים) ומגיב על ידי הפעלת פלט שעתוק גנים. מסגרת כללית נבנתה כדי להחליף במהירות את התוך-גופים, ומאפשרת זיהוי מהיר של כל חלבון רצוי, מבלי לשנות את הארכיטקטורה הכללית.

Abstract

חלבונים יכולים לתפקד כסמנים ביולוגיים של מצבים פתולוגיים, כגון מחלות ניווניות, זיהומים או תסמונות מטבוליות. הנדסת תאים לחוש ולהגיב לסמנים ביולוגיים אלה עשויה לסייע בהבנת המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס הפתולוגיות, כמו גם לפתח טיפולים חדשים מבוססי תאים. בעוד שפותחו מספר מערכות המזהות חלבונים חוץ-תאיים, חסרה מסגרת מודולרית שניתן להנדס מחדש בקלות כדי לחוש חלבונים תוך-תאיים שונים.

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליישום פלטפורמה גנטית מודולרית החשה חלבונים תוך-תאיים ומפעילה תגובה תאית ספציפית. המכשיר פועל על נוגדנים תוך-תאיים או פפטידים קטנים כדי לחוש בספציפיות גבוהה את החלבון המבוקש, ומפעיל את הפעלת השעתוק של גני הפלט, באמצעות מודול הפעלה מבוסס TEV פרוטאז (TEVp). TEVp הוא פרוטאז ויראלי המבקע באופן סלקטיבי פפטידים קוגנטיים קצרים ונמצא בשימוש נרחב בביוטכנולוגיה ובביולוגיה סינתטית בשל האורתוגונליות הגבוהה שלו לאתר המחשוף. באופן ספציפי, הנדסנו מכשירים המזהים ומגיבים לסמנים ביולוגיים של חלבונים של זיהומים נגיפיים ומחלות גנטיות, כולל הנטינגטין שעבר מוטציה, NS3 סרין-פרוטאז, חלבוני Tat ו-Nef כדי לזהות זיהומים של מחלת הנטינגטון, נגיף הפטיטיס C (HCV) ונגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV), בהתאמה. חשוב לציין, ניתן להתאים את המערכת באופן ידני לתוצאה התפקודית הרצויה של קלט-פלט, כגון קריאות פלואורסצנטיות לחיישנים ביולוגיים, גירוי הצגת אנטיגן לתגובה חיסונית, או התחלת אפופטוזיס כדי לחסל תאים לא בריאים.

Introduction

המחקר והמודולציות של תגובות תאיות באמצעות מעגלי גנים מהונדסים הניתנים לשליטה הם מטרות עיקריות בביולוגיה סינתטית 1,2,3 לפיתוח כלים פרוספקטיביים עם יישומים ביולוגיים או רפואיים רלוונטיים בסרטן4, זיהומים5, מחלות מטבוליות6 ואימונולוגיה7.

תכנות מחדש של פונקציות תאים בתגובה לאותות ספציפיים דורש תכנון של ממשקים חכמים המקשרים חישה של שינויים דינמיים חוץ-תאיים או תוך-תאיים (קלט) לעיבוד במורד הזרם, ומפעילים פלט ספציפי למטרות אבחון (כלומר, גנים מדווחים) או לחיווט מחדש של תגובת התא (טיפולים). הכניסות שזוהו על ידי מודול החישה יכולות להיות אנליטים קטנים8, חלבונים 9,10,11 או מיקרו-רנ"א 11,12,13, ספציפיים להופעה או התקדמות של מחלה. יתר על כן, ניתן להשיג ויסות מעגלים מורכב על ידי עיבוד מידע קלט מרובה, מה שמגדיל את הבקרה ההדוקה על ביטוי טרנסגנים בתגובה לתנאים המוגדרים 14,15,16. לדוגמה, חיישנים מבוססי מיקרו-רנ"א יכולים לזהות סוגי תאים ספציפיים, כגון תאים סרטניים, ולגרום לפינוי שלהם עם ביטוי של גן אפופטוטי13. מכיוון שמיקרו-רנ"א ניתנים ליישום בקלות במעגלים סינתטיים בצורה מודולרית, הם מייצגים קלט בשימוש נרחב עבור חיישנים ביולוגיים מקודדים גנטית 12,13,17. חלבונים הם גם סמן ביולוגי תקף למוטציות גנטיות, סרטן וזיהומים, ואכן דווח על מספר מכשירי חישת חלבונים חוץ-תאיים18,19.

רבים מהמעגלים המזהים חלבונים חוץ-תאיים מסתמכים על שימוש בקולטנים מהונדסים, הקושרים גורם שעתוק (TF) לממברנה, המאוחים לאתר מחשוף מגיב ל-TEVp (TCS). יתרון מרכזי של ה-TEVp הוא הספציפיות של המחשוף והיעדר הפרעה לעיבוד חלבון אנדוגני. במערכות אלה, TEVp מותך לפפטיד שני המקיים אינטראקציה עם הקולטן המהונדס בעת קשירת המולקולות החוץ-תאיות. לפיכך, הכניסות החיצוניות גורמות למחשוף בתיווך TEVp ושחרור TF. מערכות המתפקדות עם מנגנון זה הן Tango/TEVp18, אורמושרה 20 וארכיטקטורת חיישנים חוץ-תאית מודולרית (MESA)19. למרות ההתקדמות בזיהוי חלבונים חוץ-תאיים, הטכנולוגיה לחישת חלבונים תוך-תאיים בצורה מודולרית מעולם לא מומש בעבר, עם המגבלה של לעבור איטרציות רבות של בנייה ובדיקה עבור מכשירים בודדים המגיבים לחלבון ספציפי.

המערכת שלנו היא הפלטפורמה הראשונה לחישת חלבון תוך-תאית21. המודולריות מובטחת על ידי שימוש בגופים תוך-גופים המגדירים את הספציפיות למטרה, בעוד שתכנות התאים מחדש מתווך TEVp. באופן ספציפי, גוף פנימי אחד קשור לממברנה ומאוחה למסוף C לחלבון פלואורסצנטי mKate, TCS ו-TF (חלבון היתוך 1); הגוף הפנימי השני מאוחה ל-TEVp וממוקם בציטוזול (חלבון היתוך 2) (איור 1).

לפיכך, האינטראקציה בין שני גופים תוך-גופים לחלבון המטרה מתרחשת בציטופלזמה ומובילה לפיצול TCS על ידי TEVp, וכתוצאה מכך טרנסלוקציה של TF לתוך הגרעין כדי להפעיל את הפלט התפקודי. מכשיר החישה נבדק בהצלחה עבור ארבעה חלבונים תוך-תאיים ספציפיים למחלה: NS3 serine protease המתבטא על ידי נגיף HCV22, חלבוני Tat ו-Nef מזיהום HIV23,24, והנטינגטין שעבר מוטציה (HTT) של מחלת הנטינגטון25. ביטוי הפלט כולל מדווחים פלואורסצנטיים, גן אפופטוטי (hBax)26 ואימונומודולטורים (XCL-1)27. אנו מדגימים כי המערכת יכולה גם לפגוע בתפקוד הפתולוגי של מטרותיה. לדוגמה, המכשיר המגיב ל-Nef מפריע להתפשטות זיהום ויראלי על ידי בידוד חלבון המטרה והחזרת המודולציה של קולטן HLA-I על תאי T נגועים24. פלטפורמת החישה-הפעלה המתוארת היא הראשונה מסוגה לזיהוי חלבונים תוך-תאיים וניתן ליישם אותה באופן פוטנציאלי כדי לחוש ביטוי חלבון חריג, שינויים לאחר תרגום או אפיגנטיים, למטרות אבחון וטיפול20.

Protocol

1. עקרונות תכנון לבנייה ובדיקה של מכשיר חיישן-מפעיל

  1. בחר חלבון מעניין.
    הערה: תכננו מערכת לחלבונים הממוקמים בציטופלזמה או עוברים בין הציטופלזמה לתאים אחרים.
  2. בחר שני גופים תוך-גופים הקושרים אפיטופים שונים של חלבון המטרה. במחקר שלנו בחרנו חלבונים שעבורם התוך-גופים כבר פותחו ונבדקו 28,29,30,31. כאשר הגופים התוך-גופים אינם זמינים, יש לפתח אותם מחדש.
    הערה: חלופה לתוך גופים יכולה להיות מולקולות אחרות המקיימות אינטראקציה עם החלבון המעניין. לדוגמה, מכשיר החישה Nef כולל גוף אחד (sdAb19) ואת תחום SH3 של חלבון p59fyn טירוזין קינאז32.
  3. תכנן בסיליקו את הפלסמידים עם רצפי DNA המקודדים את חלבוני ההיתוך.
    הערה: תוכנה לעיצוב פלסמיד זמינה בחינם או ניתנת לרכישה.
    1. צור רצפים הכוללים את המודולים הבאים: תג ממברנה, סמן פלואורסצנטי (למשל, mKate), תוך-גוף, TCS ו-TF עבור חלבון היתוך 1, ותוך גוף ו-TEVp עבור חלבון היתוך 2.
      הערה: בניית ארכיטקטורה חדשה המבוססת על אינטראקציה של מספר רכיבים דורשת תשומת לב לפרמטרים שעשויים למקסם את הפעלת האות כאשר חלבון המטרה מזוהה. באופן ספציפי, התמקדנו בפעילות TEVp ובגמישות של החלבונים הכימריים כדי להקל על אינטראקציה בין חלבון לחלבון (טבלה 1). כל התכונות הללו מפורטות בנקודות הבאות.
    2. הכנס תחום מקשר גליצין-סרין (LD) גמיש בין ה-TCS התוך-גוף ו/או TEVp-תוך הגוף. ה-LD עשוי להיות באורך משתנה (0, 10 או 15 חומצות אמינו-AA).
    3. חלבון היתוך 1: תכנן גרסאות הכוללות את TCS (S) בעל הזיקה הגבוהה או TCS (L) בעל הזיקה הנמוכה כדי לווסת את פעילות המחשוף של TEVp. הביטוי של מבנה זה מונע על ידי מקדם מכונן. כלול את גורם השעתוק GAL4VP16 במסוף C של TCS כדי לאפשר טרנסלוקציה לגרעין עם מחשוף TEVp.
      הערה: השתמשנו במקדם hEF1a, אך ניתן לבחור מקדמים מכוננים אחרים.
    4. חלבון היתוך 2: השתמש במקדם מכונן (hEF1a) או השראת דוקסיקליצין (pTET) כדי לכוונן את שעתוק TEVp. השתמש בתחום פירוק (DD) המווסת על ידי מגן המולקולה הקטנה כדי לווסת את יציבות החלבון.
      הערה: ניתן לבחור מערכות אינשוריות אחרות המכוונות את ביטוי החלבון.
    5. פלט: הצב מקדם כטב"ם של גן מדווח במורד הזרם המגיב לגורם השעתוק GAL4VP16. בחר את הפלט בהתאם ליישום המכשיר (כלומר, חלבון פלואורסצנטי, ציטוקין וכו').
  4. בצע שיבוט עם כל אסטרטגיה מועדפת. כאן, בנינו פלסמידים עם טכנולוגיות שער זהב או שער.
  5. בדוק את התצורה השונה של המכשיר בקווי התאים הרצויים על ידי טרנספקציה חולפת. טרנספט משותף של התאים עם הפלסמידים המתקבלים עבור חלבוני היתוך 1 ו-2 וגן מדווח פלואורסצנטי, כגון UAS-EYFP. חלבון היתוך 1 כולל חלבון פלואורסצנטי אדום (mkate) המשמש כסמן טרנספקציה.
    הערה: התחל עם קווי תאים פשוטים להעברה כגון תאים HEK293FT כדי לבדוק את ההתקנים.
    1. טרנספקציה בתאי HEK293FT. זרע 2 x 105 תאים לצלחת של 24 בארות עם 500 מיקרוליטר DMEM. טרנספקט תאים עם 300 ננוגרם של DNA כולל באמצעות מגיב טרנספקציה, מערבל את התערובת ודוגר ב-RT למשך 20 דקות.
      1. הנח תאים באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס/5% CO2 . הוסף תרבית טרייה בינונית 24 שעות לאחר ההעברה.
    2. טרנספקציה בתאי ג'ורקט. השתמש ב -3 x 105 תאים ב -500 מיקרוליטר של מדיום תרבית תאים RPMI לצלחת 24 בארות. בצע אלקטרופורציה בהתאם להוראות היצרן. השתמש ב-2-4 מיקרוגרם של DNA כולל עבור כל דגימה. הוסף 500 מיקרוליטר של מצע תרבית תאים טרי 24 שעות לאחר הטרנספקציה.
      1. במהלך אלקטרופורציה, מניחים תאים ו-DNA מתערבבים על קרח. לאחר מכן, הניחו את התאים בחממה של 37 מעלות צלזיוס/5% CO2 .
        הערה: ניתן לבחור קווי תאים שונים ושיטות טרנספקציה בהתאם ליישום הספציפי של המכשיר.
  6. רכוש תמונות מיקרוסקופ כדי לקבל הבנה איכותית של הפונקציונליות של המכשיר. אשר לוקליזציה של הממברנה של חלבון ההיתוך 1 על ידי זיהוי האות הפלואורסצנטי (mkate) בסמיכות לקרום התא. דמיין את הפלט הפלואורסצנטי (EYFP) בנוכחות או היעדר (בקרה שלילית-NC) של חלבון המטרה.
    1. השתמש במערכת הדמיית התאים המצוידת בקוביות אור Tx Red ו-GFP כדי לזהות חלבונים פלואורסצנטיים mKate ו-EYFP. השתמש במטרה 10x או 20x.
      הערה: השתמש בתאים שאינם עוברים טרנספטציה כדי להבטיח שאין אוטופלואורסצנטיות.
  7. נתח את הטרנספקציה עם ציטומטריית זרימה (FACS).
    הערה: ראה פרוטוקול 2 להכנת דגימה.
    1. הערך את המכשירים בנוכחות חלבון המטרה. צור מטריצה ניסיונית המשלבת גרסאות של חלבון היתוך 1 ו-2, מווסת TEVp עם (i) מקדם hEf1a מכונן (ii) מקדם TET המושרה על ידי דוקסיציקלין ו-(iii) מגן ליציבות החלבון. הוסף דוקסיציקלין ומגן בריכוזים (0-1000 ננומטר).
    2. בצע ניתוח FACS כדי להשוות את אינדוקציית הקיפול של EYFP בין דגימות עם או בלי חלבון מעניין.
      הערה: אינדוקציית הקיפול הגבוהה ביותר תואמת את רגישות הקלט הגדולה ביותר ב-ON (נוכחות חלבון המטרה) בהשוואה למצב OFF (היעדר חלבון המטרה).
  8. בדוק את הפונקציונליות של המכשיר ביחס ליישומים הרצויים.
    1. הפעל ניתוח FACS כדי למדוד את רמות חלבוני הפלט או האפופטוזיס, או מבחנים רלוונטיים אחרים.
    2. בצע ניתוח RT PCR אם חלק הפלט של המכשיר מווסת את רמות הביטוי של גני היעד. חשב 2-ddCT ביחס לגן שומר הבית (GAPDH או שווה ערך) והשווה את שינוי הקיפול של ביטוי הפלט במצבי ON ו-OFF.

2. הכנת מדגם לניתוח ציטומטריית זרימה

  1. בצע ניתוח כמותי של התקני חלבון עם ציטומטר זרימה (FACS) 48 שעות לאחר הטרנספקציה.
    1. שאפו את מדיית ה-DMEM ושטפו HEK293FT התאים עם 300 מיקרוליטר PBS. מוסיפים 100 מיקרוליטר טריפסין ומשאירים בחממה של 37 מעלות צלזיוס/5% CO2 למשך 2-4 דקות.
      הערה: תאי יורקאט אינם דורשים טריפסין.
    2. הוסף 400 מיקרוליטר של מדיה DMEM ללא פנול אדום והשהה מחדש את התאים כדי למנוע היווצרות גושים. העברה בצינורות FACS.
    3. השתמש בציטומטר זרימה המצויד בלייזרים 405, 488 ו-561 ננומטר.
    4. אסוף 30,000 - 100,000 אירועים שנבחרו מאוכלוסיית תאים חיים באמצעות הגדרות הציטומטר הבאות: לייזר 488 ננומטר ומסנן פס פס 530/30 ננומטר עבור EYFP/EGFP, לייזר 561 ננומטר ומסנן 610/20 ננומטר עבור mKate, ולייזר 405 ננומטר, מסנן 450/50 עבור EBFP.
      הערה: כדי להגדיר את ציטומטר הזרימה, כלול תאים שאינם עוברים טרנספטציה ותאים שהועברו עם חלבונים פלואורסצנטיים בודדים.
    5. לבצע ניתוח של דגימות שנאספו באמצעות תוכנה מועדפת (למשל, תוכנת DIVA, Flowjo או שיטת TASBE33).

3. אפיון מכשיר חיישן-מפעיל HCV

  1. בחר תוך גופים כדי לזהות חלבון NS3. scFv35 ו-scFv162 נקשרים לשני אפיטופים שונים ולכן נבחרו.
  2. תכנון ובדיקה של גרסאות של המכשיר המגיב ל-NS3 בהתאם לרציונל המתואר בשלב 1.3 (למשל, חלבון היתוך 1: תג ממברנה, mKate, שבר שרשרת בודד בתוך הגוף scFv35, LD0, TCS-L ו-TF GAL4VP16; חלבון היתוך 2: שבר שרשרת בודד בתוך הגוף scFv162, LD0 ו-TEVp; פלט: UAS-EYFP או UAS-hBax (אפופטוזיס); NS3 (ראה טבלה 2)).
  3. בדוק את המבנים בתאי HEK293FT.
    הערה: עבור כל ניסוי, הגדר בקרה שלילית שהיא אספקת המכשיר וכימות הפלט בהיעדר החלבון המעניין.
    1. בדוק את המכשירים ל-TEVp תחת מקדם מכונן בנוכחות או בהיעדר NS3. בצע טרנספקציה של חלבון היתוך 1 (שלב 1.3.3), חלבון היתוך 2 (שלב 1.3.4) ושלב פלט EYFP (1.3.5) בתאי HEK293FT כמתואר בשלב 1.5.1. נתח את הדגימות 48 שעות לאחר הטרנספקציה על ידי מדידת המדווח הפלואורסצנטי (EYFP) על ידי ציטומטריית זרימה (פרוטוקול 2).
    2. להעריך את האינטראקציה בתוך הגוף-NS3 על ידי mKate ו-BFP באמצעות חלבון ההיתוך BFP-NS3. תאי טרנספקט עם חלבון היתוך 1 הכולל mKate, ועם BFP-NS3. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, התבונן בתאים במיקרוסקופ קונפוקלי (אובייקטיבי פי 63) כדי לבדוק לוקליזציה משותפת של חלבונים פלואורסצנטיים.
      הערה: השתמש ב-BFP (לא התמזג ל-NS3) כבקרה שלילית. במצב זה BFP אמור להראות לוקליזציה תאית מפוזרת ולא אמור להתמקם יחד עם ה-mKate הקשור לממברנה.
    3. בדוק את המכשירים עבור TEVp תחת מקדם pTET בנוכחות או בהיעדר NS3. השווה EYFP בהיעדר ובנוכחות NS3. תאי טרנספקט משותף עם חלבון היתוך 1 (שלב 1.3.3), חלבון היתוך 2 (שלב 1.3.4) ופלט EYFP (שלב 1.3.5) באמצעות הפרוטוקול המתואר בשלב 1.5.1. טרנספקציות מבוצעות בנוכחות או בהיעדר NS3. נתח את הדגימות 48 שעות לאחר הטרנספקציה על ידי מדידת המדווח הפלואורסצנטי (EYFP) על ידי ציטומטריית זרימה (פרוטוקול 2).
  4. בדיקת הרג תאים מונעת על ידי מכשיר NS3.
    1. החלף את פלט EYFP בגן האפופטוטי hBax.
    2. חזור על שלב 3.3.3. אסוף את התאים 48 שעות לאחר הטרנספקציה ושטוף עם PBS לפני תחילת הבדיקה.
    3. בצע בדיקת אפופטוזיס עם נספח V מצומד לכחול פסיפי. תאי כתמים עם סמן אפופטוטי Annexin V (מצומד עם 2.5 מיקרוליטר של כחול פסיפי) מדולל במאגר מחייב (יחס נפח של 1:20) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.
    4. נתח את התאים על ידי ציטומטריית זרימה. חשב את רמת האפופטוזיס בתוך האוכלוסייה כמספר התאים החיוביים של Pacific-Blue (Annexin V).

4. אפיון מכשיר חיישן-מפעיל HIV מגיב ל-Nef

  1. בחר גופים פנימיים הנקשרים ל-Nef. sdAb19 ו-SH3 בתוך תחום יחיד נבחרו כשהם נקשרים לאפיטופים שונים.
    הערה: SH3 אינו תוך-גוף אלא תחום של חלבון p59fyn טירוזין קינאז המקיים אינטראקציה פיזיולוגית עם Nef.
  2. תכנון ובדיקה של גרסאות של מכשיר מגיב ל-Nef בהתאם לרציונל המתואר בשלב 1.3 (למשל, חלבון היתוך 1: תג ממברנה, mKate, sdAb19, LD0, TCS-L ו-GAL4-VP16; חלבון היתוך 2: SH3, LD0 ו-TEVp; פלט: UAS-EYFP; Nef (ראה טבלה 3)).
  3. בדוק את המכשירים בתאי HEK293FT ו-Jurkat T.
    הערה: עבור כל ניסוי אנו מגדירים בקרה שלילית שהיא אספקת המכשיר וכימות הפלט בהיעדר החלבון המעניין
    1. טרנספקציה של HEK293FT: בצע את ההליך המתואר בשלב 1.5.1 בנוכחות או בהיעדר Nef.
    2. טרנספקציה של תאי Jurkat T: בצע את ההליך המתואר בשלב 1.5.2 בנוכחות או בהיעדר Nef.
    3. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, נתח את הדגימות עם ציטומטר זרימה כמתואר בפרוטוקול 2.
  4. להדביק תאי ג'ורקט בזני HIV LAI לגילוי HIV.
    1. הכינו מלאי ויראלי לפחות 48 שעות לפני הניסוי. השתמש בנגיף המתקבל מהעברה של תאי HEK-293T עם שיבוטים מולקולריים זיהומיים (תוכנית ריאגנטים לאיידס) וריאגנטים מסחריים באמצעות הוראות היצרן. רכז את הנגיף לאחר 40 שעות על ידי אולטרה-צנטריפוגה למשך שעה, 64,074 x גרם, 4 מעלות צלזיוס על 20% סוכרוז כדי להימנע מחלבונים נגיפיים נטולי חלקיקים. מלאי טיטר ויראלי עם HIV-1 p24 ELISA.
    2. להדביק תאים בזני HIV-1 עם 500 ננוגרם של חיסון p24. 40 שעות לאחר ההדבקה מכמתים את אחוז התאים הנגועים על ידי זיהוי החלבון הנגיפי p24 עם נוגדן מצומד KC57-FITC וביצוע ניתוח זרימה-ציטומטריה.
    3. צבעו את התאים עם שיבוט נוגדנים מצומדים של AlexaFluor 647 W6/32 כנגד HLA-A, B, C. תקן את התאים ונתח על ציטומטר זרימה. Nef תיווך דאמודולציה של HLA-I בתאי Jurkat T בנוכחות או בהיעדר מכשיר חיישן החלבון.

תוצאות

ארכיטקטורה לזיהוי חלבון תוך-תאי מודולרי
כפי שמוצג באיור 1, המכשיר מורכב מ: 1) תוך-גוף 1 המחובר לסמן הפלואורסצנטי הקשור לממברנה (mKate) ולאתר המחשוף TEVp (TCS), ואחריו מפעיל שעתוק GAL4VP16 (TF); 2) תוך-גוף 2 התמזג לפרוטאז TEV (TEVp), חופשי בציטוזול; 3) מקדם סינתטי המגיב ...

Discussion

עד לאחרונה, חקירת תאים על בסיס סביבה תוך-תאית בוצעה במערכות שפותחו דה נובו למטרות ספציפיות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר דוגמה לגישה העדכנית ביותר, הנדסת תאים לחישה והפעלה של חלבונים במכשיר אחד, שניתן להתאים במהירות לסמנים ביולוגיים רצויים חדשים.

מערכת חלוצית ז?...

Disclosures

המחברים מצהירים שאין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המכון האיטלקי לטכנולוגיה.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AlexaFluor 647 mouse anti-human HLA-A, B, C antibody clone W6/32Biolegend311414Antibodies
Annexin VLifeTechnologiesA35122Apoptosis marker
AttracteneQiagen301005Transfection reagent
BD Falcon Round-Bottom TubesBD Biosciences352053FACS tubes
DoxycyclineClonetech-Cell Culture: Drugs
Dulbecco's modified Eagle mediumCellgro10-013-CMCell Culture: Medium
Evos Cell Imaging SystemLife TechnologyEVOS M5000Imaging systems; Infectious molecular clones
FACSDiva8 softwareBD Biosciences659523FACS software
Fast SYBR Green Master MixThermoFisher Scientific4385612qPCR reaction
FBS (Fetal Bovin Serum)Atlanta BIOS11050Cell Culture: Medium
Gateway SystemLife Technologies-Plasmid Construction
Golden Gate Systemin-house-Plasmid Construction
HEK 293FTInvitrogenR70007Cell Culture: Cells
Infusion Cloning SystemClonetech638920Plasmid Construction
JetPRIME reagentPolyplus transfection114-15Transcfection reagent
Jurkat CellsATCCTIB-152Cell Culture: Cells
L-GlutamineSigma-AldrichG7513-100MLCell Culture: Medium
Lipofectamine LTX with Plus ReagentThermo Fisher Scientific15338030Transfection reagent
LSR Fortessa flow cytometer (405, 488, and 561 nm lasers)BD Biosciences649225Flow cytometer
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate (0.1 mL)ThermoFisher Scientific4346907qPCR reaction
Neon Transfection SystemLife TechnologiesMPK10025Transfection reagent
Non-essential amino acidsHyCloneSH3023801Cell Culture: Medium
Opti-MEM I reduced serum mediumLife Technologies31985070Transfection medium
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP4458-100MLCell Culture: Medium
QuantiTect Reverse Transcription KitQiagen205313Rev Transcriptase kit
RNeasy Mini KitQiagen74106RNA extraction kit
RPMI-1640ATCCATCC 30­2001Cell Culture: Medium
ShieldClonetech632189Cell Culture: Drugs
SpheroTech RCP-30-5-A beadsSpherotechRCP-30- 5A-2Compensation set up
StepOnePlus 7500 Fast machineApplied Biosystems4351106qPCR reaction

References

  1. Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. Predicting Synthetic Gene Networks. Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).
  2. Krams, R., et al. Mammalian synthetic biology: emerging medical applications. J. R. Soc. Interface. 12, (2015).
  3. MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational Sequence Design with R2oDNA Designer. Methods in molecular biology. 1651, 249-262 (2017).
  4. Zah, E., Lin, M. -. Y., Silva-Benedict, A., Jensen, M. C., Chen, Y. Y. T cells expressing CD19/CD20 bi-specific chimeric antigen receptors prevent antigen escape by malignant B cells. Cancer Immunology Research. 4, 498-508 (2016).
  5. Wu, F., Bethke, J. H., Wang, M., You, L. Quantitative and synthetic biology approaches to combat bacterial pathogens. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 116-126 (2017).
  6. Ye, H., et al. Pharmaceutically controlled designer circuit for the treatment of the metabolic syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 141-146 (2013).
  7. Caliendo, F., Dukhinova, M., Siciliano, V. Engineered Cell-Based Therapeutics: Synthetic Biology Meets Immunology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  8. Thaker, M. N., Wright, G. D. Opportunities for synthetic biology in antibiotics: Expanding glycopeptide chemical diversity. ACS Synthetic Biology. 4, 195-206 (2015).
  9. Culler, S. J., Hoff, K. G., Smolke, C. D. Reprogramming cellular behavior with RNA controllers responsive to endogenous proteins. Science. 330, 1251-1255 (2010).
  10. Ausländer, S., et al. A general design strategy for protein-responsive riboswitches in mammalian cells. Nature Methods. 11, 1154-1160 (2014).
  11. Cella, F., Siciliano, V. Protein-based parts and devices that respond to intracellular and extracellular signals in mammalian cells. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 47-53 (2019).
  12. Miki, K., et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell. 16, 699-711 (2015).
  13. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. , 1307-1311 (2011).
  14. Sun, J., et al. Engineered proteins with sensing and activating modules for automated reprogramming of cellular functions. Nature Communications. 8, 477 (2017).
  15. Shigeto, H., et al. Insulin sensor cells for the analysis of insulin secretion responses in single living pancreatic β cells. Analyst. 144, 3765-3772 (2019).
  16. Cella, F., Wroblewska, L., Weiss, R., Siciliano, V. Engineering protein-protein devices for multilayered regulation of mRNA translation using orthogonal proteases in mammalian cells. Nature Communications. 9, (2018).
  17. Siciliano, V., et al. MiRNAs confer phenotypic robustness to gene networks by suppressing biological noise. Nature communications. 4, 2364 (2013).
  18. Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 64-69 (2008).
  19. Schwarz, K. A., Daringer, N. M., Dolberg, T. B., Leonard, J. N. Rewiring human cellular input–output using modular extracellular sensors. Nature Chemical Biology. 13, 202-209 (2016).
  20. Wieland, M., Fussenegger, M. Engineering molecular circuits using synthetic biology in mammalian cells. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 3, 209-234 (2012).
  21. Siciliano, V., et al. Engineering modular intracellular protein sensor-actuator devices. Nature Communications. 9, 1881 (2018).
  22. Lin, C. . HCV NS3-4A Serine Protease. , (2006).
  23. Romani, B., Engelbrecht, S., Glashoff, R. H. Functions of Tat: the versatile protein of human immunodeficiency virus type 1. Journal of General Virology. 91, 1-12 (2010).
  24. Basmaciogullari, S., Pizzato, M. The activity of Nef on HIV-1 infectivity. Frontiers in microbiology. 5, 232 (2014).
  25. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet neurology. 10, 83-98 (2011).
  26. Pfeffer, C. M., Singh, A. T. K. Apoptosis: A Target for Anticancer Therapy. International journal of molecular sciences. 19, 448 (2018).
  27. Guzzo, C., et al. The CD8-derived chemokine XCL1/lymphotactin is a conformation-dependent, broad-spectrum inhibitor of HIV-1. PLoS pathogens. 9, 1003852 (2013).
  28. Marasco, W. A., LaVecchio, J., Winkler, A. Human anti-HIV-1 tat sFv intrabodies for gene therapy of advanced HIV-1-infection and AIDS. Journal of Immunological Methods. 231, 223-238 (1999).
  29. Gal-Tanamy, M., et al. HCV NS3 serine protease-neutralizing single-chain antibodies isolated by a novel genetic screen. Journal of molecular biology. 347, 991-1003 (2005).
  30. Southwell, A. L., et al. Intrabodies binding the proline-rich domains of mutant huntingtin increase its turnover and reduce neurotoxicity. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 9013-9020 (2008).
  31. Bouchet, J., et al. Inhibition of the Nef regulatory protein of HIV-1 by a single-domain antibody. Blood. 117, 3559-3568 (2011).
  32. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, 1361-1372 (1997).
  33. Beal, J. Signal-to-Noise Ratio Measures Efficacy of Biological Computing Devices and Circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 93 (2015).
  34. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, 1361-1372 (1997).
  35. Tyshchuk, O., et al. Detection of a phosphorylated glycine-serine linker in an IgG-based fusion protein. mAbs. 9, 94-103 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

TEVC

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved