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Method Article
Aquí, presentamos un protocolo para la ingeniería de sensores-actuadores de proteínas intracelulares codificados genéticamente. El dispositivo detecta específicamente las proteínas diana a través de anticuerpos intracelulares (intracuerpos) y responde activando la salida transcripcional de genes. Se construye un marco general para reemplazar rápidamente los intracuerpos, lo que permite la detección rápida de cualquier proteína deseada, sin alterar la arquitectura general.
Las proteínas pueden funcionar como biomarcadores de condiciones patológicas, como enfermedades neurodegenerativas, infecciones o síndromes metabólicos. La ingeniería de células para detectar y responder a estos biomarcadores puede ayudar a comprender los mecanismos moleculares que subyacen a las patologías, así como a desarrollar nuevas terapias basadas en células. Si bien se han desarrollado varios sistemas que detectan proteínas extracelulares, faltaba un marco modular que pueda rediseñarse fácilmente para detectar diferentes proteínas intracelulares.
Aquí, describimos un protocolo para implementar una plataforma genética modular que detecta proteínas intracelulares y activa una respuesta celular específica. El dispositivo funciona con anticuerpos intracelulares o pequeños péptidos para detectar con alta especificidad la proteína de interés, desencadenando la activación transcripcional de los genes de salida, a través de un módulo de actuación basado en la proteasa TEV (TEVp). TEVp es una proteasa viral que escinde selectivamente péptidos afines cortos y es ampliamente utilizada en biotecnología y biología sintética por su alta ortogonalidad al sitio de escisión. Específicamente, diseñamos dispositivos que reconocen y responden a biomarcadores de proteínas de infecciones virales y enfermedades genéticas, incluida la huntingtina mutada, la serina-proteasa NS3, las proteínas Tat y Nef para detectar infecciones por la enfermedad de Huntington, el virus de la hepatitis C (VHC) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), respectivamente. Es importante destacar que el sistema se puede adaptar a mano para obtener el resultado funcional deseado de entrada-salida, como lecturas fluorescentes para biosensores, estimulación de la presentación de antígenos para la respuesta inmunitaria o inicio de la apoptosis para eliminar células enfermas.
El estudio y las modulaciones de las respuestas celulares a través de circuitos genéticos controlables son objetivos importantes en biología sintética 1,2,3 para el desarrollo de herramientas prospectivas con aplicaciones biológicas o médicas relevantes en cáncer 4, infecciones5, enfermedades metabólicas6 e inmunología7.
La reprogramación de las funciones celulares en respuesta a señales específicas requiere el diseño de interfaces inteligentes que vinculen la detección de cambios dinámicos extracelulares o intracelulares (entrada) con el procesamiento posterior, desencadenando una salida específica con fines de diagnóstico (es decir, genes reporteros) o para reconfigurar la respuesta celular (terapéutica). Las entradas detectadas por el módulo de detección pueden ser pequeños analitos8, proteínas 9,10,11 o microARN 11,12,13, específicos para el inicio o progresión de una enfermedad. Además, la regulación de circuitos complejos puede lograrse mediante el procesamiento de información de entrada múltiple, lo que aumenta el control estricto sobre la expresión de transgenes en respuesta a las condiciones definidas 14,15,16. Por ejemplo, los sensores basados en microARN pueden identificar tipos específicos de células, como las células cancerosas, induciendo su eliminación con la expresión de un gen apoptótico13. Dado que los microARN son fácilmente implementables en circuitos sintéticos de forma modular, representan un insumo ampliamente utilizado para los biosensores codificados genéticamente 12,13,17. Las proteínas también son un biomarcador válido para mutaciones genéticas, cáncer e infecciones, y de hecho se han descrito varios dispositivos de detección de proteínas extracelulares 18,19.
Muchos de los circuitos que detectan proteínas extracelulares se basan en el uso de receptores modificados, que unen un factor de transcripción (TF) a la membrana, fusionado a un sitio de escisión (TCS) sensible a TEVp. Una ventaja importante del TEVp es la especificidad de la escisión y la falta de interferencia con el procesamiento de proteínas endógenas. En estos sistemas, TEVp se fusiona con un segundo péptido que interactúa con el receptor diseñado al unirse a las moléculas extracelulares. Por lo tanto, las entradas externas inducen la escisión mediada por TEVp y la liberación de TF. Los sistemas que funcionan con este mecanismo son Tango/TEVp18, light-induced20 y Modular Extracellular Sensor Architecture (MESA)19. A pesar de los avances en la detección de proteínas extracelulares, la tecnología para detectar proteínas intracelulares de forma modular nunca antes se había realizado, con la limitación de pasar por muchas iteraciones de construcción y prueba para dispositivos individuales que responden a una proteína específica.
Nuestro sistema es la primera plataforma para la detección de proteínas intracelulares21. La modularidad está garantizada por el uso de intracuerpos que definen la especificidad con respecto al objetivo, mientras que la reprogramación celular está mediada por TEVp. En concreto, un intracuerpo está unido a la membrana y fusionado con el C-terminal a una proteína fluorescente mKate, una TCS y una TF (proteína de fusión 1); el segundo intracuerpo se fusiona con el TEVp y se localiza en el citosol (proteína de fusión 2) (Figura 1).
Por lo tanto, la interacción entre dos intracuerpos y la proteína diana se produce en el citoplasma y conduce a la escisión de TCS por TEVp, lo que resulta en la translocación de TF al núcleo para activar la salida funcional. El dispositivo de detección y actuación se probó con éxito para cuatro proteínas intracelulares específicas de la enfermedad: la serina proteasa NS3 expresada por el virus del VHC22, las proteínas Tat y Nef de la infección por VIH23,24 y la huntingtina mutada (HTT) de la enfermedad de Huntington25. La expresión de salida incluye reporteros fluorescentes, gen apoptótico (hBax)26 e inmunomoduladores (XCL-1)27. Demostramos que el sistema también puede perjudicar la funcionalidad patológica de sus objetivos. Por ejemplo, el dispositivo que responde a Nef interfiere con la propagación de la infección viral al secuestrar la proteína objetivo y revertir la modulación negativa del receptor HLA-I en las células T infectadas24. La plataforma de detección-activación descrita es la primera de este tipo para la detección de proteínas intracelulares y puede implementarse potencialmente para detectar la expresión anormal de proteínas, modificaciones postraduccionales o epigenéticas, con fines diagnósticos y terapéuticos20.
1. Principios de diseño para la construcción y prueba del dispositivo sensor-actuador
2. Preparación de la muestra para el análisis por citometría de flujo
3. Caracterización del dispositivo sensor-actuador del VHC
4. Caracterización del dispositivo sensor-actuador del VIH sensible a Nef
Una arquitectura para la detección modular de proteínas intracelulares
Como se muestra en la Figura 1, el dispositivo está compuesto por: 1) intracuerpo 1 conectado al marcador fluorescente anclado a la membrana (mKate) y al sitio de escisión de TEVp (TCS), seguido de un activador de transcripción GAL4VP16 (TF); 2) intracuerpo 2 fusionado a la proteasa TEV (TEVp), libre en el citosol; 3) un promotor sintético que responde a GAL4VP16...
Hasta hace poco, el interrogatorio de células basado en el entorno intracelular se realizaba con sistemas desarrollados de novo para objetivos específicos. El presente protocolo describe un ejemplo del enfoque de ingeniería celular más reciente para la detección y actuación de proteínas en un dispositivo, que se puede adaptar rápidamente a los nuevos biomarcadores deseados.
Este sistema pionero detecta proteínas intracelulares y proporciona una salida...
Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.
Este trabajo contó con el apoyo del Istituto Italiano di Tecnologia.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
AlexaFluor 647 mouse anti-human HLA-A, B, C antibody clone W6/32 | Biolegend | 311414 | Antibodies |
Annexin V | LifeTechnologies | A35122 | Apoptosis marker |
Attractene | Qiagen | 301005 | Transfection reagent |
BD Falcon Round-Bottom Tubes | BD Biosciences | 352053 | FACS tubes |
Doxycycline | Clonetech | - | Cell Culture: Drugs |
Dulbecco's modified Eagle medium | Cellgro | 10-013-CM | Cell Culture: Medium |
Evos Cell Imaging System | Life Technology | EVOS M5000 | Imaging systems; Infectious molecular clones |
FACSDiva8 software | BD Biosciences | 659523 | FACS software |
Fast SYBR Green Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4385612 | qPCR reaction |
FBS (Fetal Bovin Serum) | Atlanta BIO | S11050 | Cell Culture: Medium |
Gateway System | Life Technologies | - | Plasmid Construction |
Golden Gate System | in-house | - | Plasmid Construction |
HEK 293FT | Invitrogen | R70007 | Cell Culture: Cells |
Infusion Cloning System | Clonetech | 638920 | Plasmid Construction |
JetPRIME reagent | Polyplus transfection | 114-15 | Transcfection reagent |
Jurkat Cells | ATCC | TIB-152 | Cell Culture: Cells |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513-100ML | Cell Culture: Medium |
Lipofectamine LTX with Plus Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15338030 | Transfection reagent |
LSR Fortessa flow cytometer (405, 488, and 561 nm lasers) | BD Biosciences | 649225 | Flow cytometer |
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate (0.1 mL) | ThermoFisher Scientific | 4346907 | qPCR reaction |
Neon Transfection System | Life Technologies | MPK10025 | Transfection reagent |
Non-essential amino acids | HyClone | SH3023801 | Cell Culture: Medium |
Opti-MEM I reduced serum medium | Life Technologies | 31985070 | Transfection medium |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4458-100ML | Cell Culture: Medium |
QuantiTect Reverse Transcription Kit | Qiagen | 205313 | Rev Transcriptase kit |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | RNA extraction kit |
RPMI-1640 | ATCC | ATCC 302001 | Cell Culture: Medium |
Shield | Clonetech | 632189 | Cell Culture: Drugs |
SpheroTech RCP-30-5-A beads | Spherotech | RCP-30- 5A-2 | Compensation set up |
StepOnePlus 7500 Fast machine | Applied Biosystems | 4351106 | qPCR reaction |
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