JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لهندسة مستشعر البروتين داخل الخلايا المشفر وراثيا. يكتشف الجهاز على وجه التحديد البروتينات المستهدفة من خلال الأجسام المضادة داخل الخلايا (الأجسام الداخلية) ويستجيب عن طريق تشغيل إخراج النسخ الجيني. تم بناء إطار عام لاستبدال الأجسام الداخلية بسرعة ، مما يتيح الكشف السريع عن أي بروتين مرغوب فيه ، دون تغيير البنية العامة.

Abstract

يمكن أن تعمل البروتينات كمؤشرات حيوية للحالات المرضية ، مثل الأمراض التنكسية العصبية أو الالتهابات أو متلازمات التمثيل الغذائي. قد تساعد هندسة الخلايا لاستشعار هذه المؤشرات الحيوية والاستجابة لها في فهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء الأمراض ، وكذلك في تطوير علاجات جديدة قائمة على الخلايا. بينما تم تطوير العديد من الأنظمة التي تكتشف البروتينات خارج الخلية ، كان هناك إطار معياري يمكن إعادة هندستته بسهولة لاستشعار البروتينات المختلفة داخل الخلايا مفقود.

هنا ، نصف بروتوكولا لتنفيذ منصة وراثية معيارية تستشعر البروتينات داخل الخلايا وتنشط استجابة خلوية معينة. يعمل الجهاز على الأجسام المضادة داخل الخلايا أو الببتيدات الصغيرة لاستشعار البروتين محل الاهتمام بخصوصية عالية ، مما يؤدي إلى تنشيط النسخ لجينات الإخراج ، من خلال وحدة التشغيل القائمة على البروتياز TEV (TEVp). TEVp هو بروتياز فيروسي يشق بشكل انتقائي الببتيدات القصيرة المتشابهة ويستخدم على نطاق واسع في التكنولوجيا الحيوية والبيولوجيا التركيبية لتعامده العالي مع موقع الانقسام. على وجه التحديد ، قمنا بتصميم أجهزة تتعرف على المؤشرات الحيوية البروتينية للعدوى الفيروسية والأمراض الوراثية وتستجيب لها ، بما في ذلك هنتنغتين المتحور ، وبروتينات سيرين بروتياز NS3 ، وبروتينات Tat و Nef للكشف عن مرض هنتنغتون وفيروس التهاب الكبد C (HCV) وعدوى فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) ، على التوالي. الأهم من ذلك ، يمكن تصميم النظام يدويا للنتيجة الوظيفية المرغوبة للمدخلات والمخرجات ، مثل قراءات الفلورسنت لأجهزة الاستشعار الحيوية ، أو تحفيز عرض المستضد للاستجابة المناعية ، أو بدء موت الخلايا المبرمج للقضاء على الخلايا غير الصحية.

Introduction

تعد دراسة وتعديلات الاستجابات الخلوية عبر دوائر جينية هندسية يمكن التحكم فيها أهدافا رئيسية في البيولوجيا التركيبية1،2،3 لتطوير أدوات مستقبلية ذات تطبيقات بيولوجية أو طبية ذات صلة في السرطان4 ، والالتهابات5 ، وأمراض التمثيل الغذائي6 ، وعلم المناعة7.

تتطلب إعادة برمجة وظائف الخلية استجابة لإشارات محددة تصميم واجهات ذكية تربط استشعار التغييرات الديناميكية خارج الخلية أو داخل الخلية (المدخلات) بالمعالجة النهائية ، مما يؤدي إلى إخراج محدد إما لأغراض التشخيص (أي جينات المراسل) أو لإعادة توصيل استجابة الخلية (العلاجات). يمكن أن تكون المدخلات التي تم اكتشافها بواسطة وحدة الاستشعار عبارة عن تحليلات صغيرة8 أو بروتينات9،10،11 أو microRNAs11،12،13 ، خاصة بظهور المرض أو تطوره. علاوة على ذلك ، يمكن تحقيق تنظيم الدوائر المعقدة عن طريق معالجة معلومات الإدخال المتعددة ، مما يزيد من التحكم الصارم في التعبير الجيني المعدل استجابة للشروط المحددة14،15،16. على سبيل المثال ، يمكن لأجهزة الاستشعار القائمة على microRNA تحديد أنواع معينة من الخلايا ، مثل الخلايا السرطانية ، مما يؤدي إلى إزالتها بالتعبير عن جين موت الخلاياالمبرمج 13. نظرا لأن microRNAs يمكن تنفيذها بسهولة في الدوائر الاصطناعية بطريقة معيارية ، فإنها تمثل مدخلات مستخدمة على نطاق واسع لأجهزة الاستشعار الحيوية المشفرةوراثيا 12،13،17. البروتينات هي أيضا مؤشر حيوي صالح للطفرات الجينية والسرطان والالتهابات ، وقد تم الإبلاغ بالفعل عن عدد من أجهزة استشعار البروتين خارج الخلية18،19.

تعتمد العديد من الدوائر التي تكتشف البروتينات خارج الخلية على استخدام المستقبلات الهندسية ، والتي تربط عامل النسخ (TF) بالغشاء ، ويتم دمجها في موقع الانقسام المستجيب ل TEVp (TCS). تتمثل الميزة الرئيسية ل TEVp في خصوصية الانقسام وعدم التدخل في معالجة البروتين الداخلي. في هذه الأنظمة ، يتم دمج TEVp في ببتيد ثان يتفاعل مع المستقبل المصمم هندسيا عند ارتباط الجزيئات خارج الخلية. وبالتالي ، فإن المدخلات الخارجية تحفز الانقسام بوساطة TEVp وإطلاق TF. الأنظمة التي تعمل بهذه الآلية هي Tango / TEVp18 و20 المستحث بالضوء وبنية الاستشعار المعيارية خارج الخلية (MESA) 19. على الرغم من التقدم المحرز في اكتشاف البروتينات خارج الخلية ، إلا أن تقنية استشعار البروتينات داخل الخلايا بطريقة معيارية لم تتحقق من قبل ، مع محدودية المرور بالعديد من عمليات البناء والاختبار للأجهزة الفردية التي تستجيب لبروتين معين.

نظامنا هو أول منصة لاستشعار البروتين داخل الخلايا21. يتم ضمان النمطية من خلال استخدام الأجسام الداخلية التي تحدد خصوصية الهدف ، في حين أن إعادة برمجة الخلية بوساطة TEVp. على وجه التحديد ، يتم ربط الجسم الداخلي بغشاء ونصهر في الطرف C إلى بروتين الفلورسنت mKate و TCS و TF (بروتين الانصهار 1) ؛ يتم دمج الجسم الثاني داخل الجسم مع TEVp ويقع في العصارة الخلوية (بروتين الاندماج 2) (الشكل 1).

وبالتالي ، يحدث التفاعل بين جسمين داخليين والبروتين المستهدف في السيتوبلازم ويؤدي إلى انقسام TCS بواسطة TEVp ، مما يؤدي إلى انتقال TF إلى النواة لتنشيط الإخراج الوظيفي. تم اختبار جهاز الاستشعار بنجاح بحثا عن أربعة بروتينات خاصة بالأمراض داخل الخلايا: بروتياز سيرين NS3 المعبر عنه فيروس التهاب الكبدC 22 ، وبروتينات Tat و Nef من عدوى فيروس نقص المناعة البشرية23،24 ، والهنتنغتين المتحور (HTT) من مرض هنتنغتون25. يشمل التعبير الناتج مراسلي الفلورسنت والجين موت الخلايا المبرمج (hBax) 26 والمعدلات المناعية (XCL-1) 27. نثبت أن النظام يمكن أن يضعف أيضا الوظائف المرضية لأهدافه. على سبيل المثال ، يتداخل الجهاز المستجيب ل Nef مع انتشار العدوى الفيروسية عن طريق عزل البروتين المستهدف وعكس تقليل تشكيل مستقبلات HLA-I على الخلايا التائية المصابة24. منصة الاستشعار الموصوفة هي الأولى من نوعها للكشف عن البروتينات داخل الخلايا ويمكن تنفيذها لاستشعار التعبير غير الطبيعي للبروتين ، أو التعديلات اللاحقة للترجمة أو الوراثة اللاجينية ، لأغراض التشخيص والعلاج20.

Protocol

1. مبادئ التصميم للبناء واختبار جهاز الاستشعار المحرك

  1. حدد البروتين الذي يثير الاهتمام.
    ملاحظة: لقد صممنا نظاما للبروتينات الموجودة في السيتوبلازم أو التنقل بين السيتوبلازم والمقصورات الأخرى.
  2. حدد جسمين داخليين يربطان حواتم مختلفة من البروتين المستهدف. في دراستنا اخترنا البروتينات التي تم تطوير الأجسام الداخلية لها بالفعلواختبارها 28،29،30،31. عندما لا تكون الأجسام الداخلية متوفرة ، يجب تطويرها حديثا.
    ملاحظة: يمكن أن يكون البديل للأجسام الداخلية هو الجزيئات الأخرى التي تتفاعل مع البروتين محل الاهتمام. على سبيل المثال ، يشتمل جهاز استشعار Nef على جسم داخلي واحد (sdAb19) ومجال SH3 لبروتين p59fyn التيروزينكيناز 32.
  3. تصميم البلازميدات في السيليكو مع تسلسل الحمض النووي التي تشفر بروتينات الاندماج.
    ملاحظة: يتوفر برنامج تصميم البلازميد مجانا أو يمكن شراؤه.
    1. قم بإنشاء تسلسلات تتضمن الوحدات التالية: علامة الغشاء ، وعلامة الفلورسنت (على سبيل المثال ، mKate) ، وداخل الجسم ، و TCS و TF لبروتين الاندماج 1 ، وداخل الجسم و TEVp لبروتين الاندماج 2.
      ملاحظة: يتطلب بناء بنية جديدة تعتمد على تفاعل العديد من المكونات الانتباه إلى المعلمات التي قد تزيد من تنشيط الإشارة عند اكتشاف البروتين المستهدف. على وجه التحديد ، ركزنا على نشاط TEVp ومرونة البروتينات الخيمرية لتسهيل التفاعل بين البروتين والبروتين (الجدول 1). يتم تحديد كل هذه الميزات في النقاط التالية.
    2. أدخل مجال رابط الجلايسين والسيرين المرن (LD) بين الجسم داخل الجسم - TCS و / أو TEVp - داخل الجسم. قد يكون LD متغير الطول (0 أو 10 أو 15 من الأحماض الأمينية-AA).
    3. بروتين الانصهار 1: تصميم متغيرات تتضمن TCS (S) عالي التقارب أو TCS منخفض التقارب (L) لتنظيم نشاط انقسام TEVp. التعبير عن هذا البناء مدفوع بمروج تأسيسي. قم بتضمين عامل النسخ GAL4VP16 في الطرف C من TCS للسماح بالنقل إلى النواة عند انقسام TEVp.
      ملاحظة: استخدمنا مروج hEF1a ، ولكن يمكن اختيار المروجين التأسيسيين الآخرين.
    4. بروتين الانصهار 2: استخدم محفز تأسيسي (hEF1a) أو محفز للدوكسيسيسين (pTET) لضبط نسخ TEVp. استخدم مجال التحلل (DD) الذي ينظمه درع الجزيء الصغير لتعديل استقرار البروتين.
      ملاحظة: يمكن اختيار أنظمة محفزة أخرى تعمل على ضبط تعبير البروتين.
    5. الإخراج: ضع محفز UAS لجين المراسل في اتجاه مجرى النهر يستجيب لعامل النسخ GAL4VP16. اختر الإخراج وفقا لتطبيق الجهاز (مثل البروتين الفلوري ، السيتوكين ، إلخ).
  4. إجراء الاستنساخ بأي استراتيجية مفضلة. هنا ، قمنا ببناء البلازميدات باستخدام تقنيات البوابة الذهبية أو البوابة.
  5. اختبر التكوين المختلف للجهاز في خطوط الخلايا المطلوبة عن طريق التعداء العابر. شارك في نقل الخلايا مع البلازميدات التي تم الحصول عليها لبروتينات الاندماج 1 و 2 وجين مراسل الفلورسنت ، مثل UAS-EYFP. يشتمل بروتين الانصهار 1 على بروتين فلوري أحمر (mkate) يستخدم كعلامة تعداد.
    ملاحظة: ابدأ بخطوط الخلايا سهلة الإرسال مثل الخلايا HEK293FT لاختبار الأجهزة.
    1. التعداء في HEK293FT الخلايا. قم بالبذور 2 × 105 خلايا في صفيحة 24 بئرا مع 500 ميكرولتر من DMEM. الخلايا الشفافة التي تحتوي على 300 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي باستخدام كاشف التعدي ، ودوامة المزيج واحتضانها في RT لمدة 20 دقيقة.
      1. ضع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 . أضف وسط المزرعة الطازجة بعد 24 ساعة من التعداد.
    2. تعداء في خلايا جوركات. استخدم 3 × 105 خلايا في 500 ميكرولتر من وسط زراعة خلايا RPMI للوحة 24 بئرا. قم بإجراء التثقيب الكهربائي باتباع تعليمات الشركة المصنعة. استخدم 2-4 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي لكل عينة. أضف 500 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا الطازجة بعد 24 ساعة من التعداد.
      1. أثناء التثقيب الكهربائي ، ضع الخلايا والحمض النووي على الجليد. ثم ضع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 .
        ملاحظة: يمكن اختيار خطوط الخلايا المختلفة وطرق التعداء وفقا للتطبيق المحدد للجهاز.
  6. الحصول على صور المجهر للحصول على فهم نوعي لوظائف الجهاز. تأكد من توطين الغشاء لبروتين الاندماج 1 عن طريق الكشف عن إشارة الفلورسنت (mkate) بالقرب من غشاء الخلية. تصور ناتج الفلورسنت (EYFP) في وجود أو عدم وجود (التحكم السلبي - NC) للبروتين المستهدف.
    1. استخدم نظام التصوير الخلوي المجهز بمكعبات ضوء Tx Red و GFP للكشف عن بروتينات الفلورسنت mKate و EYFP. استخدم الهدف 10x أو 20x.
      ملاحظة: استخدم الخلايا غير المنقولة لضمان عدم وجود التألق الذاتي.
  7. تحليل التعدي باستخدام قياس التدفق الخلوي (FACS).
    ملاحظة: انظر البروتوكول 2 لإعداد العينة.
    1. تقييم الأجهزة في وجود البروتين المستهدف. قم بإنشاء مصفوفة تجريبية تجمع بين متغيرات بروتين الاندماج 1 و 2 ، وتعديل TEVp مع (i) مروج hEf1a التأسيسي (ii) محفز TET المحفز للدوكسيسيكلين و (iii) درع لاستقرار البروتين. أضف الدوكسيسيكلين والدرع بتركيزات (0-1000 نانومتر).
    2. إجراء تحليل FACS لمقارنة تحريض الطية ل EYFP بين العينات التي تحتوي على أو بدون بروتين محل أهمية.
      ملاحظة: يتوافق الحث الأعلى الطي مع أكبر حساسية إدخال في ON (وجود البروتين المستهدف) مقارنة بوضع OFF (غياب البروتين المستهدف).
  8. اختبر وظائف الجهاز فيما يتعلق بالتطبيقات المطلوبة.
    1. قم بإجراء تحليل FACS لقياس مستويات بروتينات الإخراج أو موت الخلايا المبرمج ، أو المقايسات الأخرى ذات الصلة.
    2. قم بإجراء تحليل RT PCR إذا كان جزء الإخراج من الجهاز ينظم مستويات التعبير عن الجينات المستهدفة. احسب 2-ddCT فيما يتعلق بجين التدبير المنزلي (GAPDH أو ما يعادله) وقارن تغيير أضعاف تعبير الإخراج في وضعي التشغيل والإيقاف.

2. تحضير العينة لتحليل قياس التدفق الخلوي

  1. إجراء تحليل كمي لأجهزة البروتين باستخدام مقياس التدفق الخلوي (FACS) بعد 48 ساعة من التعدين.
    1. استنشق وسائط DMEM واغسل الخلايا HEK293FT ب 300 ميكرولتر من PBS. أضف 100 ميكرولتر من التربسين واتركه في حاضنة 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 2-4 دقائق.
      ملاحظة: لا تتطلب خلايا Jurkat التربسين.
    2. أضف 400 ميكرولتر من وسائط DMEM بدون فينول أحمر وأعد تعليق الخلايا لتجنب تكوين التكتلات. نقل في أنابيب FACS.
    3. استخدم مقياس التدفق الخلوي المزود بليزر 405 و 488 و 561 نانومتر.
    4. اجمع 30,000 - 100,000 حدث تم اختياره من مجموعة الخلايا الحية باستخدام إعدادات مقياس الخلوي التالية: ليزر 488 نانومتر ومرشح ممر النطاق 530/30 نانومتر ل EYFP / EGFP ، وليزر 561 نانومتر ومرشح 610/20 نانومتر ل mKate ، وليزر 405 نانومتر ، ومرشح 450/50 ل EBFP.
      ملاحظة: لإعداد مقياس التدفق الخلوي ، قم بتضمين الخلايا غير المنقولة والخلايا المنقولة ببروتينات فلورية مفردة.
    5. إجراء تحليل للعينات التي تم جمعها باستخدام البرامج المفضلة (على سبيل المثال ، برنامج DIVA أو Flowjo أو طريقة TASBE33).

3. توصيف جهاز مستشعر HCV

  1. حدد الأجسام الداخلية للكشف عن بروتين NS3. يرتبط scFv35 و scFv162 باثنين من حواتم مختلفة وبالتالي تم اختيارهما.
  2. تصميم واختبار المتغيرات للجهاز المستجيب ل NS3 باتباع المنطق الموضح في الخطوة 1.3 (على سبيل المثال ، بروتين الانصهار 1: علامة الغشاء ، mKate ، جزء أحادي السلسلة داخل الجسم scFv35 ، LD0 ، TCS-L و TF GAL4VP16 ؛ بروتين الانصهار 2: جزء أحادي السلسلة داخل الجسم scFv162 و LD0 و TEVp ؛ الإخراج: UAS-EYFP أو UAS-hBax (موت الخلايا المبرمج) ؛ NS3 (انظر الجدول 2)).
  3. اختبر التركيبات في HEK293FT الخلايا.
    ملاحظة: لكل تجربة ، قم بتعيين عنصر تحكم سلبي وهو تسليم الجهاز وقياس كمية الإخراج في حالة عدم وجود البروتين محل الاهتمام.
    1. اختبر الأجهزة الخاصة ب TEVp تحت مروج تأسيسي في وجود أو عدم وجود NS3. قم بإجراء تعداء بروتين الاندماج 1 (الخطوة 1.3.3) وبروتين الاندماج 2 (الخطوة 1.3.4) وخطوة إخراج EYFP (1.3.5) في الخلايا HEK293FT كما هو موضح في الخطوة 1.5.1. قم بتحليل العينات بعد 48 ساعة من التعدي عن طريق قياس مراسل الفلورسنت (EYFP) عن طريق قياس التدفق الخلوي (البروتوكول 2).
    2. تقييم التفاعل داخل الجسم-NS3 عن طريق تحديد موقع mKate و BFP باستخدام بروتين اندماج BFP-NS3. الخلايا الشفافة مع بروتين الاندماج 1 الذي يحتوي على mKate ، ومع BFP-NS3. بعد 48 ساعة من التعدي ، راقب الخلايا في المجهر متحد البؤر (هدف 63x) لاختبار التوطين المشترك لبروتينات الفلورسنت.
      ملاحظة: استخدم BFP (غير مدمج مع NS3) كعنصر تحكم سلبي. في هذه الحالة ، يجب أن يظهر BFP توطين خلوي منتشر ويجب ألا يتوجب مع mKate المرتبط بالغشاء.
    3. اختبر الأجهزة الخاصة ب TEVp تحت مروج pTET في وجود أو عدم وجود NS3. قارن EYFP في غياب ووجود NS3. نقل الخلايا مع بروتين الاندماج 1 (الخطوة 1.3.3) وبروتين الاندماج 2 (الخطوة 1.3.4) وإخراج EYFP (الخطوة 1.3.5) باستخدام البروتوكول الموضح في الخطوة 1.5.1. يتم إجراء عمليات التعداء في وجود أو عدم وجود NS3. قم بتحليل العينات بعد 48 ساعة من التعدي عن طريق قياس مراسل الفلورسنت (EYFP) عن طريق قياس التدفق الخلوي (البروتوكول 2).
  4. اختبار قتل الخلايا مدفوعة بجهاز NS3.
    1. استبدل إخراج EYFP بالجين موت الخلايا المبرمج hBax.
    2. كرر الخطوة 3.3.3. اجمع الخلايا بعد 48 ساعة من التعداء واغسلها باستخدام PBS قبل بدء الفحص.
    3. إجراء اختبار موت الخلايا المبرمج مع الملحق الخامس المقترن باللون الأزرق المحيط الهادئ. الخلايا الملطخة ذات علامة موت الخلايا المبرمج Annexin V (مترافقة مع 2.5 ميكرولتر من Pacific Blue) مخففة في مخزن مؤقت ملزم (نسبة حجم 1:20) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. تحليل الخلايا عن طريق قياس التدفق الخلوي. احسب مستوى موت الخلايا المبرمج داخل السكان كعدد الخلايا الموجبة للمحيط الهادئ الأزرق (الملحق الخامس).

4. توصيف جهاز مستشعر فيروس نقص المناعة البشرية المستجيب ل Nef

  1. حدد الأجسام الداخلية التي ترتبط ب Nef. تم اختيار المجال الفردي داخل الجسم sdAb19 و SH3 لارتباطهما بحواتم مختلفة.
    ملاحظة: SH3 ليس جسما داخليا ولكنه مجال لبروتين التيروزين كيناز p59fyn الذي يتفاعل فسيولوجيا مع Nef.
  2. تصميم واختبار المتغيرات للجهاز المستجيب ل Nef باتباع المنطق الموضح في الخطوة 1.3 (على سبيل المثال ، بروتين الانصهار 1: علامة الغشاء ، mKate ، sdAb19 ، LD0 ، TCS-L و GAL4-VP16 ؛ بروتين الانصهار 2: SH3 و LD0 و TEVp ؛ الإخراج: UAS-EYFP ؛ نيف (انظر الجدول 3)).
  3. اختبر الأجهزة في خلايا HEK293FT و Jurkat T.
    ملاحظة: لكل تجربة ، نضع عنصرا سلبيا للتحكم في تسليم الجهاز وقياس كمية الإخراج في حالة عدم وجود البروتين محل الاهتمام
    1. تعداء HEK293FT: اتبع الإجراء الموضح في الخطوة 1.5.1 في وجود أو عدم وجود Nef.
    2. تعداء الخلايا التائية Jurkat : اتبع الإجراء الموضح في الخطوة 1.5.2 في وجود أو عدم وجود Nef.
    3. بعد 48 ساعة من التعداء ، قم بتحليل العينات باستخدام مقياس التدفق الخلوي كما هو موضح في البروتوكول 2.
  4. إصابة خلايا Jurkat بسلالات فيروس نقص المناعة البشرية LAI للكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية.
    1. تحضير مخزونات فيروسية قبل 48 ساعة على الأقل من التجربة. استخدم الفيروس الذي تم الحصول عليه من تعداء خلايا HEK-293T مع المستنسخة الجزيئية المعدية (برنامج كواشف المعاهد الوطنية للصحة الإيدز) والكواشف التجارية باستخدام تعليمات الشركة المصنعة. تركيز الفيروس بعد 40 ساعة عن طريق الطرد المركزي الفائق لمدة 1 ساعة ، 64،074 × جم ، 4 درجات مئوية على 20٪ سكروز لتجنب البروتينات الخالية من الجسيمات الفيروسية. المخزونات الفيروسية العيارية مع فيروس نقص المناعة البشرية -1 ص 24 ELISA.
    2. تصيب الخلايا بسلالات فيروس نقص المناعة البشرية-1 مع 500 نانوغرام من لقاح p24. بعد 40 ساعة من الإصابة ، حدد النسبة المئوية للخلايا المصابة عن طريق اكتشاف البروتين الفيروسي p24 باستخدام الجسم المضاد المترافق KC57-FITC وإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي.
    3. تلطيخ الخلايا باستخدام الأجسام المضادة المترافقة AlexaFluor 647 استنساخ W6 / 32 ضد HLA-A ، B ، C. قم بإصلاح الخلايا وتحليلها على مقياس التدفق الخلوي. توسط Nef في تقليل تشكيل HLA-I في خلايا Jurkat T في وجود أو عدم وجود جهاز مستشعر البروتين.

النتائج

بنية للكشف المعياري عن البروتين داخل الخلايا
كما هو موضح في الشكل 1 ، يتكون الجهاز من: 1) داخل الجسم 1 متصل بعلامة الفلورسنت المربوطة بالغشاء (mKate) وموقع انقسام TEVp (TCS) ، متبوعا بمنشط النسخ GAL4VP16 (TF) ؛ 2) داخل الجسم 2 منصهر مع البروتياز TEV (TEVp) ، حر في الع?...

Discussion

حتى وقت قريب ، تم إجراء استجواب الخلايا بناء على البيئة داخل الخلايا باستخدام أنظمة تم تطويرها من جديد لأهداف محددة. يصف البروتوكول الحالي مثالا على أحدث نهج هندسة الخلايا لاستشعار البروتين وتشغيله في جهاز واحد ، والذي يمكن تكييفه بسرعة مع المؤشرات الحيوية الجديدة المر...

Disclosures

ويعلن أصحاب البلاغ عدم وجود مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الإيطالي للتكنولوجيا.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AlexaFluor 647 mouse anti-human HLA-A, B, C antibody clone W6/32Biolegend311414Antibodies
Annexin VLifeTechnologiesA35122Apoptosis marker
AttracteneQiagen301005Transfection reagent
BD Falcon Round-Bottom TubesBD Biosciences352053FACS tubes
DoxycyclineClonetech-Cell Culture: Drugs
Dulbecco's modified Eagle mediumCellgro10-013-CMCell Culture: Medium
Evos Cell Imaging SystemLife TechnologyEVOS M5000Imaging systems; Infectious molecular clones
FACSDiva8 softwareBD Biosciences659523FACS software
Fast SYBR Green Master MixThermoFisher Scientific4385612qPCR reaction
FBS (Fetal Bovin Serum)Atlanta BIOS11050Cell Culture: Medium
Gateway SystemLife Technologies-Plasmid Construction
Golden Gate Systemin-house-Plasmid Construction
HEK 293FTInvitrogenR70007Cell Culture: Cells
Infusion Cloning SystemClonetech638920Plasmid Construction
JetPRIME reagentPolyplus transfection114-15Transcfection reagent
Jurkat CellsATCCTIB-152Cell Culture: Cells
L-GlutamineSigma-AldrichG7513-100MLCell Culture: Medium
Lipofectamine LTX with Plus ReagentThermo Fisher Scientific15338030Transfection reagent
LSR Fortessa flow cytometer (405, 488, and 561 nm lasers)BD Biosciences649225Flow cytometer
MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate (0.1 mL)ThermoFisher Scientific4346907qPCR reaction
Neon Transfection SystemLife TechnologiesMPK10025Transfection reagent
Non-essential amino acidsHyCloneSH3023801Cell Culture: Medium
Opti-MEM I reduced serum mediumLife Technologies31985070Transfection medium
Penicillin/StreptomycinSigma-AldrichP4458-100MLCell Culture: Medium
QuantiTect Reverse Transcription KitQiagen205313Rev Transcriptase kit
RNeasy Mini KitQiagen74106RNA extraction kit
RPMI-1640ATCCATCC 30­2001Cell Culture: Medium
ShieldClonetech632189Cell Culture: Drugs
SpheroTech RCP-30-5-A beadsSpherotechRCP-30- 5A-2Compensation set up
StepOnePlus 7500 Fast machineApplied Biosystems4351106qPCR reaction

References

  1. Bernardo, D., Marucci, L., Menolascina, F., Siciliano, V. Predicting Synthetic Gene Networks. Synthetic Gene Networks: Methods and Protocols. 813, 57-81 (2012).
  2. Krams, R., et al. Mammalian synthetic biology: emerging medical applications. J. R. Soc. Interface. 12, (2015).
  3. MacDonald, J. T., Siciliano, V. Computational Sequence Design with R2oDNA Designer. Methods in molecular biology. 1651, 249-262 (2017).
  4. Zah, E., Lin, M. -. Y., Silva-Benedict, A., Jensen, M. C., Chen, Y. Y. T cells expressing CD19/CD20 bi-specific chimeric antigen receptors prevent antigen escape by malignant B cells. Cancer Immunology Research. 4, 498-508 (2016).
  5. Wu, F., Bethke, J. H., Wang, M., You, L. Quantitative and synthetic biology approaches to combat bacterial pathogens. Current Opinion in Biomedical Engineering. 4, 116-126 (2017).
  6. Ye, H., et al. Pharmaceutically controlled designer circuit for the treatment of the metabolic syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 141-146 (2013).
  7. Caliendo, F., Dukhinova, M., Siciliano, V. Engineered Cell-Based Therapeutics: Synthetic Biology Meets Immunology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, (2019).
  8. Thaker, M. N., Wright, G. D. Opportunities for synthetic biology in antibiotics: Expanding glycopeptide chemical diversity. ACS Synthetic Biology. 4, 195-206 (2015).
  9. Culler, S. J., Hoff, K. G., Smolke, C. D. Reprogramming cellular behavior with RNA controllers responsive to endogenous proteins. Science. 330, 1251-1255 (2010).
  10. Ausländer, S., et al. A general design strategy for protein-responsive riboswitches in mammalian cells. Nature Methods. 11, 1154-1160 (2014).
  11. Cella, F., Siciliano, V. Protein-based parts and devices that respond to intracellular and extracellular signals in mammalian cells. Current Opinion in Chemical Biology. 52, 47-53 (2019).
  12. Miki, K., et al. Efficient Detection and Purification of Cell Populations Using Synthetic MicroRNA Switches. Cell Stem Cell. 16, 699-711 (2015).
  13. Xie, Z., Wroblewska, L., Prochazka, L., Weiss, R., Benenson, Y. Multi-input RNAi-based logic circuit for identification of specific cancer cells. Science. , 1307-1311 (2011).
  14. Sun, J., et al. Engineered proteins with sensing and activating modules for automated reprogramming of cellular functions. Nature Communications. 8, 477 (2017).
  15. Shigeto, H., et al. Insulin sensor cells for the analysis of insulin secretion responses in single living pancreatic β cells. Analyst. 144, 3765-3772 (2019).
  16. Cella, F., Wroblewska, L., Weiss, R., Siciliano, V. Engineering protein-protein devices for multilayered regulation of mRNA translation using orthogonal proteases in mammalian cells. Nature Communications. 9, (2018).
  17. Siciliano, V., et al. MiRNAs confer phenotypic robustness to gene networks by suppressing biological noise. Nature communications. 4, 2364 (2013).
  18. Barnea, G., et al. The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 64-69 (2008).
  19. Schwarz, K. A., Daringer, N. M., Dolberg, T. B., Leonard, J. N. Rewiring human cellular input–output using modular extracellular sensors. Nature Chemical Biology. 13, 202-209 (2016).
  20. Wieland, M., Fussenegger, M. Engineering molecular circuits using synthetic biology in mammalian cells. Annual review of chemical and biomolecular engineering. 3, 209-234 (2012).
  21. Siciliano, V., et al. Engineering modular intracellular protein sensor-actuator devices. Nature Communications. 9, 1881 (2018).
  22. Lin, C. . HCV NS3-4A Serine Protease. , (2006).
  23. Romani, B., Engelbrecht, S., Glashoff, R. H. Functions of Tat: the versatile protein of human immunodeficiency virus type 1. Journal of General Virology. 91, 1-12 (2010).
  24. Basmaciogullari, S., Pizzato, M. The activity of Nef on HIV-1 infectivity. Frontiers in microbiology. 5, 232 (2014).
  25. Ross, C. A., Tabrizi, S. J. Huntington's disease: from molecular pathogenesis to clinical treatment. Lancet neurology. 10, 83-98 (2011).
  26. Pfeffer, C. M., Singh, A. T. K. Apoptosis: A Target for Anticancer Therapy. International journal of molecular sciences. 19, 448 (2018).
  27. Guzzo, C., et al. The CD8-derived chemokine XCL1/lymphotactin is a conformation-dependent, broad-spectrum inhibitor of HIV-1. PLoS pathogens. 9, 1003852 (2013).
  28. Marasco, W. A., LaVecchio, J., Winkler, A. Human anti-HIV-1 tat sFv intrabodies for gene therapy of advanced HIV-1-infection and AIDS. Journal of Immunological Methods. 231, 223-238 (1999).
  29. Gal-Tanamy, M., et al. HCV NS3 serine protease-neutralizing single-chain antibodies isolated by a novel genetic screen. Journal of molecular biology. 347, 991-1003 (2005).
  30. Southwell, A. L., et al. Intrabodies binding the proline-rich domains of mutant huntingtin increase its turnover and reduce neurotoxicity. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 9013-9020 (2008).
  31. Bouchet, J., et al. Inhibition of the Nef regulatory protein of HIV-1 by a single-domain antibody. Blood. 117, 3559-3568 (2011).
  32. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, 1361-1372 (1997).
  33. Beal, J. Signal-to-Noise Ratio Measures Efficacy of Biological Computing Devices and Circuits. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 3, 93 (2015).
  34. Arold, S., et al. The crystal structure of HIV-1 Nef protein bound to the Fyn kinase SH3 domain suggests a role for this complex in altered T cell receptor signaling. Structure. 5, 1361-1372 (1997).
  35. Tyshchuk, O., et al. Detection of a phosphorylated glycine-serine linker in an IgG-based fusion protein. mAbs. 9, 94-103 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

TEV

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved