새로운 현미경 기술은 연구되는 생물학 프로세스의 정확한 이해를 위한 적당한 공구의 발달을 요구합니다. 이 프로토콜은 측량 확산 파라미터의 추정과 세포막의 전체 궤적을 통해 스팟 크기의 정량화를 포함하여 단일 분자 추적에 필요한 이미지 처리 단계를 설명합니다. 이 프로토콜은 ImageJ, MATLAB 및 uTrack을 포함한 여러 소프트웨어 조각의 사용뿐만 아니라 이 프로토콜을 위해 특별히 개발된 일부 단백질을 결합합니다.
이 방법은 빛 현미경 검사의 밑에 막 수용체의 추적으로 기술됩니다, 그러나 그 궤적을 비디오 순서에서 시간이 지남에 따라 추적될 수 있는 어떤 입자 같이 구조물든지에 적용될 수 있습니다. 이 기술은 기본적인 연구와 관련이 있으며 임상 환경에서 직접 적용할 수 없습니다. 그러나, 그것은 다른 질병에서 따라서 새로운 치료 표적의 식별에 있는 생물학 사건의 특성화에 원조하기 위하여 이용될 수 있습니다.
이 프로토콜은 이 비디오에 도시된 바와 같이 세포막내입자의 추적과 관련이 있지만, 전체 세포, 박테리아, 유체의 나노입자 또는 그 중심이 잘 결정될 수 있는 다른 물체의 추적에도 적용될 수 있다. 이 프로토콜은 사용자 친화적이며 세포 배양 및 현미경 기술만 필요합니다. 이 프로토콜에 사용되는 다양한 기술과 정보 도구는 새 사용자를 위협할 수 있습니다.
시각적 데모는 이 기술을 자신있게 사용하는 데 도움이 됩니다. 우선, Jurkat 세포를 성장시키고, 일조GFP 표지된 chemokine 수용체 벡터로 이식하고, 첨부된 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 표지된 벡터의 낮은 발현 수준을 가진 세포를 선택한다. CXCL12 리간드 또는 제어 매체를 함유한 미디어를 각 섬유네틴 코팅 된 35mm 유리 바닥 마이크로웰 접시에 추가하고 섭씨 37도에서 1 시간 동안 배양하십시오.
다음으로, 각 접시에 정렬된 세포를 추가하고 세포를 이미징하기 전에 20 분 동안 배양합니다. 인큐베이션에 따라, 세포의 첫 번째 접시를 TIRF 현미경 단계로 옮기고 100x 오일 침지 목표로 전환한다. 밝은 필드를 사용하여 셀을 찾아 집중하여 광표백 효과를 최소화합니다.
그런 다음 TIRF 모드로 전환하고 낮은 레이저 강도를 사용하여 미세 초점 조정을 수행합니다. 약 50초 길이의 동영상을 획득하여 프레임 사이의 시간 간격을 최소화합니다. 각 실험 조건 비디오 파일에 대해 이 비디오의 텍스트 프로토콜에 설명된 파일 구조 방향에 따라 새 폴더를 만듭니다.
피지 또는 ImageJ와 비디오를 드래그 하 고 피지 메뉴 표시 줄에 파일을 삭제 하 여 비디오를 열고, bioformats를 사용 하 여 LIF 파일을 가져오기 위해 확인을 클릭 합니다. 마스크를 설계하기 위해 해당 다중 채널 이미지도 가져옵니다. 다음으로 먼저 마스크 디자인에 유용한 채널로 단일 이미지를 만들어 마스크를 만듭니다.
막대 메뉴에서 이미지를 선택하고 색상다음 분할 채널을 클릭하여 서로 다른 채널을 별도의 이미지로 표시합니다. 막대 메뉴에서 이미지를 선택하고 색상으로 이동하며 채널 병합을 선택하여 단일 이미지로 세 채널을 다시 병합합니다. 적절한 채널을 선택한 다음 확인을 눌러 새 누적되지 않은 이미지를 생성해야 합니다.
막대 메뉴로 이동하여 두 창을 동기화한 다음 분석을 선택한 다음 도구로 이동하여 Windows 동기화를 선택합니다. 동기화된 이미지 가능성이 있는 새 창이 표시됩니다. 이제 두 창이 동기화되면 두 창모두에서 동일한 영역을 잘라내수 있습니다.
막대 메뉴에서 이미지로 이동하여 자르기를 선택합니다. 직사각형 선택 도구를 사용하여 관심 영역을 그립니다. 두 개의 자른 이미지가 개별적으로 표시됩니다.
다음으로 두 창의 동기화를 해제합니다. 마스크가 만들어지지 않은 경우 선택 도구 및 자르기로 관심 영역을 그립니다. 그런 다음 비디오를 디렉터리 Videosec에서 이미지 시퀀스로 저장합니다.
그런 다음 멀티 채널 이미지를 선택하고 메뉴의 플러그인으로 이동한 다음 세분화 편집기를 선택하여 세분화 편집기 플러그인을 엽니다. 프리핸드 선택 도구를 선택하고 녹색 레이블을 선택하고 가장 바깥쪽 마스크를 디자인하는 데 사용합니다. 디자인이 완료되면 복합 창선택 옵션에서 Plus 버튼을 누르면 선택한 마스크가 뷰어에 표시됩니다.
모든 레이블에 대해 이 단계를 반복합니다. 모든 마스크가 디자인되면 이름과 동일한 파일 이름으로 마스크를 저장합니다.tif MATLAB을 열고 경로 설정으로 이동하여 경로에 uTrack 디렉터리를 추가하고 추가 를 선택합니다.
그런 다음 작업 디렉터리를 분석할 계열을 포함하는 디렉토리로 변경합니다. 콘솔에서 동영상 셀렉터 GUI를 입력하고 Enter를 눌러 uTrack을 호출합니다. 이렇게 하면 동영상 선택 창이 열립니다.
새 동영상 버튼을 누르고 동영상 추가 창이 나타날 때까지 기다립니다. 채널 추가를 눌러 비디오로 디렉토리를 선택하고 동영상 정보 매개 변수를 작성합니다. uTrack 결과를 결과에 대한 출력 디렉토리를 결과로 설정한 다음 고급 채널 설정을 누르고 획득과 관련된 매개 변수를 채우고 저장합니다.
동영상을 만든 후 동영상 선택 창에서 계속을 누릅니다. 여기서 uTrack은 분석할 개체 유형에 대해 묻습니다. 단일 파티클을 선택한 다음 제어판 창이 나타납니다.
다음으로 첫 번째 단계인 1단계:감지를 선택하고 설정을 클릭합니다. 설정 가우시안 혼합 모델 피팅 창이 나타납니다. 여기에 표시된 대로 설정을 입력한 다음 적용을 누릅니다.
제어판에서 실행을 클릭하여 검색 단계를 실행합니다. 몇 분 후 결과 버튼을 눌러 결과를 확인합니다. 동영상에는 감지된 파티클에 빨간색 원이 표시됩니다.
빨간색 원이 표시되지 않으면 이 단계가 제대로 작동하지 않았으며 다시 시도해야 합니다. 이제 방금 감지된 파티클을 여러 프레임에 걸쳐 있는 트랙으로 병합하여 여기에 표시된 대로 매개 변수를 먼저 설정합니다. 그런 다음 제어판에서 실행을 누릅니다.
다음으로 트랙 분석을 수행합니다. 여기에 표시된 대로 설정을 정의한 다음 적용 및 실행을 누릅니다. 결과 버튼을 먼저 눌러 결과를 확인한 다음 동영상 옵션 창의 트랙 추적 번호를 클릭하고 각 트랙이 올바르게 식별되었는지 프레임별 프레임을 확인하여 실제 파티클이 아닌 파티클을 수동으로 표시합니다.
MATLAB에서 여기에 표시된 대로 명령을 입력합니다. 이 명령은 프로그램이 모든 궤적을 읽고 확산 계수를 계산하게 합니다. 다음으로, 제외할 반점 목록을 제공하여 잘못 식별된 반점 이나 궤적에 해당하는 궤적을 제외합니다.
함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라 이 셀의 각 트랙에 대한 즉각적인 확산 계수를 계산합니다. 이 경우, 시간 지연에 대한 확산 계수를 D1에서 4까지 4라고 하는 4와 같게 계산한다. 완료되면 궤적을 짧고 긴 궤도로 분해합니다.
긴 궤적을 분석하려면 여기에 표시된 대로 명령을 입력하여 모멘트 배율 스펙트럼을 통해 모션 유형을 분류합니다. 궤적을 따라 각 입자의 강도를 분석합니다. 함께 제공되는 텍스트 프로토콜을 따라 다릅니다.
그런 다음 모든 궤적에 대한 확산 및 강도 정보를 수집합니다. 짧은 궤적을 위한 확산 및 강도 정보만 수집합니다. 마지막으로, 이전에 사용 했던 접미사는 긴 다음을 입력 하 여 순간 스펙트럼 스케일링 및 강도 정보를 수집 합니다.
이 프로토콜에 설명된 기술의 사용은 형광 현미경 영화에서 검출된 입자의 자동 추적및 그들의 동적 특성의 분석을 허용합니다. 이 분석에서 자극의 변화에 따라 다른 특성을 얻을 수 있습니다. 여기에는 4개의 서로 다른 자극을 기반으로 한 움직이지 않는 반점의 비율, 50프레임 이상의 긴 궤적의 백분율, 지시, 자유 또는 제한된 움직임에 의해 부서진 궤적을 따라 이동하는 유형이 포함됩니다.
또한, 확산 계수, 평균 스팟 강도, 및 입자당 수용체 수를 결정할 수 있다. 이는 서로 다른 자극에 반응하여 각 지점에 대한 짧은 확산 계수 값의 분포를 나타낸다. 빨간색 선은 중앙값의 값을 나타내며, 이 유사한 그래프는 동일한 자극에 대한 응답으로 처음 20 프레임을 따라 각 스팟의 평균 스팟 강도를 보여줍니다.
다시 빨간색 선은 평균 강도 값을 나타냅니다. 스팟의 평균 보정 강도는 이 지점에 존재하는 형광 단백질의 수와 관련이 있기 때문에, 여기에 도시된 바와 같이 입자당 수용체 수를 직접 계산할 수 있다. MATLAB은 사례에 민감한 프로그래밍 언어입니다.
이 프로토콜에 설명된 이름과 관련하여 변수 이름이 다를 수 있지만 이름 지정에 일관성을 유지해야 합니다. 함수의 이름은 변경할 수 없으며 쉼표, 콜론 및 반 콜론은 올바른 구문에 중요합니다. 단일 분자 현미경 검사는 전례없는 주걱 - 측두해상도로 개별 막 단백질의 시각화를 허용하고 세포 생물학의 예기치 않은 측면을 공개 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다.
이 프로토콜은 세포 및 분자 생물학에 있는 현미경 비디오의 정량분석을 위한 새로운 문을 엽니다.
