Neue Mikroskopietechniken erfordern die Entwicklung geeigneter Werkzeuge für das richtige Verständnis der untersuchten biologischen Prozesse. Dieses Protokoll beschreibt die Bildverarbeitungsschritte, die für die Einzelmolekülverfolgung erforderlich sind, einschließlich der Schätzung der lateralen Diffusionsparameter und der Quantifizierung der Spotgröße über die gesamte Flugbahn an der Zellmembran. Dieses Protokoll kombiniert die Verwendung mehrerer Softwareteile, einschließlich ImageJ, MATLAB und uTrack, sowie einige Proteine, die speziell für dieses Protokoll entwickelt wurden.
Diese Methode wird mit der Verfolgung von Membranrezeptoren unter Lichtmikroskopie veranschaulicht, kann aber auf jede partikelähnliche Struktur angewendet werden, deren Flugbahnen im Laufe der Zeit in einer Videosequenz verfolgt werden können. Diese Technik bezieht sich auf die Grundlagenforschung und hat keine direkte Anwendung in einem klinischen Umfeld. Es kann jedoch zur Charakterisierung biologischer Ereignisse sowohl bei verschiedenen Krankheiten als auch bei der Identifizierung neuer therapeutischer Ziele verwendet werden.
Dieses Protokoll ist für die Verfolgung von Partikeln in Zellmembranen relevant, wie in diesem Video gezeigt, aber es kann auch für die Verfolgung von vollständigen Zellen, Bakterien, Nanopartikeln in einer Flüssigkeit oder dem anderen Objekt, dessen Zentrum gut bestimmt werden kann, angewendet werden. Dieses Protokoll ist benutzerfreundlich und erfordert nur Kenntnisse der Zellkultur und Mikroskopietechniken. Die verschiedenen Techniken und Informatik-Tools, die in diesem Protokoll verwendet werden, können einen neuen Benutzer einschüchtern.
Die visuelle Demonstration hilft, diese Technik mit Zuversicht zu verwenden. Zunächst wachsen Jurkat-Zellen, transfekten sie mit einem monomeren GFP-beschrifteten Chemokin-Rezeptorvektor und wählen Sie Zellen mit niedrigen Expressionsgehalten des beschrifteten Vektors aus, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Fügen Sie Medien, die den CXCL12-Ligand enthalten, oder Kontrollmedien zu jedem fibronectinbeschichteten 35-Millimeter-Mikrobrunnen-Mikrobrunnen-Geschirr mit Glasfaser, das mit Fibronectin beschichtet wurde, und brüten Sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius.
Fügen Sie als Nächstes sortierte Zellen zu jeder Schale hinzu und brüten Sie 20 Minuten lang, bevor Sie die Zellen bildgeben. Nach der Inkubation die erste Zellschale auf ein TIRF-Mikroskopstadium übertragen und auf das 100-fache Öl-Tauchziel umstellen. Suchen und konzentrieren Sie sich auf die Zellen mit hellem Feld, um Photobleicheffekte zu minimieren.
Wechseln Sie dann in den TIRF-Modus und führen Sie eine Feinfokuseinstellung mit geringer Laserintensität durch. Erfassen Sie Filme mit einer Länge von ca. 50 Sekunden, wodurch das Zeitintervall zwischen Frames minimiert wird. Erstellen Sie für jede Videodatei mit experimentellen Bedingungen einen neuen Ordner, der den Anweisungen der Dateistruktur folgt, die im Textprotokoll dieses Videos beschrieben sind.
Öffnen Sie das Video mit Fidschi oder ImageJ, indem Sie die Datei in der Fidschi-Menüleiste ziehen und ablegen, und klicken Sie auf OK, um die LIF-Datei mithilfe von Bioformaten zu importieren. Um eine Maske zu entwerfen, importieren Sie auch das entsprechende Mehrkanalbild. Erstellen Sie als Nächstes eine Maske, indem Sie zuerst ein einzelnes Bild mit den Kanälen erstellen, die für das Design der Maske nützlich sind.
Wählen Sie Bild im Balkenmenü aus, und klicken Sie auf Farbe gefolgt von Kanäle teilen, um die verschiedenen Kanäle als separate Bilder anzuzeigen. Führen Sie die drei Kanäle in einem einzelnen Bild erneut zusammen, indem Sie Bild im Balkenmenü auswählen, zu Farbe wechseln und Kanäle zusammenführen auswählen. Stellen Sie sicher, dass Sie die entsprechenden Kanäle auswählen, und drücken Sie dann OK, um ein neues nicht gestapeltes Bild zu generieren.
Synchronisieren Sie die beiden Fenster, indem Sie zum Balkenmenü wechseln, Analysieren auswählen und dann zu Extras wechseln und Windows synchronisieren auswählen. Ein neues Fenster mit den synchronisierten Bildmöglichkeiten wird angezeigt. Nachdem die beiden Fenster synchronisiert sind, kann nun der gleiche Bereich in beiden Fenstern zugeschnitten werden.
Gehen Sie im Balkenmenü zu Bild und wählen Sie Zuschneiden aus. Zeichnen Sie mit dem rechteckigen Auswahlwerkzeug den Interessenbereich. Die beiden zugeschnittenen Bilder werden einzeln angezeigt.
Als Nächstes wird die Synchronisierung beider Fenster aufkleben. Wenn keine Maske erstellt wurde, zeichnen Sie den Interessenbereich mit dem Auswahlwerkzeug und dem Zuschneiden. Danach speichern Sie das Video als Bildsequenz im Verzeichnis Videosec.
Wählen Sie dann das Mehrkanalbild aus, gehen Sie zu Plugins im Menü, und wählen Sie Segmentierungs-Editor aus, um das Segmentierungs-Editor-Plugin zu öffnen. Wählen Sie das Freihandauswahlwerkzeug aus, und wählen Sie damit ein grünes Etikett aus und entwerfen Sie die äußerste Maske. Nach der Konstruktion drücken Sie die Plus-Taste in der Auswahloption des zusammengesetzten Fensters, und die ausgewählte Maske wird auf dem Viewer angezeigt.
Wiederholen Sie diesen Schritt für alle Beschriftungen. Sobald alle Masken entworfen wurden, speichern Sie die Maske mit dem gleichen Dateinamen wie das Video, mit dem Namen:mask.tif. Öffnen Sie MATLAB, und fügen Sie das uTrack-Verzeichnis zum Pfad hinzu, indem Sie zu Pfad festlegen und Add With auswählen.
Ändern Sie dann das Arbeitsverzeichnis in das Verzeichnis, das die zu analysierende Serie enthält. Rufen Sie uTrack auf, indem Sie Movie Selector GUI in die Konsole eingeben und Enter drücken. Dadurch wird das Filmauswahlfenster geöffnet.
Drücken Sie die Schaltfläche "Neuer Film", und warten Sie, bis das Fenster "Filmhinzufügen" angezeigt wird. Drücken Sie auf Kanal hinzufügen, um das Verzeichnis mit dem Video auszuwählen und die Filminformationsparameter auszufüllen. Legen Sie das Ausgabeverzeichnis für die Ergebnisse von uTrack auf Ergebnisse fest, drücken Sie dann auf die erweiterten Kanaleinstellungen, füllen Sie die Parameter im Zusammenhang mit der Erfassung und speichern Sie sie.
Nachdem Sie den Film erstellt haben, drücken Sie im Filmauswahlfenster auf Weiter. Hier fragt uTrack nach dem Typ des zu analysierenden Objekts. Wählen Sie Einzelne Partikel aus, und dann wird das Bedienfeldfenster angezeigt.
Wählen Sie als Nächstes den ersten Schritt, Schritt 1:Erkennung, und klicken Sie auf Einstellung. Das Fenster Einstellung Gaussian Mixture Model Fitting wird angezeigt. Geben Sie die Einstellungen wie hier gezeigt ein, und drücken Sie dann Anwenden.
Klicken Sie im Bedienfeld auf Ausführen, um den Erkennungsschritt auszuführen. Überprüfen Sie nach einigen Minuten die Ergebnisse, indem Sie die Ergebnistaste drücken. Der Film zeigt rote Kreise auf den erkannten Teilchen.
Wenn kein roter Kreis angezeigt wird, hat dieser Schritt nicht richtig funktioniert, und Sie sollten es erneut versuchen. Führen Sie nun die soeben erkannten Partikel in Spuren zusammen, die sich über mehrere Frames erstrecken, indem Sie zuerst die Parameter wie hier gezeigt einrichten. Drücken Sie dann in der Steuerung auf Ausführen.
Führen Sie als Nächstes die Spuranalyse durch. Definieren Sie die Einstellungen, wie hier gezeigt, und drücken Sie dann Anwenden und Ausführen. Überprüfen Sie die Ergebnisse, indem Sie zuerst auf die Schaltfläche Ergebnis drücken, dann auf Spurnummer des Filmoptionen-Fensters anzeigen klicken und Frame-für-Frame überprüfen, ob jede Spur korrekt identifiziert wurde, und markieren Sie Partikel, die keine echten Partikel sind.
Geben Sie in MATLAB den Befehl ein, wie hier gezeigt. Dieser Befehl bewirkt, dass das Programm alle Flugbahnen liest und die Diffusionskoeffizienten berechnet. Als Nächstes schließen Sie Flugbahnen aus, die falsch identifizierten Flecken oder Flugbahnen entsprechen, indem Sie die Liste der auszuschließenden Punkte angeben.
Berechnen Sie die momentanen Diffusionskoeffizienten für jede der Spuren dieser Zelle, indem Sie dem begleitenden Textprotokoll folgen. Berechnen Sie in diesem Fall den Diffusionskoeffizienten für eine Zeitverzögerung gleich 4, d. h. D1 bis 4. Wenn Sie fertig sind, zersetzen Sie die Bahnen in kurze und lange Bahnen.
Um lange Flugbahnen zu analysieren, geben Sie den Befehl wie hier gezeigt ein, um den Bewegungstyp durch ihr Momentskalierungsspektrum zu klassifizieren. Analysieren Sie die Intensität jedes Partikels entlang ihrer Flugbahn. Konfigurieren Sie dieses grundlegende Verhalten auf viele verschiedene Arten, indem Sie das begleitende Textprotokoll mitverfolgen.
Sammeln Sie dann die Diffusions- und Intensitätsinformationen für alle Flugbahnen. Sammeln Sie nur die Diffusions- und Intensitätsinformationen für kurze Bahnen. Schließlich sammeln Sie die Momentspektrumskalierung und die Intensitätsinformationen, indem Sie Folgendes eingeben, wobei das zuvor verwendete Suffix lang ist.
Die Verwendung der in diesem Protokoll beschriebenen Techniken ermöglicht die automatisierte Verfolgung von Partikeln, die in Fluoreszenzmikroskopiefilmen nachgewiesen werden, und die Analyse ihrer dynamischen Eigenschaften. Aus dieser Analyse kann man unterschiedliche Eigenschaften auf der Grundlage von Variationen der Reize erhalten. Dazu gehören der Prozentsatz der unbeweglichen Flecken, basierend auf vier verschiedenen Reizen, der Prozentsatz der langen Bahnen von mehr als 50 Rahmen und die Bewegungsarten entlang der Flugbahnen, die durch gerichtete, freie oder beschränkte Bewegungen aufgebrochen werden.
Darüber hinaus können der Diffusionskoeffizient, die mittleren Punktintensitäten und die Anzahl der Rezeptoren pro Partikel bestimmt werden. Dies zeigt die Verteilung der kurzen Diffusionskoeffizientenwerte für jeden Punkt als Reaktion auf unterschiedliche Reize. Die rote Linie stellt den Medianwert dar, dieses ähnliche Diagramm zeigt die mittleren Spotintensitäten für jeden Punkt entlang seiner ersten 20 Frames als Reaktion auf die gleichen Reize.
Auch hier stellt die rote Linie den mittleren Intensitätswert dar. Da die mittlere korrigierte Intensität eines Spots mit der Anzahl der fluoreszierenden Proteine in diesem Punkt zusammenhängt, kann man direkt die Anzahl der Rezeptoren pro Teilchen berechnen, wie hier gezeigt. MATLAB ist eine Programmiersprache mit Groß-/Kleinschreibung.
Sie können die Variablennamen in Bezug auf die in diesem Protokoll beschriebenen ändern, aber stellen Sie sicher, dass Sie in Ihrer Benennung konsistent sind. Die Namen der Funktionen können nicht geändert werden, und Kommas, Doppelpunkte und Semikolons sind für eine korrekte Syntax wichtig. Die Einzelmolekülmikroskopie ermöglicht die Visualisierung einzelner Membranproteine mit einer nie dagewesenen raumzeitlichen Auflösung und bietet einzigartige Möglichkeiten, unerwartete Aspekte der Zellbiologie aufzudecken.
Diese Protokolle öffnen neue Türen für die quantitative Analyse von Mikroskopievideos in Zellen und molekularer Biologie.
