Les nouvelles techniques de microscopie nécessitent le développement d’outils adéquats pour la compréhension correcte des processus biologiques étudiés. Ce protocole décrit les étapes de traitement d’image requises pour le suivi d’une molécule unique, y compris l’estimation des paramètres de diffusion latérale et la quantification de la taille des taches sur toute sa trajectoire à la membrane cellulaire. Ce protocole combine l’utilisation de plusieurs logiciels, y compris ImageJ, MATLAB et uTrack, ainsi que certaines protéines qui ont été développées spécifiquement pour ce protocole.
Cette méthode est illustrée par le suivi des récepteurs membranaires sous microscopie légère, mais elle peut être appliquée à n’importe quelle structure en forme de particule dont les trajectoires peuvent être suivies au fil du temps dans une séquence vidéo. Cette technique se rapporte à la recherche fondamentale et n’a pas d’application directe en milieu clinique. Cependant, il peut être utilisé pour aider à la caractérisation des événements biologiques à la fois dans différentes maladies et donc dans l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques.
Ce protocole est pertinent pour le suivi des particules dans les membranes cellulaires, comme le montre cette vidéo, mais il peut également être appliqué pour le suivi des cellules complètes, bactéries, nanoparticules dans un fluide, ou tout autre objet dont le centre peut être bien déterminé. Ce protocole est convivial et ne nécessite que des connaissances sur la culture cellulaire et les techniques de microscopie. Les différentes techniques et outils informatiques utilisés dans ce protocole peuvent intimider un nouvel utilisateur.
La démonstration visuelle permet d’utiliser cette technique en toute confiance. Pour commencer, cultivez les cellules de Jurkat, transfectez-les avec un vecteur monomérique de récepteur de chimiokine gfp-étiqueté, et sélectionnez des cellules avec de faibles niveaux d’expression du vecteur étiqueté, tel que décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. Ajoutez des supports contenant le ligand CXCL12 ou des supports de contrôle à chaque microwell en verre enduit de fibronectine de 35 millimètres qui ont été recouverts de fibronectine et incubent pendant une heure à 37 degrés Celsius.
Ensuite, ajoutez des cellules triées à chaque plat et incubez pendant 20 minutes avant d’imagerier les cellules. Après l’incubation, transférer le premier plat de cellules à un stade de microscope TIRF et se tourner vers l’objectif d’immersion d’huile 100x. Localiser et se concentrer sur les cellules à l’aide de champ lumineux pour minimiser les effets de photobleaching.
Passez ensuite au mode TIRF et effectuez un réglage de mise au point fine à l’aide d’une faible intensité laser. Acquérir des films d’environ 50 secondes de longueur, en minimisant l’intervalle de temps entre les images. Pour chaque fichier vidéo d’état expérimental, créez un nouveau dossier suivant les instructions de structure de fichier décrites dans le protocole texte de cette vidéo.
Ouvrez la vidéo avec Fidji ou ImageJ en faisant glisser et en laissant tomber le fichier sur la barre de menu fidjienne, et cliquez sur OK pour importer le fichier LIF à l’aide de bioformats. Afin de concevoir un masque, importez également l’image multicanal correspondante. Ensuite, créez un masque en créant d’abord une seule image avec les canaux utiles pour la conception du masque.
Sélectionnez Image dans le menu de la barre, et cliquez sur Couleur suivie par Split Channels pour afficher les différents canaux sous forme d’images séparées. Fusionnez à nouveau les trois canaux en une seule image en sélectionnant l’image dans le menu du bar, en allant à la couleur et en sélectionnant les canaux de fusion. Assurez-vous de sélectionner les canaux appropriés, puis appuyez sur OK pour générer une nouvelle image non empilée.
Synchronisez les deux fenêtres en allant au menu de la barre, en sélectionnant Analyser, puis en allant aux outils et en sélectionnant Sync Windows. Une nouvelle fenêtre avec les possibilités d’image synchronisée sera affichée. Maintenant, avec les deux fenêtres synchronisées, la même région dans les deux fenêtres peut être recadrée.
Passez à l’image dans le menu du bar et sélectionnez Crop. Avec l’outil de sélection rectangulaire, dessinez la région d’intérêt. Les deux images recadrées seront diffusées individuellement.
Ensuite, désynchroniser les deux fenêtres. Si aucun masque n’a été créé, dessinez la région d’intérêt avec l’outil de sélection et la culture. Après cela, enregistrer la vidéo comme une séquence d’image dans le répertoire Videosec.
Sélectionnez ensuite l’image multicanal, rendez-vous sur Plugins dans le menu et sélectionnez Segmentation Editor pour ouvrir le plugin de l’éditeur de segmentation. Choisissez l’outil de sélection à main levée, et l’utiliser pour sélectionner une étiquette verte et concevoir le masque le plus externe. Une fois conçu, appuyez sur le bouton Plus dans l’option de sélection de la fenêtre composite, et le masque sélectionné sera affiché sur la visionneuse.
Répétez cette étape pour toutes les étiquettes. Une fois que tous les masques sont conçus, enregistrez le masque avec le même nom de fichier que la vidéo, avec le nom: masque.tif. Ouvrez MATLAB et ajoutez l’annuaire uTrack au chemin en allant à Set Path, et en sélectionnant Add With.
Ensuite, modifiez le répertoire de travail en répertoire contenant la série à analyser. Invoquez uTrack en tapant Movie Selector GUI dans la console et en appuyant sur Enter. Cela provoquera l’ouverture de la fenêtre de sélection du film.
Appuyez sur le bouton Nouveau film et attendez que la fenêtre Movie Addition apparaisse. Appuyez sur Add Channel pour choisir l’annuaire avec la vidéo et remplir les paramètres d’information du film. Définissez l’annuaire de sortie pour les résultats d’uTrack aux résultats, puis appuyez sur les paramètres avancés du canal, remplissez les paramètres liés à l’acquisition et économisez.
Après avoir créé le film, appuyez sur Continuer dans la fenêtre de sélection du film. Ici, uTrack vous posera des questions sur le type d’objet à analyser. Choisissez des particules simples, puis la fenêtre du panneau de commande apparaîtra.
Ensuite, sélectionnez la première étape, Étape 1: Détection, et cliquez sur Réglage. La fenêtre d’ajustement du modèle de mélange gaussien de réglage apparaîtra. Entrez les paramètres comme indiqué ici, puis appuyez sur Appliquer.
Dans le panneau de commande, cliquez sur Exécuter pour exécuter l’étape de détection. Après quelques minutes, vérifiez les résultats en appuyant sur le bouton Résultat. Le film montre des cercles rouges sur les particules détectées.
Si aucun cercle rouge n’est affiché, alors cette étape n’a pas fonctionné correctement et vous devriez essayer à nouveau. Maintenant, fusionnez les particules qui viennent d’être détectées en pistes qui couvrent plusieurs cadres en installant d’abord les paramètres comme indiqué ici. Appuyez ensuite sur Exécuter dans le panneau de commande.
Ensuite, effectuez l’analyse de la piste. Définissez les paramètres, comme indiqué ici, puis appuyez sur Appliquer et exécuter. Vérifiez les résultats en appuyant d’abord sur le bouton Résultat, puis cliquez sur Afficher le numéro de piste de la fenêtre d’options de film et vérifiez image par image que chaque piste a été correctement identifiée, marquant manuellement les particules qui ne sont pas de véritables particules.
Dans MATLAB, entrez la commande comme indiqué ici. Cette commande fera en sorte que le programme lira toutes les trajectoires et calculera les coefficients de diffusion. Ensuite, exclure les trajectoires correspondant à des taches ou des trajectoires mal identifiées en donnant la liste des taches à exclure.
Calculez les coefficients instantanés de diffusion pour chacune des pistes de cette cellule en suivant le protocole texte qui l’accompagne. Dans ce cas, calculer le coefficient de diffusion pour un décalage horaire équivaut à 4 appelé D1 à 4. Une fois terminées, décomposez les trajectoires en trajectoires courtes et longues.
Pour analyser les trajectoires longues, tapez la commande comme indiqué ici pour classer le type de mouvement à travers leur spectre d’échelle de moment. Analyser l’intensité de chaque particule le long de sa trajectoire. Configurez ce comportement de base de différentes façons en suivant le protocole texte qui l’accompagne.
Ensuite, recueillir les informations de diffusion et d’intensité pour toutes les trajectoires. Ne recueillez que l’information sur la diffusion et l’intensité pour de courtes trajectoires. Enfin, recueillir l’échelle du spectre moment et l’information d’intensité en tapant ce qui suit, où longtemps est le suffixe utilisé précédemment.
L’utilisation des techniques décrites dans ce protocole permet le suivi automatisé des particules détectées dans les films de microscopie de fluorescence et l’analyse de leurs caractéristiques dynamiques. De cette analyse, on peut obtenir différentes caractéristiques basées sur des variations de stimuli. Cela inclut, le pourcentage de taches immobiles basées sur quatre stimuli différents, le pourcentage de longues trajectoires de plus de 50 images, et les types de mouvement le long des trajectoires telles que brisées par des mouvements dirigés, libres ou confinés.
En outre, le coefficient de diffusion, les intensités ponctuelles moyennes et le nombre de récepteurs par particule peuvent être déterminés. Cela montre la répartition des valeurs de coefficient de diffusion court pour chaque endroit en réponse à différents stimuli. La ligne rouge représente la valeur médiane, ce graphique similaire montre les intensités ponctuelles moyennes pour chaque endroit le long de ses 20 premiers cadres en réponse aux mêmes stimuli.
Encore une fois, la ligne rouge représente la valeur moyenne d’intensité. Comme l’intensité moyenne corrigée d’un spot est liée au nombre de protéines fluorescentes présentes à cet endroit, on peut calculer directement le nombre de récepteurs par particule, comme le montre ici. MATLAB est un langage de programmation sensible aux cas.
Vous pouvez varier les noms variables par rapport à ceux décrits dans ce protocole, mais assurez-vous d’être cohérent dans votre nommage. Les noms des fonctions ne peuvent pas être changés, et les virgules, les colons et les semi-colons sont importants pour une syntaxe correcte. La microscopie à molécule unique permet la visualisation de protéines membranaires individuelles avec une résolution spatio-temporelle sans précédent et offre des possibilités uniques de révéler des aspects imprévus de la biologie cellulaire.
Ces protocoles ouvrent de nouvelles portes pour l’analyse quantitative des vidéos de microscopie dans les cellules et la biologie moléculaire.
