新しい顕微鏡手法では、研究されている生物学的プロセスを正しく理解するための適切なツールの開発が必要です。このプロトコルは、横方向拡散パラメータの推定や細胞膜におけるその全軌道上のスポットサイズの定量化を含む、単一分子追跡に必要な画像処理ステップを記述する。このプロトコルは、ImageJ、MATLAB、uTrack などのいくつかのソフトウェアの使用と、このプロトコル用に特別に開発されたタンパク質を組み合わせたものです。
この方法は、光顕微鏡下で膜受容体の追跡と共に示されるが、それは、その軌道がビデオシーケンスで時間をかけて追跡することができる任意の粒子状の構造に適用することができる。この技術は基礎研究に関するものであり、臨床現場での直接的な応用はない。しかし、それは異なる疾患で、したがって、新しい治療標的の同定の両方で生物学的事象の特徴付けに役立つ使用することができる。
このプロトコルは、このビデオに示すように、細胞膜内の粒子の追跡に関連していますが、完全な細胞、細菌、流体中のナノ粒子、または中心を十分に決定できる他の物体の追跡にも適用できます。このプロトコルはユーザーフレンドリーで、細胞培養と顕微鏡技術の知識のみが必要です。このプロトコルで使用されるさまざまな手法や情報ツールは、新しいユーザーを脅かす可能性があります。
この視覚的なデモンストレーションは、この手法を自信を持って使用するのに役立ちます。まず、Jurkat細胞を増殖させ、それらを単量体GFP標識ケモカイン受容体ベクターでトランスフェクトし、また、付随するテキストプロトコルに記載されているように、標識されたベクターの発現レベルが低い細胞を選択する。フィブロネクチンでコーティングされたフィブロネクチンコーティングされた35ミリメートルのガラス底マイクロウェル皿にCXCL12リガンドまたはコントロールメディアを含む培地を追加し、摂氏37度で1時間インキュベートします。
次に、各皿に選別した細胞を加え、細胞をイメージングする前に20分間インキュベートする。インキュベーションに続いて、細胞の最初の皿をTIRF顕微鏡ステージに移し、100x油浸出目的に変えます。明視野を使用して細胞を見つけて焦点を当て、光の漂白効果を最小限に抑えます。
その後、TIRFモードに切り替え、低レーザー強度を使用して微調整を行います。フレーム間の時間間隔を最小限に抑え、約50秒の長さのムービーを取得します。実験条件のビデオファイルごとに、このビデオのテキストプロトコルで説明されているファイル構造の指示に従って新しいフォルダを作成します。
バーメニューで「イメージ」を選択し、「カラー」をクリックしてから「チャンネルを分割」をクリックして、異なるチャンネルを別々の画像として表示します。バーメニューで「イメージ」を選択し、「カラー」に移動して「チャンネルを結合」を選択し、1 つの画像内の 3 つのチャンネルを再び結合します。適切なチャンネルを選択し、[OK]を押して新しい非スタックイメージを生成してください。
バーメニューに移動し、[分析]を選択して、[ツール]に移動し、[Windowsを同期]を選択して、2つのウィンドウを同期します。同期された画像の可能性を持つ新しいウィンドウが表示されます。2 つのウィンドウが同期された状態で、両方のウィンドウの同じ領域をトリミングできるようになりました。
バーメニューの[画像]に移動し、[トリミング]を選択します。長方形選択ツールを使用して、対象領域を描画します。2 つのトリミングされた画像が個別に表示されます。
次に、両方のウィンドウの同期を解除します。マスクが作成されていない場合は、選択ツールとトリミングを使用して対象領域を描画します。その後、ビデオをイメージ シーケンスとしてディレクトリ Videosec に保存します。
次に、マルチチャンネルイメージを選択し、メニューのプラグインに移動し、セグメンテーションエディタを選択してセグメンテーションエディタプラグインを開きます。フリーハンド選択ツールを選択し、緑色のラベルを選択し、最も外側のマスクをデザインするために使用します。デザインが完了したら、複合ウィンドウの選択オプションでプラスボタンを押すと、選択したマスクがビューアに表示されます。
すべてのラベルに対してこの手順を繰り返します。すべてのマスクをデザインしたら、ビデオと同じファイル名を付けてマスクを保存します。:mask.tif。MATLAB を開き、パスに uTrack ディレクトリを追加するには、[パスの設定] に移動し、[Add With] を選択します。
次に、作業ディレクトリを、分析対象の系列が含まれているディレクトリに変更します。コンソールで「ムービーセレクタGUI」と入力し、Enterキーを押してuTrackを起動します。これにより、ムービー選択ウィンドウが開きます。
[新しいムービー] ボタンを押し、[ムービー追加] ウィンドウが表示されるまで待ちます。[チャンネルの追加] を押して、ビデオを含むディレクトリを選択し、ムービー情報パラメータを入力します。uTrack の結果の出力ディレクトリを[結果]に設定し、[チャネルの詳細設定]を押して、取得に関連するパラメータを入力して保存します。
ムービーを作成したら、ムービー選択ウィンドウで[続行]を押します。ここでは、uTrackは、分析するオブジェクトの種類について尋ねます。[単一パーティクル] を選択すると、コントロール パネルウィンドウが表示されます。
次に、最初のステップ「ステップ 1:検出」を選択し、「設定」をクリックします。[ガウス混合モデルの調整]ウィンドウが表示されます。ここに示すように設定を入力し、適用を押します。
コントロール パネルで、[実行] をクリックして検出手順を実行します。数分後に結果ボタンを押して結果を確認します。ムービーは検出されたパーティクルに赤い円を表示します。
赤い円が表示されない場合は、この手順が正しく動作しなくて、もう一度やり直してください。ここで、ここで示すようにパラメータを設定して、検出されたばかりのパーティクルを複数のフレームにまたがるトラックにマージします。次に、コントロールパネルで実行を押します。
次に、トラック解析を実行します。次に示すように設定を定義し、[適用] と [実行] をクリックします。結果ボタンを押して結果を確認し、次にムービーオプションウィンドウのトラック番号を表示をクリックし、各トラックが正しく識別されていることをフレームごとに確認し、真のパーティクルではないパーティクルを手動でマーキングします。
MATLAB に、次に示すようにコマンドを入力します。このコマンドを実行すると、プログラムはすべての軌道を読み込み、拡散係数を計算します。次に、除外するスポットのリストを指定して、誤って識別されたスポットまたは軌道に対応する軌道を除外します。
このセルの各トラックの瞬間拡散係数を計算するには、付属のテキストプロトコルに従って行います。この場合、タイムラグの拡散係数はD1から4と呼ばれる4に等しい計算を行います。終了したら、短いおよび長い軌道に軌道を分解します。
長い軌道を解析するには、次に示すようにコマンドを入力して、モーメントスケーリングスペクトルを通してモーションのタイプを分類します。各パーティクルの強度を軌道に沿って解析します。付属のテキスト プロトコルに従って、さまざまな方法でこの基本的な動作を構成します。
次に、すべての軌道の拡散と強度情報を収集します。短い軌道のために拡散と強度情報のみを収集します。最後に、前に使用したサフィックスである long を次のように入力して、モーメントスペクトルスケーリングと強度情報を収集します。
このプロトコルで説明されている技術を使用することで、蛍光顕微鏡ムービーで検出された粒子の自動追跡とその動的特性の分析が可能になります。この分析から、刺激の変動に基づいて異なる特性を得ることができる。これには、4つの異なる刺激に基づく不動スポットの割合、50フレームを超える長い軌道の割合、および指向、自由、または限られた動きによって分割された軌道に沿った動きの種類が含まれます。
また、拡散係数、平均スポット強度、および粒子あたりの受容体数を決定することができる。これは、異なる刺激に応答して、各スポットの短い拡散係数値の分布を示しています。赤い線は中央値を表し、この類似グラフは同じ刺激に応答して最初の20フレームに沿って各スポットの平均スポット強度を示す。
赤い線は平均強度の値を表します。スポットの平均補正強度は、このスポットに存在する蛍光タンパク質の数に関連しているので、ここで示すように、粒子当たりの受容体数を直接計算することができます。MATLAB は、大文字と小文字を区別するプログラミング言語です。
このプロトコルで説明されている変数名に関して変数名を変更できますが、名前付けに一貫性があることを確認してください。関数の名前は変更できず、正しい構文を使用するにはコンマ、コロン、セミコロンが重要です。単一分子顕微鏡検査は、前例のない時空間分解能を持つ個々の膜タンパク質の可視化を可能にし、細胞生物学の予期せぬ側面を明らかにするユニークな機会を提供します。
このプロトコルは、細胞および分子生物学における顕微鏡ビデオの定量的分析のための新しい扉を開きます。
