Name: internalization and observation of fluorescent biomolecules in living microorganisms via electroporation
Uploaded: 2015-02-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation at JoVE.com

We thank Stephan Uphoff for discussions. 
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).

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The authors have nothing to disclose.

많은 매개 변수는 셀 전기 및 데이터 수집 관심 생물학적 시스템 및 실험 (셀 레벨 또는 단일 분자 분석)의 정확한 성질에 따라 동안 변화 될 수있다. 세균 내로 DNA를 electroporating 때 예를 들어, 표지 된 dsDNA 단편의 0.25-5 pmol의이 (미리 photobleaching에 대한 필요없이, 즉.) 직접 단일 분자 검출을 허용하는 내재화 낮은 효율에 이르게. 5 pmol의 dsDNA보다도 무겁게 단일 세포 - 세포 분석을위한 체계가 더 적합로드되는 경향이있다. 표지 된 DNA는 모든 이전에 겔 - 정제 된 자유 염료의 흔적을 제거하기 위해 있어야 DNA 스톡 용액으로부터 (형광 비 반응). 게다가, 특히 smFRET 실험에 대한 DNA 저하, 잠재적 인 문제, 부 자연스러운 핵산, 또는 머리 핀의 자형 루프로 엑소 뉴 클레아 접근 말단을 보호 모티브의 DNA를 사용하여 해결할 수 있습니다. 또 다른 adjustabl일렉트로 목록 매개 변수는 E 일렉트로 동안인가 전계 강도이다. 낮은 전계 강도 (~ 1 kV의 / cm)는 단일 분자 연구에 적합한 낮은 부하 효율로 이어질 것입니다. (1.8 kV로 / cm까지) 더 높은 전기장 세기가 적재 효율을 증가시킬 것이다; 그러나, 전기 천공 후 전기장 세기 및 세포 생존율 사이의 역 상관 관계가있다 (도 4 참조). 참고로, 박테리아, 효모 및 전기 천공에 사용되는 통상의 전계 강도는 ~ 1.5 kV로 / cm이다. 시정 방울 즉시 임의의 아킹 현상이 발생 큐벳으로 보낸이 붕괴의 길이를 나타내는 시간 상수는, 따를 편리한 파라미터이다. 정상 설정에서 시간 상수는 4 밀리 초보다 커야한다; 낮은 값은 낮은 부하 효율 또는 비로드 손상된 세포로 이어질 것입니다. 대부분의 electroporators 모두 조정 수정할 수 있습니다 (예 : &quot;펄스 절단&quot;또는 &quot;펄스 모양&quot;등의) 자유의 다른 학위를 제공셀 로딩과 생존. 그러나 우리는 유사한 절차 또한 멤브레인 (단일 지질 이중층) 실제로는 덜 복잡하고 전기부터 이미 세포와 함께 사용되어 있기 때문에 적절한 electroporator 설정을 사용하여 포유 동물 세포에 표지 된 생체 분자의 내면화를 허용해야합니다, 모두 박테리아와 효모에이 방법을 적용 (21). 표지 단백질을 내면화 할 때, 모두 무료 염료 표지 단백질 원액 이전 전기에서 제거해야합니다. 자유 염료 분자가, 그들의 더 ​​작은 크기에, 관심있는 단백질의 내재화를 통해 우선적으로, 그리고 (자신의 확산에도 불구하고 예상 빠른) 데이타 분석에서 구별하는 것이 어려울 수있다. 유기적 표지 단백질의 샘플에 대한 설명서는, 전기 천공에 적합하도록, 자유 염료 잔량이 2 % 미만이어야 22 (SDS-PAGE의 형광 주사를 사용하여 검출). 이 프로세스는 특히 중요일부 분자는 일렉트로 세균이나 효모의 외막에 충실 할 수있다. 이러한 관점에서, 음성 대조군 샘플 (임의 형광 표지 된 생체 분자와 함께 배양이나 전기 천공되지 않은 세포도 2) 빈 셀의 자기 형광도 수준 이상적으로 낮은 전기 천공 세포보다 분명히 낮은 셀당 형광 강도를 표시한다. dsDNA와 마찬가지로, 표지 단백질의 내재화 효율 일렉트로 이전 세포에 첨가 된 생체 분자의 양에 연결된다. 그러나, 이러한 크기 및 전하와 같은 다른 파라미터들은, 내재화의 역​​할을한다. 작은 단백질은 더 큰 단백질 반면 (그림 5) (26) (98 kDa의까지) 성공적으로 내면화 될 수 있지만, 낮은 효율, 높은 국제화 효율을 나타낸다. 단백질 isolelectric 점, 세포막 전위와의 상호 작용 또는 다른 물리 화학적 및 파라미터전기 동안 영향 셀 로딩. 그 결과, 사용자는 표지 단백질 (&gt; 50 μM)의 높은 초기 농도가 성공적으로 로딩을위한 최고의 기회를 줄 것이다 것을 알고, 자신의 시스템에 대한 실험을 최적화해야합니다. 전기도 교란 및 세포 (중 레이블 또는 레이블)에 단백질 등의 생체 분자를 도입하여 세포의 기능을 분석 할 수있는 새로운 도구를 제공합니다. 본 T7 RNA 폴리머 라제의 실험 (도 5C) 우리는 전기를 이용하여 생체 내에서 유전자 발현을 변경 생체 분자를 도입 할 수있다 등의 실험 예. 단일 분자 형광 실험 수행 때 커버 슬립면 (~ 100 ㎚) 상기 얇은 섹션 내 흥분 만 형광 의해 최상의 신호 대 잡음비를 제공하는 것처럼, TIR 조명은 일반적으로 다른 조명 모드를 통해 선호된다. 그러나 살아있는 미생물의 내부 확산 영상 표시 생체 분자는 다시 수첩 깊은 조도 (최대 E. 콜라이 0.8 ㎛이다). 높은 신호 대 잡음비를 유지하면서 깊은 조명은, 힐로 모드에서 달성된다. 한편, 넓은 시야의 촬상은 사용자가 높은 레이저 파워와 전체로드 셀 photobleaching에 및 생산 단위의 강도에 의해 초기 셀 형광 강도로 나누어 내재화 분자의 수를 예상된다 단계적 광표백 분석에 특히 중요 단일 분자 (단일 광표백 단계, 그림 3)에 의해. 그 궤적이 셀 전체 볼륨을 커버해도 위드 촬상 또한 관심 분자 확산 지역화하기 위하여 장기간 추적 분자 요구된다. 이 프로토콜에서, 우리는 전기, 세포에서 핵산을 전달하기위한 생물학 및 생화학의 표준 기법은 다양한 세포 유형에서 형광 생체 분자를 전달하기위한 간단한 방법을 구성하는 방법을 제시한다. 목소설, 높은 처리량 기술은 그 나라의 환경 표지 분자를 관찰 할 수있는 독특한 도구를 제공합니다. 형광 물질은 넓은 파장 범위를 포함 표지 또한 생체 분자에있어서, 이러한 비 천연 뉴클레오타이드 및 아미노산, 금속 킬레이트 제, 가교제, 및 caging 기 등 많은 화학 기, 변성 분자를 제공 할 수있는 전기. 관심있는 생물학적 시스템 세포 발달에 필수적이지 않으면 내재화 후 관찰 된 단백질은 세포 내 단백질 풀의 모든 (또는 대부분의) 표현을 보장, 표적 단백질을 코딩하는 유전자는 또한 삭제 될 수있다 (또는 노크 다운) . 본질적으로, 전기는 &quot;이식&quot;살아있는 세포로 체외 bioconjugates의 유연성 때문에 합성 생물학, 시스템 생물학에 노력하고, 생체 내 단일 분자 검출을 혜택을 누릴 수 있습니다.

살아있는 세포 내부의 대부분의 형광 연구는 GFP 1 형광 단백질 (FPS)와 단백질의 융합에 따라 달라집니다. 이러한 형광 태그는 유전자 발현 또는 2-7 수송 막 등의 처리에 관여하는 단백질의 카피 수, 확산 패턴 또는 지역화 연구를 허용한다. FPS는 높은 라벨 특이성, 쉬운 구현을 제공하며, 다양한 광 물리, 화학적 특성 1 변종의 큰 목록에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 유기 형광가 큰 광 안정성에 의한 시험 관내 실험에 대한 주요 선택을 유지 (최대 FPS보다 안정적 100 배) 8, 9, 작은 크기 (더 작은 FPS보다 볼륨 100 배에) 및 분자 표지의 용이성 (주로 시스테인 잔기의 사용을 통해). 이러한 모든 요소는 단일 분자 형광에 특히 중요하며, FRET (10)을 연구합니다. 여러 국제화 메소드 COMBIN유기 라벨링 및 생체 검출 장점을 보내고 것은 지난 10 년 동안 소개되었다; 그러나, 이러한 방법은 비 천연 아미노산 (15)의 사용을 필요로하거나, 예를 들면 (대형 단일 막 진핵 세포로 제한되어, 비교적 큰 폴리펩티드 태그 (예를 들어, TMP, 할로, 또는 20 kDa의 SNAP 태그) 11-14을 사용 하나. 로드, 주사기 로딩, 미세 주입) 16 ~ 19를 긁어. 이 프로토콜은 그 생체 내 관찰과 커플 유기 형광의 새로운 장점을 간단하고 높은 처리량 내재화 방법을 설명한다. 이 기술을 개발하기 위해, 우리는 일반적으로 예컨대 E. 같은 미생물을로드하기 위해 플라스미드 DNA (20, 21)와 함께 세포를 형질 전환하는 데 사용되는 전기 천공 절차를 채택 대장균 또는 S. 유기적 표시 생체 분자와 사카로 마이 세스 세레 비시 애. 이 프로토콜은 4 간단한 단계로 구성 세포의 배양을 표시 생체 분자와,전기, 세포 복구, 세포 세척이 아닌 내면화 된 생체 분자를 제거합니다. 여기서, 우리는이 전기 프로토콜뿐만 아니라, 셀 기반 및 단일 분자의 형광을 연구하고 신호를 안달 세포 이미징 데이터 분석 및 처리를 제시한다. 전기 천공은 생체 분자 (도 1) 셀 (20, 21)를 입력 할 수있는 과도 멤브레인 기공을 형성하기 위해 낮은 이온 강도 세포 현탁액을 가로 질러 고전압 전기장 방전에 의존한다. 다만 플라스미드 DNA로 형질 전환 박테리아 또는 효모와 같은 세포는 electrocompetency을 보장하기 위해 전기 천공 전에 제조되어야한다. 이 절차는, 물과 여러 세척 단계로 이루어지는, 막 투과성을 증가시키고, 전기 천공 큐벳 내의 아킹을 피하기 위해 세포 용액의 이온 강도를 낮춘다. 이 프로토콜에서, 세포 (PROTOCOL 참조 : 1.1)을 후술하는 바와 같이 제조 될 수 있거나 또는 상업적 공급자로부터 구입의. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg" /> 그림 1 : 국제화 프로토콜의 도식 표현 왼쪽에서 오른쪽으로 :. electrocompetent 세포 (이중 표지 DNA 단편이 예에서 박테리아)의 나누어지는 레이블 된 생체 분자의 몇 마이크로 리터를 추가; 얼음에 1 분 10 품어과 미리 냉장 전기의 베트로 전송; electroporate 다음 직후 세포에 0.5 ml의 다양한 매체를 추가; 세포가 복구 할 수 있도록 37 ° C (또는 유기체에 필요한 온도, 예를 들어, 효모 29 ° C)에서 배양; 임의의 과량의 비 표지 된 내면화 분자를 제거하는 세척 단계 5를 수행; PBS 버퍼와 피펫 아가로 오스 패드에 10 μL의 100 ~ 200 μL의 최종 펠렛을 재현 탁; (와이드 필드 모드 또는 힐로 모드) 형광 현미경 커버 슬립 세정 및 이미지 패드 커버. (그림 1)을 허용하는 풍부한 매체에서 배양된다. 비 표지 된 생체 분자의 내재화 과량 제 염의 비교적 높은 농도의 일부를 함유하는 세제 세척 버퍼에 의해 제거된다 (3.3 PROTOCOL 참조). 염의 존재는 그렇게 외막에 붙어있다 내재화 비 표지 된 생체 분자에 의해 형성된 비 - 특이 정전 기적 상호 작용을 방해. 마찬가지로, 세척 완충액 세제의 존재하에 비특이적 소수성 상호 작용을 방해. DNA 내재화 (그림 2) 간단하지만,주의 사항은 전기를 사용하여 표지 단백질을 내면화 할 때 수행해야. 첫째, 유기적 표지 단백질의 주식 샘플은 여전히​​ 무료 염료의 작은 비율을 포함 할 수 있습니다. 무료 염료 분자는 단백질보다 훨씬 작고, 따라서 우선적으로 내면화 될 수 있습니다. 관찰 된 내면화 형광 분자의 대다수가 관심의 단백질에 대응되도록하려면 초기 단백질 샘플은 적은 2 ~ % 이상에게 무료 염료 (그림 5) (22)를 포함해야합니다. 비 표지 된 단백질의 내재화 과량 또한 일렉트로 후 세포 외막에 찌를 수있다; 이러한 현상은 특정 단백질이며, 각 새로운 단백질에 대해 확인을받을 필요가있다. 우리는 (: PROTOCOL 3.3.3 참조)로드 셀의 샘플 비 단백질의 내재화를 제거 할 수있는 여러 옵션을 제시한다. 마지막으로, 세포를 인산 완충액의 작은 부피에 재현 탁하고 형광 현미경에 자신의 이미징을 허용 아가 패드 상으로 피펫 팅한다. 아가로 오스 패드에 고정화는 간체입니다전자 및 무결성을 해치지 않고 커버 슬립에 세포 이미징의 효율적인 방법. 패드는 낮은 형광 문화 매체를 포함해야합니다. 셀 이미징은 하나 위드의 총 내부 반사 형광 (TIRF) 또는 HILO를 사용하여 (높은 경사와 적층 광학 시트) 현미경을 수행 할 수 있습니다. 힐로 구성에서, 레이저 빔은 큰 신호 대 잡음비 (23)을 허용 위드로서는 전체 샘플을 아직 조명하지 않는,보다 TIRF 시험편 깊숙히. 사용되는 레이저 파워 및 시간 해상도에 따라, 바이오 분자 내재화는 (도 3을 단계적-photobleaching에 분석을 사용하여) 계산 국소 또는 24-28를 추적 할 수있다. 형광의 FRET 쌍으로 이중 라벨 구조의 내면화는 단일 셀 또는 단일 분자 수준 (그림 6)에서 FRET 모두의 정량화 할 수 있습니다. 다른 파라미터는 변경 될 수있다원하는 출력과 연구 생물학적 시스템에 따라 다릅니다. 첫째, 셀당 내재화 물질의 양은 종래 전기 세포 (도 2)에 첨가 표지 된 생체 분자의 농도를 변경하여 조정될 수있다. 전기 천공 전계 강도는 적재 효율 및 세포 생존 둘 다에 영향을 미친다; 예상대로 증가 전계 강도 적재 효율이 증가하면서, 일렉트로 세포의 생존율 (도 4A)을 감소시킨다. 두 매개 변수는로드의 비율을 기록 및 일렉트로 후 세포 분할함으로써 정량화 할 수있다. 형광 이미징과 함께이 생존 분석은 또한 살아있는 세포에 내재화 된 생체 분자의 관찰을 확인하고 여러 세대 (그림 4B)를 통해 지속적으로 관찰 할 수 있습니다. 요약하면,이 프로토콜은 형광 표지 된 DNA와 단백질 분자의 내면화로 할 수 있습니다대장균 또는 S. 사카로 마이 세스 세레 비시 애 (26). 유기 형광으로 표지 개별 분자 크기의 순서 이상 FPS보다 시간 척도에 대한 높은 시공간 해상도로 추적 할 수 있습니다. 마지막으로,이 방법은 위드, TIRF 및 공 초점 검출뿐만 아니라 ALEX (레이저 여기 교번 28,29)와 같은 펄스 음원 방식과 호환 가능하다.

<table><tbody><tr><td>ElectroMax DH5-alpha Comptent cells</td><td>Invitrogen</td><td>11319-019</td><td>or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.</td></tr><tr><td>EZ Rich Defined Madia</td><td>Teknova</td><td>M2105</td><td>low fluorescence rich media</td></tr><tr><td>MicroPulser Electroporation Apparatus&amp;nbsp;</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>or any classical electroporator for microorganism transformation</td></tr><tr><td>Certified Molecular Biology agarose</td><td>Biorad</td><td>161-3100</td><td>low fluorescence agarose for agarose pad</td></tr><tr><td>Microscope coverslips No 1.5 thickness</td><td>Menzel</td><td>BB024060SC</td><td>remove background particles by heating slides in furnace at 500 &amp;deg;C for 1h</td></tr><tr><td>Single-molecule fluorescence microscope</td><td>Home-built</td><td></td><td>described in REFs</td></tr><tr><td>Localization software</td><td>Custom-written, available online</td><td></td><td>MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tracking software</td><td>Available online</td><td></td><td>MATLAB implementation by Blair and Dufresne.&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

internalization and observation of fluorescent biomolecules in living microorganisms via electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

샘플 준비 프로토콜의 다른 단계는도 1에 도식으로 제시한다. 예를 들어, 우리는 이중 표지 (도너와 억 셉터 염료) DNA 단편의 박테리아 하중을 나타낸다. DNA 내재화를위한 대표 결과는 그림 2에 나타내었다. 각 electroporation하여 샘플의 경우, 빈 셀 및 비 electroporation하여 세포에 대한 데이터는 (그림 2)을 기록 하였다. &quot;빈 셀은&quot;생체 분자 형광하지도 않으며 전기 천공으로 세포를 배양하지 electrocompetent 대응함 채널에서의 형광 강도는 동일 실험 조건 (레이저 파워, 시간 해상도, 온도 등)에서자가 형광 수준을 반영한다. &quot;비 일렉트로 세포&quot;(또한 -EP, 즉 마이너스 EP)는 세포 형광 biomolec 함께 인큐베이션 된 electrocompetent되는 음성 대조군에 대응개 모듈 있지만, 일렉트로 없습니다. 이러한 비 - 세포를 전기 천공 빈 셀의 자기 형광로드와 유사한, 세포를 전기 천공에 의해 표시되는 형광 강도보다 상당히 낮은 형광 수준을 나타낼 것이다. 이것은 세포 외막에 접착 있었을 비 표지 된 생체 분자의 내재화 제거를 확인한다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig2.jpg" /> 그림 2 : 박테리아에서 서로 다른 농도에서 다른 형광 물질로 표지 dsDNA의 내재화 (AE) 및 효모 (F)를위한 대표 결과 왼쪽에서 오른쪽으로. 백색광, 형광 및 오버레이 이미지. - / + EP는 전기와 함께 / 않고 배양을 의미한다. 스케일 바 : 3 μm의. A. CY3B dsDNA, 10 pmol의, E. 대장균. B. ATTO647N dsDNA, 10 pmol의, E. 대장균. C. Alexa647 dsDNA 5 pmol의, E. 콜라이. D. CY3B dsDNA, 100 pmol의, E. 콜라이. E.의 ATTO647N ds는DNA, 100 pmol의, E. 대장균. F. ATTO647N dsDNA, 30 pmol의, 효모. 이 그림은 참조 (26)에서 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52208/52208fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 셀당 내면화 생체 분자의 수를 카운팅 절차는 함께 표지 된 DNA와 상이한 농도로 얻어진 대표적인 결과,도 3 및 보충이 영화에 제시되어 photobleaching에 분석을 이용하여 셀당 내면화 표지 된 생체 분자의 수를 추정한다. 셀 로딩 효율 인큐베이션 표지 된 DNA의 초기 량에 따라 증가, &quot;단일 분자&quot;수준 (&lt;10, 보충 영화 2B) &quot;앙상블&quot;수준 (&gt; 10로 조정하는 사​​용자에게 셀당 표지 된 분자의 수를 허용 , 보충 영화 2A). 로드 된 세포의 비율을 추정하는 방법은 강력한 t이고O, 비 - 일렉트로 세포의 평균 기포 강도 및 3 배에 달하는 표준 편차 (즉, 아베 (I-EP) + 3 * STDDEV (I-EP) 아베 = 평균 이상의 셀 강도를 표시하는 일렉트로 세포의 수를 세 I = 픽셀 당 강도, Dev.에. = 표준 편차 -EP = 비 일렉트로) (그림 3). <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig3.jpg" /> 도 3 :. photobleaching에 내재화 분석을 이용하여 분자의 수를 계수 (A)는 단일 셀 photobleaching에 분석. 형광 강도 timetraces의 예 (파란색 : 원시 데이터, 빨간색 : 적합; 세트 : WL과 전 표백 후 ATTO647N 표지 dsDNA로드 대장균의 형광 이미지). 탑 : 한 단계 백화 현상. 중동 : 표백을 보여주는 ± 3 분자를 포함하는 세포점멸. 바닥 : 적어도 10 분자에 대응&gt; 10 단계를 포함하는 셀 6 미만 구별 단계를 포함하는 셀 (57)로부터 자동 - 피팅 알고리즘 단계에서 한 단계 높이의 강도 (B)의 히스토그램.. 단일 가우스 착용감 초당 8100의 단일 광자 형광 강도에 대응하는, 11 ± 3 AU 중심된다. 별표는 위 또는 단일 형광 강도에 의해 초기 형광 강도를 나누어 계산 ATTO647N dsDNA 상이한 양으로 일렉트로 셀당 내면화 분자의 동일한 50 AU (C) 히스토그램 모든 단차를 수집 함을 표시한다. 위에서 아래로 : 빈 셀 (즉, 형광 분자로 배양되지 않고 일렉트로되지 않음), 비 일렉트로 (그러나 형광 분자라는 -EP 배양) 및 electroporation하여 세포가 10 100 pmol의 (EP + 이름) dsDNA와 함께 배양 하였다. 빈 비 일렉트로 세포 대응자가 형광에, 일렉트로 반면 세포 (≥ 4 분자 별표 마크 빈 참조) 100 pmol의에서 높은로드 셀의 높은 비율이 내면화 된 분자의 넓은 분포를 보여줍니다. 국제화 효율 10, 100 pmol의 샘플 (INT와 세포의 비율은. + 3 배 Dev.에. 비 -EP 샘플의 의미&gt;)는 각각 94 %와 90 %였다. 10 pmol의 dsDNA 121 ± 106 분자, 100 pmol의 dsDNA 176 ± 187 분자 : 셀 당 내면화 분자의 수를 의미한다. 설정 : 100 MS 노출, 위드 조명. 스케일 바 : 1 μm의. 이 그림은 참조 (26)에서 수정되었습니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52208/52208fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 셀 로딩과 생존 표지 된 생체 분자의 변화량 이외에 종래 전기 천공 세포에 첨가,사용자는 전기 중 (그림 4, 보충 동영상 1) 다른 필드 강점을 선택하여 조정 내면화 분자의 양을 수 있습니다. 높은 필드 강도는 더 국제화 효율성으로 이어질하지만 세포 생존 능력의 약간의 감소로 이어집니다. 단백질의 내재화를 들어, 여과 공정의 사용은 비 표지 된 단백질을 내면화 (3.3.3.1.1 참조)를 제거하는 데 도움이된다. 이러한 경우, 셀 여과 관측 형광 단백질이 실제로 박테리아 세포질 내부에서 내재화되는 것을 보장; 우리는 (자세한 내용은, REF 22 참조) 그러나, 여과는 세포 생존 능력에 부정적인 영향을 가지고 있습니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig4.jpg" /> 그림 4 : 셀 로딩과 생존시 전기 전압의 영향 (A)로드 effic에 전기 자기장 강도의 효과를 나타내는 막대 차트.iency (빨간색 막대)와 세포 (녹색 막대)의 생존. 37 ° C에서 아가 패드 1 시간 후 비 - 일렉트로 셀 (0 kV로 / cm)에 나누어 84 ± 8 %. 동일한 조건 하에서 78 ± 3 % 및 0.9 kV로 / cm 내지 1.8 kV로 / cm에서 전기 천공 셀 49 ± 3 %를 각각 1 시간 후 나눈다. 세포를 92 ± 6 %가 1.8 kV로 / cm에로드하는 동안 적재 효율, 셀 (73)은 ± 8 %, 0.9 kV로 / cm로 로딩된다. 오차 막대는 세 독립적 인 측정으로부터 계산 된 표준 편차를 나타내고; 200 개 이상의 세포는 각각의 샘플과 각각의 반복에 대해 분석 하였다. 여러 세대에 걸쳐 세포 생존을 약간 손해에 전기 전압 전반적인 적재 효율이 증가한다. (B) 형광 세포 기반 측정은 전반적인 형광 강도가 두 개의 딸세포간에 똑같이 공유되는 것을 보여준다. 셀 1과 2는 t = 0에서의 스케일 (왼쪽) 백색광 이미지에서 세포 수 및 형광 영상을 의미바 : 1 ㎛). 이 수치는 참조 (26)에서 수정되었습니다. 단백질 국제화 단백질 내재화를위한 대표 결과는도 5A &amp; B에 있습니다. 이것은 이전에 가능 일렉트로 같은 단백질 샘플로부터 가능한 나머지 (미) 염료를 가능한 많이 제거하는 것이 특히 중요하다. 도 5a &amp; B, CY3B 표지 클레 나우 단편 샘플 (KF는 대장균 DNA 중합 효소 I의 클레 나우 단편 CY3B-KF, 66 kDa의) 1 % 무료 염료를 포함의 예에서; 전체 셀 로딩에 염료의 기여는 무시할 수있다. 자유 염료의 등량 전기 천공 (표지 된 동일한 양의 단백질과 함께 배양) 비 일렉트로 세포 모두 관심 electroporation하여 샘플의 비교뿐만 아니라 세포 관찰 형광 분자되도록하여 두 개의 필수 구성 컨트롤참으로 표지 단백질을 내장되어 있습니다. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig5.jpg" /> 그림 5 : 라이브 박테리아의 단백질 국제화 (A) 뷰의 대표적인 형광 오버레이 필드.. 세포는 1 % 무료 CY3B 염료가 포함 된 단백질 원액에서 50 pmol의 RNAP ω 서브 유닛으로 1.4 kV의 전압에서 전기 천공. 비 전기 천공 (비 -EP)과 빈 셀은 이전과 같이 정의된다. 자유 염료 RNAP ω 일렉트로 샘플과 동일한 농도로 내재화시켰다. 1 mW의 (A)의 샘플에 대한 보정 세포 평균 강도의 50 밀리 노출. (B) 분포 넓은 필드 모드, 532 nm의 여기에서 이미징, 총 세포 수의 비율에 따른다. 샘플 당 400 개 이상의 세포를 분할했다. 이 수치는 참조 (22)에서 수정되었습니다. unla의 (C) 국제화T7 프로모터의 통제하에 pRSET-EmGFP 플라스미드 인코딩 에메랄드 GFP (EmGFP)를 들고 electrocompetent DH5α에이라고 표기 T7 RNA 중합 효소 (T7 RNAP, 98 kDa의). 왼쪽 : 분석의 개략도. 중동 : 형광 오버레이. 오른쪽 : 배양 및 T7 RNAP (아래)와 일렉트로 비 electroporation하여 샘플 (위)과 전지 셀 기반 형광 강도의 히스토그램; 일렉트릭 세포의 약 11 %가 높은 형광 강도 표시 (INT와 세포의 일부를.&gt; + 의미 배 Dev.에. 비 -EP 샘플의) EmGFP의 발현을 나타내는. 3 μm의 : 별표 위 또는 동일한 1,100 AU 스케일 바의 모든 강도를 수집 쓰레기통을 나타냅니다. 이 수치는 참조 (26)에서 수정되었습니다. 그림 5c는 단백질 전기의 또 다른 응용 프로그램을 제공합니다. 여기에, 일렉트릭 단백질은 레이블이없는, 그러나 그것의 내면화는 관찰 형광 반응을 트리거합니다. 이 실험은 사전 검증가 나타나지 않는 및 세포질에 electroporation하여 단백질의 기능을 제공합니다. 레이블이없는 T7의 RNA 중합 효소 (98 kDa의)는 E.으로 내면화되었다 T7 프로모터 (26)의 제어하에 형광 단백질 EmGFP위한 코드하는 플라스미드를 함유하는 대장균 균주 DH5α. T7 RNA 중합 효소의 유전자가 DH5α에 존재하기 때문에, 우리의 실험에서 EmGFP 식 기능 T7의 RNA 중합 효소는 전기 (그림 5C)를 통해 세포 내로 도입되어 있어야합니다. 1 pmol의 T7 RNAP, 세포의&gt; 11 %로 전기를 이하의 (청색 막대도 5C)은 음성 대조군보다 높은 형광 나타냈다 (T7 RNAP 동일한 양 배양을하지만 일렉트로 생략). 이 결과는 일렉트로 내재화 T7 RNAP 분자의 비율이 생체 내에서 자신의 무결성을 유지하고 세포질에서 의도 기능을 수행 할 수 있다는 것을 정한다. 생체 내에서 단일 분자 FRET및 단일 세포 수준 마지막으로, 살아있는 박테리아에 이중 라벨 종의 내재화 및 분석 3. 형광 단백질 융합 생체 내 smFRET 연구에 적합하지 않은 그림 6과 보충 영화에 제시되어, 전기를 사용하여 살아있는 세포에 이중 라벨 생체 분자를 제공 할 수있는 능력은 하나입니다 이 방법의 가장 큰 자산. 그림 6a는 단일 셀 (기증자 - 수용체 FRET 쌍으로 CY3B 및 Atto647N의 형광체를 사용하는) 다른 FRET DNA 표준로드 박테리아의 분석을 FRET 제공합니다. 세포는 0.17, 0.48의 명백한 FRET 효율 세 짧은 이중 표지 dsDNA FRET 기준의 20 pmol의 (E *)로 전기 천공하고, 0.86는 시험 관내 (이전 26 결정). 모든 DNA를 (그림의 6A, 왼쪽)와 각각의 단일 셀 E의 * 분포의 주 피크 효율적으로 세포를 입력합니다 (체외 결과와 잘 그림 6A를 동의, 오른쪽). 중급 및 고급 FRET 샘플에서는, 하부 아마도 인해 셉터 표백 광 물리 비활성, 가변 셀 로딩의 조합, 관찰 예상보다 E의 * (따라서, 가변 신호 대 잡음 비) 및 DNA 분해와 세포 집단 . <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig6.jpg" /> 그림 6 :.. 단일 셀 및 단일 분자에 대한 대표 결과가 앙상블과 smFRET 연구 한 박테리아에 살고있는 박테리아에서 관찰 FRET 저를 보이는 각각의 세 가지 DNA FRET 기준의 20 pmol의로드 셀 (A) 분석 (~ 0.17) 중간체 (~ 0.48), 높은 (~ 0.86) FRET (체외 단일 분자 측정으로 측정 한, REF 26 참조). 왼쪽 : 흰색 빛과 그린 / 레드 (FRET) 형광 오버레이 이미지 (스케일 바 : 3 μm의). 다른 세포로부터의 FRET 값의 예는 (흰색) 표시된다. 조작<html> (위에서 아래로) HT :. 수정되지 않은 셀 기반 FRET (E *)는 DNA 표준을 FRET 기증자 만 (진한 녹색), 저 (밝은 녹색), 중간 (노란색), 고 (빨간색)에 대한 히스토그램 (B-D) 생체 smFRET합니다. 세포는 0.25 pmol의 중간 FRET DNA (패널 B), 0.25 pmol의 높은 FRET DNA (패널 C)와로드, 5 pmol의는 KF (패널 D)를 이중 표지. 왼쪽 열 : 전 수용체 광표백 후 단일 프레임의 그린 / 레드 형광 오버레이. 가운데 열 : 노란색 원 분자에 해당하는 시간을 추적합니다. FRET 효율, 기증자 방출 강도 및 수용체 방출 강도는 각각, 녹색, 파란색과 빨간색으로 표시됩니다. 오른쪽 열 : 기증자 만 분자 (녹색) 및 각 샘플에 대한 20 시간 추적에서 (노란색, 빨간색, 회색) 기증자 - 수용체 분자의 FRET 히스토그램. 스케일 바 : 3 μm의, B-D 1 μm의. 이 수치는 참조 (26)에서 수정되었습니다.208fig6large.jpg &quot;대상 =&quot;_ 빈 &quot;&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. DNA 또는 단백질 중급 및 하이 FRET DNA 표준 샘플, 소량 (0.25 pmol의) (그림 6B, C) ​​또는 FRET 쌍으로 이중 표지 KF (Alexa647 / CY3B의 형광의 5 pmol의 그림에 대한 생체 내에서 smFRET을 준수합니다 6D는) E.에 electroporation된다 대장균. 이러한 농도는 추적 및 단일 분자 모니터링 퍼즐, 직접 현지화를 허용, 몇 (N = 1-10) 표지 분자와로드 많은 세포로 이어졌다. 다른 사람이 움직이지 나타나거나 천천히 (보충 영화 3) 확산 반면 일부 분자는 자유롭게 확산. 1 ~ 30 초 동안 마지막과 smFRET의 특징을 보여 고정 이중 표지 생체 분자 (그림 6, 중)의 Timetraces : 예를 들어 수용체 표백시 기증자 및 수용체 형광 anticorrelated 변경 (, t는 ~ 16 초, 그림 6B, 중간 ), 단일 다음(예를 들어, t ~ 19 초, 그림 6B) - 스텝 기증자 표백. 이러한 timetraces (그림 6, 오른쪽)의 시험 관내 (in vitro) 연구 26,31,32 년에 출판과 매우 잘 일치에 평균 값의 결과에서 생성 FRET 분포. 이러한 결과는 내면화 된 DNA와 단백질의 정량 smFRET 연구에 대한 기능을 설정하고 (T7의 RNAP 국제화 실험에서 지원) 단백질이 전기 및 국제화에 자신의 무결성과 구조를 유지하는 것이 좋습니다. 보충 영화 1. 세포 생존 왼쪽 : 백색광 이미지. 오른쪽 : 형광 이미지. 애니메이션 GIF 10 pmol의의 Atto647 표지 DNA로드 박테리아의 전기 (1.8 kV의 / cm) 후 분열을 보여주는 애니메이션. 형광의 감소는 전반적인 명백 서로 부분적 중에 발생 광표백에 또한 세포 분열시 표지 된 DNA의 희석으로 인해이고측정. 보충 영화 2 : 세포 기반 광표백 연구 A.. (&gt; 100 Atto647N 표지 DNA 분자를 포함하는) 과도하게로드 셀의 대표적인 예. 왼쪽 위, 관심 (빨간색 사각형)의 셀의 백색광 이미지. 오른쪽 상단, 몇 분에 걸쳐 형광 붕괴를 보여주는로드 세포의 영화. 관심 셀의 전체 형광 강도 감쇠의 아래에, 시간 추적. 유기 형광 물질은 수명을 FPS보다 높은 크기의이 주문 (여기에, ~ Atto647N 41 초) photobleaching에 나타낼 수있다. 10 미만 표지 분자 (이 경우에는 3)로드 셀 B. 대표적인 예. 패널 A. 바닥, 단일 단계 표백을 보여주는 및 / 또는 단일 유기 형광에 해당 깜박 관심있는 셀의 전체 형광 강도의 시간 추적과 동일한 최고. 이 단계의 평균 높이가 ~ 여기 (단일 분자 단위 강도에 해당AU (12))은 셀 당 분자의 내재화 초기 수를 추정하기 위해 사용된다. 300 μW 전력에서 연속 적색 레이저 여기에서 영화와 프레임 당 100 밀리 초. 보충 영화 3 :. 나는 N 단일 분자 FRET 최고 생체 내 : 세포는 지속적으로 nTIRF 조명 아래 프레임 당 50 밀리에서 모니터 0.25 pmol의 (그림 6C에서와 같이) 고 FRET DNA는 1 mW의 녹색 (532 ㎚) 레이저를 사용하여로드. 각 프레임은 각 채널의 그린 / 레드 (FRET) 형광 오버레이입니다. 확산 및 움직이지 빨간색 (그대로)과 녹색 (단일 활성 라벨) DNA 분자는 관찰 할 수있다. 아래 : 노란색 원의 분자에 해당하는 시간 추적. FRET 효율, 기증자 방출 강도 및 수용체 방출 강도는 각각, 녹색, 파란색과 빨간색으로 표시됩니다. 안티 상관 수용체 백화 현상 (빨간색 - 투 - 녹색 전환) 단일 분자 FRET의 서명에 해당합니다.

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Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K 조회수.  University of Oxford. Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

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Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

단일 분자 단지를 떠올리 VIVO에서 고급 형광 현미경을 사용하여

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

연구

생물학

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

면역학 및 감염병학

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

편의적 곰팡이 병원균에 형광 태그 유전자의과 유전자 변형<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

세포는 형광 현미경 Electrofusion와 시각

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Live-Cell Fluorescence Microscopy to Investigate Subcellular Protein Localization and Cell Morphology Changes in Bacteria

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence microscopy as observations made at a population level may not truly reflect what occurs at a single cell level. Live-cell timelapse microscopy allows investigators to monitor the changes in cell division or cell morphology which provide valuable insights regarding subcellular localization of proteins and timing of gene expression, as it happens, to potentially aid in answering important biological questions. Here, we describe our protocol to monitor phenotypic changes in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus using a high-resolution deconvolution microscope. The objective of this report is to provide a simple and clear protocol that can be adopted by other investigators interested in conducting fluorescence microscopy experiments to study different biological processes in bacteria as well as other organisms.

This article provides a step-by-step guide to investigate protein subcellular localization dynamics and to monitor morphological changes using high-resolution fluorescence microscopy in Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

박테리아의 세포 외 단백질 국소화 및 세포 형태 변화를 조사하는 살아있는 세포 형광 현미경 검사법

Investigations of factors influencing cell division and cell shape in bacteria are commonly performed in conjunction with high-resolution fluorescence ...

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Live Cell Fluorescence Microscopy to Observe Essential Processes During Microbial Cell Growth

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of proteins which are essential for bacterial survival. A series of target-specific dyes can be used as probes to better understand these processes. Staining with lipophilic dyes enables the observation of membrane structure, visualization of lipid microdomains, and detection of membrane blebs. Use of fluorescent-d-amino acids (FDAAs) to probe the sites of peptidoglycan biosynthesis can indicate potential defects in cell wall biogenesis or cell growth patterning. Finally, nucleic acid stains can indicate possible defects in DNA replication or chromosome segregation. Cyanine DNA stains label living cells and are suitable for time-lapse microscopy enabling real-time observations of nucleoid morphology during cell growth. Protocols for cell labeling can be applied to protein depletion mutants to identify defects in membrane structure, cell wall biogenesis, or chromosome segregation. Furthermore, time-lapse microscopy can be used to monitor morphological changes as an essential protein is removed and can provide additional insights into protein function. For example, the depletion of essential cell division proteins results in filamentation or branching, whereas the depletion of cell growth proteins may cause cells to become shorter or rounder. Here, protocols for cell growth, target-specific labeling, and time-lapse microscopy are provided for the bacterial plant pathogen Agrobacterium tumefaciens. Together, target-specific dyes and time-lapse microscopy enable characterization of essential processes in A. tumefaciens. Finally, the protocols provided can be readily modified to probe essential processes in other bacteria.

Understanding the function of essential processes in bacteria is challenging. Fluorescence microscopy with target-specific dyes can provide key insights into microbial cell growth and cell cycle progression. Here, Agrobacterium tumefaciens is used as a model bacterium to highlight methods for live cell imaging for characterization of essential processes.

라이브 세포 형광 현미경 검사 법 미생물 세포 성장 하는 동안 필수 과정을 관찰 하

Core cellular processes such as DNA replication and segregation, protein synthesis, cell wall biosynthesis, and cell division rely on the function of ...

Introduction of Bacterial Effector Proteins into Mammalian Cells by Electroporation

Source: Sontag, R. L. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52296">Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate the introduction of bacterial effector proteins into mammalian cells by electroporation. The intracellular localization of the bacterial effector proteins is detected by confocal microscopy following staining with specific fluorophore-conjugated antibodies.

Electroporation에 의하여 포유류 세포로 Bacterial Effector 단백질의 소개

Source: Sontag, R. L. et al., Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate ...