טכניקות מיקרוסקופיות חדשות דורשות פיתוח כלים מתאימים להבנה נכונה של התהליכים הביולוגיים הנחקרים. פרוטוקול זה מתאר את שלבי עיבוד התמונה הנדרשים למעקב אחר מולקולה יחידה, כולל הערכה של פרמטרי דיפוזיה רוחבית וכמות גודל ספוט לאורך כל מסלולו בממברנה של התא. פרוטוקול זה משלב שימוש במספר חלקי תוכנה, כולל ImageJ, MATLAB ו- uTrack, כמו גם כמה חלבונים שפותחו במיוחד עבור פרוטוקול זה.
שיטה זו מאוירת עם מעקב אחר קולטני קרום תחת מיקרוסקופ אור, אבל זה יכול להיות מיושם על כל מבנה דמוי חלקיקים אשר מסלוליו ניתן לעקוב לאורך זמן ברצף וידאו. טכניקה זו מתייחסת למחקר בסיסי ואין לה יישום ישיר בסביבה קלינית. עם זאת, ניתן להשתמש בו כדי לסייע באפיון אירועים ביולוגיים הן במחלות שונות ולכן בזיהוי מטרות טיפוליות חדשות.
פרוטוקול זה רלוונטי למעקב אחר חלקיקים בממברנות הסלולר, כפי שמוצג בסרטון זה, אך ניתן ליישמו גם למעקב אחר תאים מלאים, חיידקים, חלקיקים בנוזל, או כל אובייקט אחר שמרכזו ניתן לקבוע היטב. פרוטוקול זה ידידותי למשתמש ודורש רק ידע בתרבות התאים ובטכניקות מיקרוסקופיה. הטכניקות השונות וכלים לא פורמטיים המשמשים בפרוטוקול זה עשויים להפחיד משתמש חדש.
ההדגמה החזותית מסייעת להשתמש בטכניקה זו בביטחון. כדי להתחיל, לגדל תאי Jurkat, לשנות אותם עם וקטור קולטן כימוקין מונומרי GFP שכותרתו, ולבחור תאים עם רמות ביטוי נמוכות של וקטור שכותרתו, כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. הוסף מדיה המכילה את הליגנד CXCL12 או את מדיית הבקרה לכל צלחות מיקרווול מצופות זכוכית מצופות פיברונקטין באורך 35 מילימטרים, מצופות בפיברונקטין, ודגירה למשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, מוסיפים תאים ממוינים לכל מנה, ומדגרים במשך 20 דקות לפני הדמיה של התאים. לאחר הדגירה, להעביר את המנה הראשונה של תאים לשלב מיקרוסקופ TIRF ולהפוך את המטרה טבילת שמן 100x. אתר את התאים באמצעות שדה בהיר והתמקד בהם כדי למזער אפקטים של שכפול תמונות.
לאחר מכן עבור למצב TIRF ובצע כוונון מיקוד עדין בעוצמת לייזר נמוכה. רכוש סרטים באורך של כ- 50 שניות, תוך מזעור מרווח הזמן בין המסגרות. עבור כל קובץ וידאו של תנאי ניסיוני, צור תיקיה חדשה בהתאם לכיווני מבנה הקבצים המתוארים בפרוטוקול הטקסט של וידאו זה.
פתח את הווידאו עם פיג'י או ImageJ על ידי גרירה ושחרור של הקובץ על שורת התפריטים פיג'י, ולחץ על אישור לייבא את קובץ LIF באמצעות bioformats. כדי לעצב מסיכה, יש לייבא גם את התמונה מרובת הערוצים המתאימה. לאחר מכן, צרו מסיכה על-ידי יצירת תמונה אחת תחילה עם הערוצים השימושיים לעיצוב המסיכה.
בחרו 'תמונה' בתפריט 'סרגל', ולחצו על 'צבע' ואחריו 'פיצול ערוצים' כדי להציג את הערוצים השונים כתמונות נפרדות. מזג שוב את שלושת הערוצים בתמונה בודדת על-ידי בחירה באפשרות תמונה בתפריט הבר, עבור אל צבע ובחירה באפשרות מזג ערוצים. הקפד לבחור את הערוצים המתאימים ולאחר מכן לחץ על אישור כדי ליצור תמונה חדשה שאינה מוערמת.
סנכרן את שני החלונות על-ידי הפעלה לתפריט הבר, בחירה באפשרות נתח ולאחר מכן עבור אל כלים ובחירה באפשרות סנכרן את Windows. חלון חדש עם אפשרויות התמונה המסונכרנת יוצג. כעת, כאשר שני החלונות מסונכרנים, ניתן לחתוך את אותו אזור בשני החלונות.
עבור אל תמונה בתפריט הבר ובחר חתוך. בעזרת כלי הבחירה המלבני, ציירו את אזור העניין. שתי התמונות החתוכה יראה בנפרד.
לאחר מכן, בטל את הסנכרון של שני החלונות. אם לא נוצרה מסיכה, ציירו את אזור העניין בכלי הבחירה ובחיתוך. לאחר מכן, שמור את הווידאו כרצף תמונות בספריה Videosec.
לאחר מכן בחרו בתמונה מרובת הערוצים, עברו לתוספות בתפריט ובחרו 'עורך פילוח' לפתיחת תוסף עורך הפילוח. בחרו בכלי הבחירה ביד חופשית, ולהשתמש בו לבחירת תווית ירוקה ולעיצוב המסיכה החיצונית ביותר. לאחר עיצובו, לחץ על לחצן הפלוס באפשרות בחירה של חלון ללא הפרדות צבע, והמסיכה שנבחרה תוצג במציג.
חזור על שלב זה עבור כל התוויות. לאחר שכל המסיכות מעוצבות, שמרו את המסיכה עם שם קובץ זהה לשם הסרטון, עם השם:מסיכה.tif. פתח את MATLAB והוסף את ספריית uTrack לנתיב על-ידי בחירה באפשרות הגדר נתיב ובחירה באפשרות הוסף באמצעות.
לאחר מכן, שנה את ספריית העבודה לספריה המכילה את הסדרה שיש לנתח. הפעל את uTrack על-ידי הקלדת GUI של בורר סרטים במסוף והקשה על Enter. פעולה זו תגרום לחלון בחירת הסרט להיפתח.
לחץ על לחצן סרט חדש והמתן עד שיופיע החלון הוספת סרט. לחץ על הוסף ערוץ כדי לבחור את הספריה עם הווידאו ולמלא את הפרמטרים של פרטי הסרט. הגדר את ספריית הפלט עבור התוצאות של uTrack לתוצאות ולאחר מכן לחץ על הגדרות ערוץ מתקדמות, מלא את הפרמטרים הקשורים לרכישה ושמור.
לאחר יצירת הסרט, הקש על המשך בחלון בחירת הסרט. כאן, uTrack ישאל על סוג האובייקט שיש לנתח. בחר חלקיקים בודדים ולאחר מכן יופיע חלון לוח הבקרה.
לאחר מכן, בחר את השלב הראשון, שלב 1:זיהוי, ולחץ על הגדרה. יופיע החלון 'התאמת מודל תערובת גאוסיאנית'. הזן את ההגדרות כפי שמוצג כאן ולאחר מכן הקש Apply.
בלוח הבקרה, לחץ על הפעל כדי להפעיל את שלב הזיהוי. לאחר מספר דקות, בדוק את התוצאות על-ידי לחיצה על לחצן תוצאה. הסרט מראה עיגולים אדומים על החלקיקים שזוהו.
אם לא מוצג עיגול אדום, שלב זה לא פעל כראוי ועליך לנסות שוב. עכשיו, למזג את החלקיקים שהיו רק זוהו לרצועות המשתרעות על פני מסגרות מרובות על ידי הגדרת תחילה את הפרמטרים כפי שמוצג כאן. לאחר מכן הקש על הפעל בלוח הבקרה.
לאחר מכן, בצע ניתוח מסלול. הגדר את ההגדרות, כפי שמוצג כאן ולאחר מכן הקש על החל ו הפעל. אמת את התוצאות על-ידי לחיצה תחילה על לחצן תוצאה ולאחר מכן לחץ על הצג מספר רצועה של חלון אפשרויות הסרט ובדוק מסגרת אחר מסגרת שכל רצועה זוהתה כראוי, תוך סימון ידני של חלקיקים שאינם חלקיקים אמיתיים.
ב- MATLAB, הזן את הפקודה כפי שמוצג כאן. פקודה זו תגרום לתוכנית לקרוא את כל המסלולים ול לחשב את מקדמי ההתפזרות. לאחר מכן, אל תכלול מסלולים המתאימים לנקודות או מסלולים שזוהו באופן שגוי על-ידי מתן רשימת הנקודות שלא ייכללו.
חשב את מקדמי ההתפזרות המידיים עבור כל אחד מהרצועות של תא זה על-ידי ביצוע יחד בפרוטוקול הטקסט הנלווה. במקרה זה, לחשב את מקדם דיפוזיה עבור זמן-השהיה שווה 4 הנקרא D1 עד 4. בסיום, פרקו את המסלולים למסלולים קצרים וא long.
כדי לנתח מסלולים ארוכים, הקלד את הפקודה כפי שמוצג כאן כדי לסווג את סוג התנועה דרך ספקטרום קנה המידה של הרגע שלהם. לנתח את העוצמה של כל חלקיק לאורך המסלול שלהם. קבע את התצורה של אופן פעולה בסיסי זה בדרכים רבות ושונות על-ידי ביצוע פעולה בפרוטוקול הטקסט הנלווה.
לאחר מכן, לאסוף את המידע דיפוזיה ועוצמה עבור כל המסלולים. לאסוף רק את המידע דיפוזיה ועוצמה עבור מסלולים קצרים. לבסוף, אסוף את קנה המידה של ספקטרום הרגעים ואת מידע העוצמה על-ידי הקלדת הטקסט הבא, כאשר ארוכה הסיומת ששימשה קודם לכן.
השימוש בטכניקות המתוארות בפרוטוקול זה מאפשר מעקב אוטומטי אחר חלקיקים שזוהו בסרטי מיקרוסקופיה פלואורסצנטיים וניתוח המאפיינים הדינמיים שלהם. מניתוח זה ניתן לקבל מאפיינים שונים המבוססים על וריאציות בגירויים. זה כולל, את אחוז כתמים immobile מבוסס על ארבעה גירויים שונים, אחוז מסלולים ארוכים של יותר מ 50 מסגרות, ואת סוגי התנועה לאורך המסלולים כפי מחולק על ידי תנועות מכוונות, חופשיות או מוגבלות.
בנוסף, ניתן לקבוע את מקדם ההתפזרות, את התעצמות הנקודה הממוצעת ואת מספר הקולטנים לכל חלקיק. פעולה זו מציגה את התפלגות ערכי מקדם הדיפוזיה הקצרים עבור כל נקודה בתגובה לגירויים שונים. הקו האדום מייצג את הערך החציוני, גרף דומה זה מציג את התעצמות הנקודה הממוצעת עבור כל נקודה לאורך 20 המסגרות הראשונות שלה בתגובה לאותם גירויים.
שוב, הקו האדום מייצג את ערך העוצמה הממוצע. כמו עוצמת תיקון ממוצע של נקודה קשורה עם מספר חלבונים פלואורסצנטיים נוכח במקום זה, אפשר לחשב ישירות את מספר הקולטנים לכל חלקיק, כפי שמוצג כאן. MATLAB היא שפת תכנות תלויית רישיות.
באפשרותך לשנות את שמות המשתנים ביחס לשמות המתוארים בפרוטוקול זה, אך הקפד להיות עקבי במתן השמות שלך. אין אפשרות לשנות את שמות הפונקציות, ופסיקים, נקודתיים ונקודתיים למחצה חשובים לתחביר נכון. מיקרוסקופיה של מולקולה אחת מאפשרת הדמיה של חלבוני קרום בודדים ברזולוציה מרחבית-זמנית חסרת תקדים ומספקת הזדמנויות ייחודיות לחשוף היבטים בלתי צפויים של ביולוגיה של התא.
פרוטוקולים אלה פותחים דלתות חדשות לניתוח כמותי של סרטוני מיקרוסקופיה בתאים וביולוגיה מולקולרית.
