この作品は、韓国国立研究財団（NRF- 2012R1A6A3A040395、NRF-2013R1A1A2057708、NRF- 2012R1A1A1011023）を通じて2014年KAIST資金によるK-バレーRED＆Bプロジェクトと基礎科学研究開発プログラムでサポートされています。

注意：発ガン性アセトンとクロロホルムの使用前に製品安全データシート（MSDS）を参照してください。 フラット空気 - 水界面でのリン脂質単分子膜の作製<ol><li>リン脂質単分子層の形成<ol><li>リン脂質溶液の調製<ol><li>アセトン、エタノール、および脱イオン水を少なくとも3回を使用して、ポリテトラフルオロエチレンコーティングされたキャップでバイアル、および水を取り除くためにバイアル中に充分に窒素ガスを吹き付けるmlの4を清掃してください。 </li><li>濃度1mg / mlのを得るために、バイアル中のクロロホルム1mlにリン脂質1mgの（例えば、ジオレオイルホスファチジルコリン、DOPC）を溶解します。安全のためにヒュームフード内でこの手順を実行します。必要に応じて、リン脂質溶液のより低いまたはより高い濃度を使用してください。 </li><li>染料を追加したリン脂質のソリューの1モル％未満でリン脂質（例えば、ローダミンジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ローダミンDPPE）をタグ付けン、蛍光顕微鏡を用いてリン脂質単分子層を可視化するためです。安全のためにヒュームフード内でこの手順を実行します。 </li><li>溶媒の蒸発を防止するために、ポリテトラフルオロエチレンテープでバイアルをラップし、-20℃の冷凍庫でサンプルを保存します。 </li></ol></li><li>空気 - 水界面へのリン脂質の沈着<ol><li>ペトリ皿（直径55ミリメートル、高さ12ミリメートル）エタノール、および脱イオン水を少なくとも3回清掃してください。 </li><li>空気 - 水界面を作成するために、脱イオン水10mlでペトリ皿を埋めます。 </li><li>所望の表面圧力を達成するためにクリーンなインターフェイス上にマイクロシリンジを用いてリン脂質溶液の数マイクロリットルを広げ、実験前をやっに、溶媒を完全に蒸発させるために、少なくとも30分間待ちます。 注：ラングミュアトラフは、表面圧力の正確な制御が必要な場合に代えて、ペトリ皿を用いることができます。 </li></ol></li></ol></li><li>蘇rface圧測定<ol><li>ウィルヘルミー板張力を有するリン脂質単分子膜の表面圧を測定します。濾紙をウィルヘルミー板として使用されている場合は、フィルター紙は十分に湿らせ得るために、少なくとも30分間待ちます。詳細なプロトコールは、クーンらで利用可能です。20。 </li><li>正確に面圧を制御するために、リン脂質の付着量を調整します。 〜5 MN / mの表面圧の場合、インタフェースの30.25センチメートル2 -areaにDOPC溶液（1mg / ml）の4μLを追加が必要です。 注：濾紙が完全に湿潤していない場合は、面圧が原因濾紙の重量変化を、実験の最初の30分の間に劇的に変化します。 </li></ol></li><li>単層の対流の最小化<ol><li>の対流を抑制するために、ペトリ皿の大部分に接続された2つの薄いチャネルを有する3mmのリザーバーを含み、円錐状の装置を使用して形態イメージングと面圧測定を妨害することができ、単層、。 </li><li>リン脂質は、空気 - 水界面にリン脂質を堆積させる前に、全領域にわたって自由に移動することを確実にするために、円錐状の装置の内部と外部との間の水のレベルが一致することを確認します。 </li></ol></li></ol>液滴の曲面でリン脂質単分子膜の作製<ol><li>マイクロピペットプラーを使用して、ガラスキャピラリーのプロセスを先細り<ol><li>マイクロピペットプラーのキャピラリーホルダーにガラスキャピラリー（OD 1ミリメートル、ID 0.78ミリメートル、長さ100ミリメートル）を配置します。 </li><li>適切なパラメータ値（：ランプ、引き出し：60、ヴェル：70、ディレイ：熱70と圧力200）と毛細血管を引くためのプログラムを設計し、製造業者のプロトコルに従って設計されたプログラムとの毛細血管を引っ張ります。 注：キャピラリーは数マイクロメートル、直径で終了すると、APPLによって100μmの液滴を形成する必要があります〜10キロパスカルで圧力をYING。キャピラリの先端が、非常に高い圧力、&gt; 600 kPaで小さすぎる場合は、大きすぎるキャピラリ先端で液滴のサイズを制御することは困難であるが、液滴を得るために必要とされます。 </li></ol></li><li>液滴表面へのリン脂質の吸収 注：液滴の湾曲した界面でのリン脂質単分子層を形成するために、染料なしのリン脂質溶液は、リン脂質をタグ付け強度コントラストを得るために使用される、平坦な単層に対して、また、手順1で調製手順2.2.1及び2.2の両方0.2は、ここで許容されています。液滴表面での面圧の精密な制御が必要な場合は、手順2.2.2を強くお勧めします。しかし、そうでない場合は、手順2.2.2よりもはるかに簡単な方法である手続き2.2.1は、便利です。 <ol><li>先端のリン脂質の塗布工程<ol><li>少なくとも3倍、アセトン、エタノール、および脱イオン水を使用したスライドガラスを清掃してください。 </li><li> PL洗浄スライドガラス上のテーパーキャピラリをエース、および先端をスライドガラスに触れ容易にするために、毛細血管を傾けます。 </li><li>ガラスシリンジを使用してスライドガラスに接着され、キャピラリの先端にリン脂質溶液（1mg / ml）の数滴を落とし、そして溶媒を完全に蒸発させるために少なくとも30分待ちます。 注意：先端の周囲のみが毛細管力によって先端部にリン脂質の液滴を保持するには小さすぎるので、それは非常に手続き2.2.1.3中にガラススライドにキャピラリの先端を接着することをお勧めします。 </li></ol></li><li>ベシクル溶液の調製<ol><li>バイアルを清掃して、手順1.1.1.1で導入されたように、バイアルから水を除去します。 </li><li>穏やかに窒素ガスを適用することにより、リン脂質溶液（1mg / ml）2mlの体積を乾燥し、残りの溶媒を除去するために室温で1時間、バイアルを乾燥させます。安全のためにヒュームフード内でこの手順を実行します。 </li><li> 2を追加乾燥した脂質を含有するバイアルに、脱イオン水のmlであり、1時間60℃のオーブン中でバイアルをインキュベートします。 </li><li>小胞を得るために30分間（370 W：40 kHzの、電源までのHF周波数）、および超音波処理バイアルを数回振ります。 </li><li>単分散単層小胞を得るために、押出及び凍結融解処理を実行します。小胞を調製するための詳細なプロトコールは、メイヤーらに記載されている。21。 注：液滴界面の面圧が単分散の単層小胞を含んでいる小滴を形成した後に待機時間を調整することにより正確に制御されます。ペンダントドロップ法22を用いて、前の実験を行うには、時間に応じて面圧の変化を測定する必要があります。 </li></ol></li></ol></li><li>曲面でのリン脂質単分子層を含んでいる小滴の形成<ol><li> procedurからの脱イオン水10μlのテーパーキャピラリーに記入E 2.2.1。また、手順2.2.2からベシクル溶液10μlを使用しています。 </li><li>液滴を形成するための圧力を提供するために、自動化されたマイクロインジェクタにキャピラリを接続します。 </li><li>正確に、キャピラリの位置を制御するマイクロマニピュレーターにマイクロインジェクタに接続されているキャピラリーをマウントします。 </li><li> CCDカメラでキャピラリーの側面図を撮像するための：明視野顕微鏡（10倍NA 0.3顕微鏡1、対物レンズ）を準備します。顕微鏡1は、このようにz軸に沿って液滴の正確な位置を観察し、液滴の大きさを推定することが可能となります。 </li><li>適当な大きさになるまで（〜100、先端部の側面図はよくマイクロマニピュレーターを用いて顕微鏡1によって可視化された位置に先端を移動し、キャピラリーの先端に可変圧力（〜100ヘクトパスカル）を適用液滴の直径がμm）が形成されています。 注：これは、自動化されたマイクロインジェクターやマイクロマニピュレーターが使用することをお勧めしますD、液滴の液滴の大きさと位置の微調整が必​​要な場合。これは手動のものを使用することも可能です。 </li></ol></li></ol>液滴マージ後の3イメージング蛍光回復注意：このプロトコルの基本原理は、液滴合一プロセスを除いて、FRAP技術のものと同一です。 FRAPの詳細なプロトコルおよび関連する理論は、A・ロペスら 15およびDアクセルロッドら 16でご利用いただけます。 <ol><li>液滴の位置を監視し、制御します<ol><li>ローダミンDPPES（560 nmでの励起、583 nmでの発光）のための適切なフィルターセットを蛍光顕微鏡の両方を可能にします（：10×NA 0.3、結像レンズの焦点距離17センチメートル顕微鏡2、対物レンズ）セット倒立顕微鏡を準備そして明視野顕微鏡。蛍光顕微鏡メートルで、液滴の上面図を可視化するために、ここでCCDカメラを使用してくださいODEと明視野顕微鏡モード。 </li><li> z軸に沿ってフラット空気 - 水界面にリン脂質でコーティングされた小滴を移動しますが、マイクロマニピュレーターを使用して、まだ液滴をマージしません。液滴の側面図を可視化する顕微鏡1を使用します。 </li><li>マイクロマニピュレーターを使用して、平らな単層の上面図の中心に小滴の位置を確認します。平らな単層の上面図を可視化するために、顕微鏡2の明視野顕微鏡モードを使用します。 </li></ol></li><li>フラット空気 - 水界面への液滴のマージ<ol><li>液滴がマイクロマニピュレーターを使用して、インターフェイス上にマージされるまで平坦な界面に向けて更なる液滴を移動します。マージ処理が正常に行われた場合、白い背景に囲まれた円形状の暗領域は、顕微鏡2の蛍光モードを用いて観察されます。 </li><li>ミクロスの蛍光モードを使用して、液滴をマージした後、時間による蛍光画像の系列を記録します2.ここでは、単層の拡散時間スケールよりも速いフレームレートを使用して対処します。 DOPC単層では、それは完全に200μmの暗い領域内に拡散するために数分かかります。 </li></ol></li></ol> 4.画像解析によって拡散係数の決定注意：以下に説明するように、一連の画像から拡散係数を決定するために、画像解析用にカスタマイズされたプログラムが組み込まれています。このプログラムの詳細なソースコードは、Joveのウェブサイトで利用可能です。 <ol><li>関心の円形領域の検出<ol><li>関心領域の中心の検出<ol><li>円形暗い領域と白の背景を含むリカバリプロセス中に記録された蛍光画像のシリーズを入手して、基準画像としてシリーズの最初の画像を設定します。ここで、R Dは、参照画像内の暗い領域の半径です。 </li><li>誰白丸で参照画像を畳み込みますSE強度が全領域にわたって均一です。ここでは、カスタマイズプログラム行124のソースコードに示すように、コンボリューションのための「CONV2 &#39;という名前の埋め込 ​​み機能を使用して、白い円の半径はR Dよりもわずかに小さいです。 </li><li>畳み込み演算の最小値を示す位置を検索し、参照画像内の関心領域の中心としてこの位置を設定します。 </li></ol></li><li>関心のある領域の半径を決定します<ol><li>全領域にわたって手順4.1および均一な強度によって決定される中心位置を含み、白丸で参照画像を畳み込みます。ここで、R Sは、白い円の半径です。使用反復ような &#39;の&#39;またはカスタマイズされたプログラム行109から102のソースコードに示すように白丸を作るために円の方程式と「しばらく」など。 </li><li>少し持っている別の白丸で参照画像を畳み込みますR Sよりも大きな半径（5％-10％）であり、R L、。カスタマイズされたプログラム行120から113のソースコードに示すように円を作るための手順4.1.2.1と同様の方法を使用します。 </li><li> 4.1.2.1と4.1.2.2の2畳み込み計算の間の値の差を取得します。 </li><li>ピクセルレベルでR SとR Lの両方を増加させることにより、R、S = 2R Dに R S = R D / 2から上記の手順を繰り返します。繰り返すように4.1.2.3に手順4.1.2.1からの全ソースコードが含まれている反復を行います。 </li><li> 2畳み込み計算の間の値の最大差を示すR Sの半径を検索します。このRは、このように、参照画像内の暗い領域の半径を示し、S 149にカスタマイズしたプログラム行148のソースコードに示すように半径を見つけるために、「最大」という名前を使用し、組み込み関数は、値の最大差を示しています。 </li></ol></LI&gt; </ol></li><li>分数の強度の計算<ol><li>関心領域として手順4.1によって決定中心位置と半径を、含まれている円を設定します。 </li><li>時間に応じて蛍光画像の一連の関心領域の平均強度を計算します。関心のある領域で各フレームを畳み込むと平均強度を計算するために、関心領域の面積で割り。詳細はJoveのウェブサイトで提供されてカスタマイズされたプログラムのソースコードで提供されています。 </li><li>次式のように定義分数強度を計算し、F（t）は時間に応じて関心領域である円内の平均強度であり、F iは円の中に最初の強度であり、F oはの強度であり、白い背景。 F（T）=（F（T） - F I）/（F O - F i）を （式1）。 </li></ol></li><li> FフィッティングFRAP理論にractional強度<ol><li> I 1はフィッティングプログラムを使用して、ベッセル関数を変更され、τは特性拡散時間とI 0である下記式、で端数強度を取り付け、τを得ます <img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/53376/53376eq2.jpg" /> （式2）。 </li><li> Dは拡散係数であり、暗い領域の半径である関係、τに基づいて、拡散係数= 2/4 Dを 、取得します。 注：フィッティングプロセス中に、回復プロセスは、すでに画像を記録する前に、開始されたときに、時間軸に沿って分数強度プロファイルをシフトすることが可能です。 </li></ol></li></ol>

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+recovery+after+merging+a+surfactant-covered+droplet:+a+novel+technique+to+measure+the+diffusion+of+phospholipid+monolayers+at+fluid/fluid+interfaces.">Fluorescence recovery after merging a surfactant-covered droplet: a novel technique to measure the diffusion of phospholipid monolayers at fluid/fluid interfaces.</a> Langmuir. 30 (48), 14369-14374 (2014).</li></ol>

The authors declare no competing financial interest.

FRAMは、特に特定の領域を漂白した後蛍光回復を測定するため、FRAPとの基本原則の多くを共有するが、FRAMは、漂白の領域を形成するために平坦な界面上に液滴をマージする代わりに、強い光を適用するプロセスを使用しています。マージ処理は、このようにFRAMの中で最も重要なステップであり、特に、液滴をマージした後のフラット化単分子膜で暗い染みの形状は、拡散率測定の精度を決定します。具体的には、現在の方法に基づいて、我々は唯一の手順4に示した暗い染色の平均強度を計算する関心領域として半径Rの円を設定し、円形状からあまり偏差がある場合、これは、拡散係数の正確な測定を妨げるであろう。したがって、円形の暗領域を得るために必要であるが、非円形の形状が原因で、いくつかの理由のために時折形成されています。まず、ペットにおける対流が存在する場合里皿を、暗い領域の形状は、流れの方向に沿って細長いなります。手順1.3で述べたように、円錐形装置は、対流を抑制するのに役立ち、そしてこの伸びを最小限に抑えることになります。キャピラリの先端がマージプロセス中に平坦な界面に触れるとキャピラリー端がマージ処理を中断するので秒、暗い領域は、様々な形状に形成されています。唯一の毛細管の最後からぶら下がっている液滴を取得することにより、この中断を防止することができます。具体的には、キャピラリーの疎水化処理は、キャピラリの最後に座って液滴をするのに役立ちます。したがって、上記のトラブル銃撃や修正をより正確に拡散特性を測定することが可能となります。 このよくtroubleshotプロセスは、このようにFRAMは、FRAPの上にいくつかの重要な利点を持つことができます。まず、FRAMは、FRAPに比べて簡単な装置を必要とします。 FRAMのために、簡単な蛍光MICROSを使用するのに十分です代わりに波長色素の吸収スペクトルと一致している必要があり、高出力レーザーで高価な共焦点顕微鏡で、対応いたします。また、FRAMは、液滴サイズ、液滴表面の面圧を調整することにより、容易に領域のサイズを制御しながら、FRAPで漂白領域の大きさを調整するために追加の装置を使用する必要があります。第二に、FRAM中の染料の様々な種を使用することが可能です。 FRAPは、その漂白プロセス、拡散プロセスよりもはるかに高速である色素分子を使用しています。染料の拡散が漂白工程中に発生した場合、それは正確に拡散特性を推定することは困難です。 FRAMは、しかしながら、染料を漂白するための方法を必要とせず、これは、このように蛍光イメージングにおける染料の様々なタイプの使用を可能にします。また、FRAPは、追加の高出力レーザーを必要とするフィルタは、FRAMにフィルタセットを交換することだけが必要であるが、染料の種類を変更する設定します。最後に、FRAPのみを測定しながら、液滴表面と平坦な界面で単分子層は、このように相互拡散の調査を可能にする、またはB型の単層に型単層をマージすることによって、2つの異なる脂質単層との混合、独立して形成することができるので単分子層の自己拡散。 これらの利点にもかかわらず、フラットな空気 - 水界面上に液滴をマージするプロセスは、潜在的に、このような2単層との間の面圧の不一致などの懸念があるかもしれないいくつかの問題に起因するこの技術では、マージ処理の時間スケールを制限することができます、および液滴をマージした後平らな単分子膜の表面圧の増加。これらの問題は、しかし、次の理由により、大幅に拡散測定には影響を与えません。まず、二つの異なる単層における面圧が非常に異なっていても、平衡化プロセスは、回復プロセスの間、非常に早い段階で終了します。例えば、T彼は、液滴表面に単分子膜の面圧が平坦な空気 - 水界面で単分子層よりも高い、暗い領域は、表面圧平衡になるまで膨張します。このプロセスは、10ミリ秒以内に完了しているので、それはかなり拡散プロセスに影響を与える前に、面圧が平衡化されます。マージ処理の時間スケールが十分に高速であれば第二に、それは全く拡散測定を制限するものではありません。幸いなことに、典型的なマージプロセスは、10ミリ秒以内に完了されます。トラフの表面積は、液滴の表面積よりもはるかに大きいため、最終的に、平坦な界面に液滴の偶数倍マージは、表面圧を増加させません。トラフのサイズおよびプロトコルに記載の液滴によると、分子当たりの面積は、液滴をマージして0.015％未満を増加させます。従って、原因分子当たりの面積の変化に対する面圧の上昇がnegligiblで0.1％未満でありますEウィルヘルミー板張力計によって測定され、それは、面圧で、典型的な誤差よりはるかに小さいからです。 要約すると、我々は平坦な界面上に液滴単層をマージすることにより、リン脂質単層の横方向の拡散特性を測定するための新しい方法を導入しました。この技術は、比較的単純な設備を必要とし、また色素種の各種の使用を可能にします。 FRAMは、流体 - 流体界面でのリン脂質、ブロックコポリマー、タンパク質、さらにはナノ粒子を含む任意の表面活性剤の拡散を測定するためにこのように潜在的に適用可能です。さらに、我々はFRAMは、2つの異なる界面活性剤との間の相互拡散や混合を研究する新しい方法を提供することを期待しています。

<html>リン脂質は細胞膜および細胞小器官の膜の主要成分であり、これらの膜層の流動性は、多くの場合、膜タンパク質1の活性を変化させることによって細胞機能に影響する- 3。例えば、膜&#160;脂質ホメオスタシスは、膜タンパク質によって検出される膜の流動性を調整することによって達成され、流動性の異常なレベルは、脂肪肝及び胆汁うっ滞4などの重篤な疾患を引き起こします。また、エア肺胞流体界面でのリン脂質単分子膜の流動性は、その機能において重要な意味を持ちます。低流動性が呼気5,6の間に肺胞内に収まるように層を可能にする一方、肺サーファクタントリン脂質単層の高い流動性は、吸入の間層の広がりを促進します。これは、それらの役割を理解するために、リン脂質層​​の流動性を推定することが重要です。 _content &quot;&gt;流動性の直接測定は、粘度であり、かつリン脂質層の粘度は、ミクロンサイズのコロイド7、磁性針8,9、および磁性マイクロボタン6,10,11を用いて測定された。しかしながら、これらの技術比較的剛性のフィルムに限定され、かつ粘性の低いフィルムを測定することができない。このような場合、拡散率はリン脂質層​​の流動性を定量化するための代替手段であろう。数十年のために、リン脂質層​​の拡散特性を測定するための様々な技術が開発されていますこのような蛍光消光法12、パルス磁場勾配NMR 13、および蛍光相関分光法（FCS）14として最も代表的な方法の一つは、（FRAP）15,16を光退色後蛍光回復である。これにより、測定手順の単純さと関連しますリン脂質層​​の拡散特性の理論、いくつかの研究では、FRAPを使用して行われてきました<suP&gt; 17から19まで。しかし、FRAPは、通常、高出力レーザーで高価な共焦点顕微鏡のセットアップが必要です。 ここでは、（FRAM）をマージした後蛍光回復と呼ぶリン脂質単層の横方向の拡散を測定するための新しい手法を提示します。 FRAPとFRAMの主な違いは、光退色のステップをドロップ合体により置換されていることです。蛍光標識された平らな単層上に非蛍光単分子膜で覆われた液滴をマージするので、光退色のステップと同じ初期状態を設定し、明るいフラット化単分子膜上に円形の暗い染みを残します。それから、横方向の拡散率を測定するための時間と暗い染色での蛍光回復を観察します。ドロップ合体によるこの新しい「漂白」のステップは、FRAP上で重要な利点を提供します：FRAMは、蛍光顕微鏡ではなく、FRAPに必要な高出力レーザで高価な共焦点顕微鏡を必要とします。私n個の追加、それが光退色過程を伴わないため、FRAMは、蛍光色素の幅広い選択をしています。 FRAPのみが単層の自己拡散を測定しながら、最終的に、二つの異なる単層、液滴単層および平坦化単分子膜は、このように相互拡散を測定することができるように、独立して調製することができます。 FRAMは、高粘性の物質からほぼ非粘性材料に拡散測定の広い範囲を提供します。原則として、FRAMは、拡散がドロップ合体プロセス（〜10ミリ秒）の時間の間に100ミクロンによって領域にわたって100μmで発生した場合、既存の技術に匹敵する10 6μmの2 /秒、最大拡散率を測定することができます。単層が固体でない限り、また、遅い拡散プロセスを容易に測定することができます。 FRAMであれば、適切な蛍光タグ付き分子が利用可能であるような表面活性物質、任意の種類のために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Acetone</td><td>OCI corporation</td><td>Acetone 3.8L Extra Pure</td><td>Purity: &amp;ge; 99.5%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>OCI corporation</td><td>Ethanol 3.8L Extra Pure</td><td>Purity: &amp;ge; 94%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use.</td></tr><tr><td>Dioleoylphosphatidylcholine, DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Chloroform is carcinogenic.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>LiChrosolv</td><td>Chloroform ultrapure (A3633)</td><td>Purity: &amp;ge; 99.8%, Please consult material safety data sheets (MSDS) before use. Carcinogenic</td></tr><tr><td>Rhodamine DPPE</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>810158C, 810158P</td><td>Avoid direct light exposure to prevent photobleaching</td></tr><tr><td>Wilhelmy plate tensiometer</td><td>R&amp;amp;K ultrathin organic film technology</td><td>Wilhelmy tensiometer</td><td>http://www.rieglerkirstein.de/index.htm</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Sutter instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Micro-injector</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Micromanipulator 5171</td><td></td></tr><tr><td>Microscope 1</td><td>Objective lens: Olympus</td><td>Objective lens: UPlanFl 10x</td><td>Objective lens: 10X NA 0.3</td></tr><tr><td>Microscope 2</td><td>Objective lens: Olympus, Tube lens: Thorlabs</td><td>Objective lens: UPlanFl 10x</td><td>Objective lens: 10X NA 0.3, tube lens: focal length 17 cm</td></tr><tr><td>CCD for Microscope 1</td><td>Jai</td><td>CV 950 camera</td><td></td></tr><tr><td>CCD for Microscope 2</td><td>Andor</td><td>iXon3 EMCCD</td><td></td></tr><tr><td>Filter set</td><td>Chroma technology</td><td>Catalog Set 49004: ET545, T565, ET605</td><td>Prepare suitable for dye molecules</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>DAIHAN Scientific</td><td>Wiseclean WUC-D06H</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence recovery after merging a droplet to measure the two-dimensional diffusion of a phospholipid monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

図1に記載されている蛍光画像のシリーズは、フラットDOPC単層上DOPC単層で被覆された小滴を併合した後、リカバリ処理時間で得られた。平らな空気-水界面におけるDOPC単層を少量ドープしましたローダミンDPPE、これは、このようにそれが可能な新たに平坦な界面に追加明るい色と暗い領域と背景を可視化するために作られました。そこでは、回復プロセスは、23 MN /固定面圧のMで観察されました。時間に応じて分数強度の変化に式（1）の適合は、図2に示されている。このフィットのR 2値は0.999であり、このフィットは、依然としてより低いまたはより高い表面圧力でうまく機能します。このフィットから得られたDOPC単層の拡散係数は、表面圧は23mN / mで27.54ミクロン2 /秒でした。 FRAMのさらなる検証、DOの拡散係数についてPC及びジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC）の単層は、表面圧に従って測定しました。 LE（液体が膨張）相転移が10を発生し、値- 図3に示すように 、FRAMは、LC（液体凝縮）面圧の〜9 MN / mにおけるDPPC単層の拡散係数の急激な低下を捕捉拡散係数はまた、ピーターズらによって以前に測定値とよく一致している。19。また、面圧で拡散係数の指数関数的減衰は、DOPC単層で観察されたが、この傾向はカルーソら 12により測定したものとほぼ同じです。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig1.jpg" /> 図1（A）FRAMの模式図（マージした後蛍光回復）技術。リップとしてIDの単層コーティングされた液滴が平らな空気 - 水界面にマージされ、蛍光のない脂質単層は、脂質は、フラット蛍光脂質単層内に挿入されるタグを付けました。表面圧は23mN / mで（スケールバー= 100ミクロン）でDOPC単層の回復プロセス中の時間と（B）の蛍光顕微鏡画像。 DOPC単層の暗い領域は完全に数分以内に、拡散プロセスによって回収される。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53376/53376fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig2.jpg" /> 時間対2フラクショナル強度図 。黒丸とグレーの点線は、時間の経過とともに、分別強度に画像解析（手順4.1および4.2）と式1のフィットから得られた端数強度の値を示しますそれぞれ、手順4.3に示す。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53376/53376fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/53376/53376fig3.jpg" /> DOPC（三角形）とDPPC（空の角）面圧の関数として単層の図3.拡散係数。明るいグレー色のダークグレー色のラインが以前ピーターズらによって報告された拡散係数の値を示しています。そして、カルーソら 、それぞれ。この図は、チョンら 23から変更されています。チョンらラングミュア 。30（48）、14369から14374の許可を得て転載。著作権2014年米国化学会。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53376/53376fig3large.jpg" target="_blank">彼女をクリックしてください</a>この図の拡大版を表示するには、E。

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Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

8.0K ビュー.  KAIST. We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

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Fluorescence detection methods for microfluidic droplet platforms

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that accompany system miniaturisation. Advantages include the ability to efficiently process nano- to femoto- liter volumes of sample, facile integration of functional components, an intrinsic predisposition towards large-scale multiplexing, enhanced analytical throughput, improved control and reduced instrumental footprints.1
In recent years much interest has focussed on the development of droplet-based (or segmented flow) microfluidic systems and their potential as platforms in high-throughput experimentation.2-4 Here water-in-oil emulsions are made to spontaneously form in microfluidic channels as a result of capillary instabilities between the two immiscible phases. Importantly, microdroplets of precisely defined volumes and compositions can be generated at frequencies of several kHz. Furthermore, by encapsulating reagents of interest within isolated compartments separated by a continuous immiscible phase, both sample cross-talk and dispersion (diffusion- and Taylor-based) can be eliminated, which leads to minimal cross-contamination and the ability to time analytical processes with great accuracy. Additionally, since there is no contact between the contents of the droplets and the channel walls (which are wetted by the continuous phase) absorption and loss of reagents on the channel walls is prevented.
Once droplets of this kind have been generated and processed, it is necessary to extract the required analytical information. In this respect the detection method of choice should be rapid, provide high-sensitivity and low limits of detection, be applicable to a range of molecular species, be non-destructive and be able to be integrated with microfluidic devices in a facile manner. To address this need we have developed a suite of experimental tools and protocols that enable the extraction of large amounts of photophysical information from small-volume environments, and are applicable to the analysis of a wide range of physical, chemical and biological parameters. Herein two examples of these methods are presented and applied to the detection of single cells and the mapping of mixing processes inside picoliter-volume droplets. We report the entire experimental process including microfluidic chip fabrication, the optical setup and the process of droplet generation and detection.

Droplet-based microfluidic platforms are promising candidates for high throughput experimentation since they are able to generate picoliter, self-compartmentalized vessels inexpensively at kHz rates. Through integration with fast, sensitive and high resolution fluorescence spectroscopic methods, the large amounts of information generated within these systems can be efficiently extracted, harnessed and utilized.

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

The development of microfluidic platforms for performing chemistry and biology has in large part been driven by a range of potential benefits that ...

生物工学

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring cells. Of interest, only few assays are capable of specifically probing such interactions directly in living cells. Here, we present an assay to measure the binding of proteins expressed at the surfaces of neighboring cells, at cell-cell contacts. This assay consists of two steps: mixing of cells expressing the proteins of interest fused to different fluorescent proteins, followed by fluorescence fluctuation spectroscopy measurements at cell-cell contacts using a confocal laser scanning microscope. We demonstrate the feasibility of this assay in a biologically relevant context by measuring the interactions of the amyloid precursor-like protein 1 (APLP1) across cell-cell junctions. We provide detailed protocols on the data acquisition using fluorescence-based techniques (scanning fluorescence cross-correlation spectroscopy, cross-correlation number and brightness analysis) and the required instrument calibrations. Further, we discuss critical steps in the data analysis and how to identify and correct external, spurious signal variations, such as those due to photobleaching or cell movement.
In general, the presented assay is applicable to any homo- or heterotypic protein-protein interaction at cell-cell contacts, between cells of the same or different types and can be implemented on a commercial confocal laser scanning microscope. An important requirement is the stability of the system, which needs to be sufficient to probe diffusive dynamics of the proteins of interest over several minutes.

This protocol describes a fluorescence fluctuation spectroscopy-based approach to investigate interactions among proteins mediating cell-cell interactions, i.e. proteins localized in cell junctions, directly in living cells. We provide detailed guidelines on instrument calibration, data acquisition and analysis, including corrections to possible artefact sources.

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

生化学

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Fluorescence-Based Measurements of Phosphatidylserine/Phosphatidylinositol 4-Phosphate Exchange Between Membranes

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found to represent a novel lipid transfer protein (LTP) group in yeast and human cells. They transfer phosphatidylserine (PS) from the endoplasmic reticulum (ER) to the plasma membrane (PM) via PS/phosphatidylinositol 4-phosphate (PI(4)P) exchange cycles. This finding allows a better understanding of how PS, which is critical for signaling processes, is distributed throughout the cell and the investigation of the link between this process and phosphoinositide (PIP) metabolism. The development of new fluorescence-based protocols has been instrumental in the discovery and characterization of this new cellular mechanism in vitro at the molecular level. This paper describes the production and the use of two fluorescently labelled lipid sensors, NBD-C2Lact and NBD-PHFAPP, to measure the ability of a protein to extract PS or PI(4)P and to transfer these lipids between artificial membranes. First, the protocol describes how to produce, label, and obtain high-purity samples of these two constructs. Secondly, this paper explains how to use these sensors with a fluorescence microplate reader to determine whether a protein can extract PS or PI(4)P from liposomes, using Osh6p as a case study. Finally, this protocol shows how to accurately measure the kinetics of PS/PI(4)P exchange between liposomes of defined lipid composition and to determine lipid transfer rates by fluorescence resonance energy transfer (FRET) using a standard fluorometer.

Here, we describe protocols using fluorescent lipid sensors and liposomes to determine whether a protein extracts and transports phosphatidylserine or phosphatidylinositol 4-phosphate in vitro.

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

Several members of the evolutionarily conserved oxysterol-binding protein (OSBP)-related proteins(ORP)/OSBP homologs (Osh) family have recently been found ...

Measuring Diffusion Coefficients via Two-photon Fluorescence Recovery After Photobleaching

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) of macromolecules, and can be applied to both in vitro and in vivo biological systems. Multi-fluorescence recovery after photobleaching is performed by photobleaching a region of interest within a fluorescent sample using an intense laser flash, then attenuating the beam and monitoring the fluorescence as still-fluorescent molecules from outside the region of interest diffuse in to replace the photobleached molecules. We will begin our demonstration by aligning the laser beam through the Pockels Cell (laser modulator) and along the optical path through the laser scan box and objective lens to the sample. For simplicity, we will use a sample of aqueous fluorescent dye. We will then determine the proper experimental parameters for our sample including, monitor and bleaching powers, bleach duration, bin widths (for photon counting), and fluorescence recovery time. Next, we will describe the procedure for taking recovery curves, a process that can be largely automated via LabVIEW (National Instruments, Austin, TX) for enhanced throughput. Finally, the diffusion coefficient is determined by fitting the recovery data to the appropriate mathematical model using a least-squares fitting algorithm, readily programmable using software such as MATLAB (The Mathworks, Natick, MA).

In this article we will describe the procedure for measuring diffusion coefficients using multi-photon fluorescence recovery after photobleaching. We will begin by aligning the laser along the optical path to the sample and determining the proper experimental parameters, then continue generating and finally fitting fluorescence recovery curves.

光退色後二光子蛍光回復を経由して拡散係数の測定

Multi-fluorescence recovery after photobleaching is a microscopy technique used to measure the diffusion coefficient (or analogous transport parameters) ...

生物学

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific lipid component within a membrane, as in the case of phosphoinositides (PIPs), to ensure specific subcellular localization and/or activation. PIPs and cellular PIP-binding domains have been studied extensively to better understand their role in cellular physiology. We applied a pH modulation assay on supported lipid bilayers (SLBs) as a tool to study protein-PIP interactions. In these studies, pH sensitive ortho-Sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine is used to detect protein-PIP interactions. Upon binding of a protein to a PIP-containing membrane surface, the interfacial potential is modulated (i.e. change in local pH), shifting the protonation state of the probe. A case study of the successful usage of the pH modulation assay is presented by using phospholipase C delta1 Pleckstrin Homology (PLC-&#948;1 PH) domain and phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PI(4,5)P2) interaction as an example. The apparent dissociation constant (Kd,app) for this interaction was 0.39 &#177; 0.05 &#181;M, similar to Kd,app values obtained by others. As previously observed, the PLC-&#948;1 PH domain is PI(4,5)P2 specific, shows weaker binding towards phosphatidylinositol 4-phosphate, and no binding to pure phosphatidylcholine SLBs. The PIP-on-a-chip assay is advantageous over traditional PIP-binding assays, including but not limited to low sample volume and no ligand/receptor labeling requirements, the ability to test high- and low-affinity membrane interactions with both small and large molecules, and improved signal to noise ratio. Accordingly, the usage of the PIP-on-a-chip approach will facilitate the elucidation of mechanisms of a wide range of membrane interactions. Furthermore, this method could potentially be used in identifying therapeutics that modulate protein&#39;s capacity to interact with membranes.

Here we present a supported lipid bilayer in the context of a microfluidic platform to study protein-phosphoinositide interactions using a label-free method based on pH modulation.

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial and temporal resolution. FCS can quantify the molecular concentration and diffusion coefficient of fluorescently labeled molecules in the cell membrane. This technique has the ability to explore the molecular diffusion characteristics of molecules in the plasma membrane of immune cells in steady state (i.e., without processes affecting the result during the actual measurement time). FCS is suitable for studying the diffusion of proteins that are expressed at levels typical for most endogenous proteins. Here, a straightforward and robust method to determine the diffusion rate of cell membrane proteins on primary lymphocytes is demonstrated. An effective way to perform measurements on antibody-stained live cells and commonly occurring observations after acquisition are described. The recent advancements in the development of photo-stable fluorescent dyes can be utilized by conjugating the antibodies of interest to appropriate dyes that do not bleach extensively during the measurements. Additionally, this allows for the detection of slowly diffusing entities, which is a common feature of proteins expressed in cell membranes. The analysis procedure to extract molecular concentration and diffusion parameters from the generated autocorrelation curves is highlighted. In summary, a basic protocol for FCS measurements is provided; it can be followed by immunologists with an understanding of confocal microscopy but with no other previous experience of techniques for measuring dynamic parameters, such as molecular diffusion rates.

A method to measure protein diffusion in membranes of primary immune cells using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is described. In this paper, the use of antibodies for fluorescent labeling is illustrated.

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

Fluorescence correlation spectroscopy (FCS) is a powerful technique for studying the diffusion of molecules within biological membranes with high spatial ...

免疫・感染学

SNARE-mediated Fusion of Single Proteoliposomes with Tethered Supported Bilayers in a Microfluidic Flow Cell Monitored by Polarized TIRF Microscopy

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. During neurotransmitter or hormone release via exocytosis, the fusion pore can transiently open and close repeatedly, regulating cargo release kinetics. Pore dynamics also determine the mode of vesicle recycling; irreversible resealing results in transient, &#34;kiss-and-run&#34; fusion, whereas dilation leads to full fusion. To better understand what factors govern pore dynamics, we developed an assay to monitor membrane fusion using polarized total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution in a biochemically well-defined in vitro system. Fusion of fluorescently labeled small unilamellar vesicles containing v-SNARE proteins (v-SUVs) with a planar bilayer bearing t-SNAREs, supported on a soft polymer cushion (t-SBL, t-supported bilayer), is monitored. The assay uses microfluidic flow channels that ensure minimal sample consumption while supplying a constant density of SUVs. Exploiting the rapid signal enhancement upon transfer of lipid labels from the SUV to the SBL during fusion, kinetics of lipid dye transfer is monitored. The sensitivity of TIRF microscopy allows tracking single fluorescent lipid labels, from which lipid diffusivity and SUV size can be deduced for every fusion event. Lipid dye release times can be much longer than expected for unimpeded passage through permanently open pores. Using a model that assumes retardation of lipid release is due to pore flickering, a pore &#34;openness&#34;, the fraction of time the pore remains open during fusion, can be estimated. A soluble marker can be encapsulated in the SUVs for simultaneous monitoring of lipid and soluble cargo release. Such measurements indicate some pores may reseal after losing a fraction of the soluble cargo.

Here, we present a protocol to detect single, SNARE-mediated fusion events between liposomes and supported bilayers in microfluidic channels using polarized TIRFM, with single molecule sensitivity and ~15 msec time resolution. Lipid and soluble cargo release can be detected simultaneously. Liposome size, lipid diffusivity, and fusion pore properties are measured.

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

In the ubiquitous process of membrane fusion the opening of a fusion pore establishes the first connection between two formerly separate compartments. ...

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

要約

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この動画の章

マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

光退色後二光子蛍光回復を経由して拡散係数の測定

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層を持つシングルプロテオリポソームのSNARE媒介性の融合

リン脂質単層の二次元拡散を測定するためにドロップレットをマージした後蛍光回復

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マイクロ流体液滴のプラットフォームのための蛍光検出法

細胞間の接触でタンパク質間相互作用の分析計蛍光の変動

商業顕微鏡でのライブ細胞膜上の分子拡散法への高速蛍光イメージングから

ホスファチジルセリン/ホスファチジルイノシトール4-膜間のリン酸交換の蛍光ベースの測定

光退色後二光子蛍光回復を経由して拡散係数の測定

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

高分子密集脂質膜上での1分子拡散と集合

PIP-on-a-chip：タンパク質 - ホスホイノシチド相互作用のラベルフリー研究

蛍光相関分光法により測定初代リンパ球のプラズマ膜における分子拡散

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層​​を持つシングルプロテオリポソー​​ムのSNARE媒介性の融合

偏光TIRF顕微鏡によって監視マイクロ流体フローセル内のテザー支持された二分子層を持つシングルプロテオリポソームのSNARE媒介性の融合