この作品は、NSERCの助成金によってサポートされていました 386634.私たちは有用な議論のためにScreatonラボのメンバーに感謝したいと思います。

試薬、プレート、および細胞の作製<ol><li> 25mMトリスpH7.5で、150mMのNaCl、50mMのNaFを、0.5mMのEDTA pH8.0の、0.5％トリトンX-100、5mMのβグリセロリン酸、5％グリセロール：500 mlの溶解バッファー行います。 4℃で保存します。使用1mMジチオスレイトール（DTT）、1mMのフェニルメチルスルホニルフルオリド（PMSF）及び1mMのバナジン酸ナトリウムを添加する直前。このステップの後、PMSFは、任意のすすぎバッファに必要とされません。 </li><li> 200 mMトリスpH7.5の、50mMのベータ - グリセロホスフェート（FW 216）、2mMのバナジン酸ナトリウム：10倍キナーゼ緩衝液20mlのを行います。 -20℃で1 mlチューブで分注し、店舗。使用直前に、5mMのDTTを追加します。 </li><li> 300μMのアデノシン三リン酸（ATP）、66mMのMgCl 2を、-20℃で33 mMでのMnCl 2.1 mlチューブで小分けして保存：10倍、M-ATPバッファの20ミリリットルを行います。 </li><li> 1.5グラムのトリス塩基、20 mlのグリセロール、30mLのH 2 O：2Xドデシル硫酸ナトリウム（SDS）の溶解緩衝液100mlを作ります溶解し、HClでpHを6.8に調整します。 40を追加mlの10％SDS、100ミリリットルにボリュームを調整します。 25 mgのブロモフェノールブルーを追加します。 </li><li>スポット応じて96ウェルプレートとラベルプレートのセットで、ウェルあたりのGST-キナーゼ14をコードする 25 ngの/μlの哺乳動物発現プラスミドの4μlの。使用するまで-20℃でプレートを密封し、凍結。 </li><li>トランスフェクションの2日前に、CO 2（最終5％）を補充した37℃のインキュベーター内で培養HEK293Tの完全ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）+ 10％ウシ胎児血清（FBS）中の細胞及び抗生物質。そしてトリプシンで通過は在庫が拡張中に、&gt; 80％コンフルエントになることはできません。 6×10 7細胞の最小画面（80％コンフルエンスでHEK293T細胞の約3×15cmの皿）に必要とされます。 </li></ol> 2.トランスフェクション注意：プロトコル全体のフローチャートについては、図1を参照してください 。 <ol><li>キナーゼプラスミドを含むプレートは、凍結されている場合は、室温aの解凍NDウェルの底に任意の水分を収集するために、3分間1900×gで遠心します。 </li><li>脂質ベースのトランスフェクション試薬の312.7μlの低血清培地（例えば、OPTI-MEM）の8.6ミリリットルを混ぜます。 5分間座ってみましょう。 </li><li>小容量のカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて各ウェルに減少血清培地10μlのを追加します。 </li><li>小容量のカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて、ステップ2.2から減少血清培地/トランスフェクション試薬混合物のウェルあたり10μLを追加します。 20〜45分間座ってみましょう。 </li><li>完全DMEM 80mlに7.5×10 5細胞/ mlで再懸濁した293T細胞。よく標準ボリュームカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いあたり100μlの細胞懸濁液（ すなわち 7.5×10 4細胞）を追加します。 </li><li>均一な細胞分布のために顕微鏡下で井戸を確認し、24時間インキュベーターに戻します。 </li></ol> 3. GST-キナーゼプルダウン<ol><li> Fを作りますレッシュ：H 2 Oの540μlの0.2 Mバナジン酸ナトリウムの60μLを混合することにより、4 mMのペルバナデートソリューション第2のチューブミックス30％の過酸化物の2.7マイクロリットルのPBS 1.4ミリリットルで。 2つのソリューションを追加し、使用前に15分間放置します。 </li><li>マルチチャンネルピ ​​ペットを使用して（それもであまりにも多くの乱流を生成するように自動液体ディスペンサーを使用しないでください）ステップ3.1で調製した過バナジン酸の2.5μlのに続いて、各ウェルに0.25 M CaCl 2を2μLを分注します。 37℃で10分間各プレートをインキュベートした後、氷の上に置きます。 </li><li>第1（試薬の調製）に示すようにDTT、PMSFおよびバナジン酸ナトリウムを添加することによって溶解緩衝液の35ミリリットルを準備します。 </li><li>氷の上でプレートを維持、真空吸引器を使用して、各ウェルから培地を除去します。すぐに標準カセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて氷冷溶解緩衝液50μl/ウェルを追加します。オプション（溶解し、氷上で30分間座ってみましょう：必要に応じてPLATをシールすることによってここに停止することができますE、-80℃で保存します。氷の上で、解凍プレート）を続行します。 </li><li> 4℃で3分間、1,900×gでスピンプレート。 </li><li>各ウェルマルチチャンネルピペットを使用してから細胞をこすり落とし、すべての内容を転送は、適切にV底96ウェルプレートをラベル付けします。 4℃で10分間、1900×gでスピンプレート。 </li><li>スピン中、リンスとして（PMSFなし）の氷冷溶解緩衝液100μl/ウェルでグルタチオン被覆したプレート（各96ウェルプレートに1つずつ）を入力します。氷の上でプレートを保管してください。 </li><li>遠心機からのV底プレートを取り外します。当時の一つは、ペーパータオルの溶解バッファーとブロットを振るために、シンクの上にグルタチオンプレートを反転。底にペレットを乱さないように注意しながら、プレートを傾けると、マルチチャンネルピペットを用いて、グルタチオンプレートにV底プレートから溶解バッファーを転送します。プレートをカバーして結合するための最小2時間、氷上に残します。 </li><li> 2時間結合ステップの終わりに近く、トンを確保し、放射能のワークステーションを準備します彼に必要な安全上の注意事項は、放射性の仕事のための場所です。 30℃のハイブリダイゼーションオーブンを設定します。 </li><li> 1. PMSFこの段階で必要とされていないセクションに示すようにDTTおよびナトリウムバナジン酸を加えることによって、溶解緩衝液200ミリリットルを準備します。 </li><li>溶解バッファーを振る、ペーパータオルにブロットするシンクの上にグルタチオンプレートを反転します。ウェルは（PMSFなし）、100μlの溶解緩衝液で3倍すすいでください。井戸が乾燥座らせてはいけない - 続行する準備ができるまで、すすぎに保管してください。 </li><li> 10倍の株式を希釈し、標準ボリュームのカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて1×KB50μlの1リンスプレート一度節に示すようにDTTを追加することによって、1×キナーゼ緩衝液（KB）の55ミリリットルを準備します。溶液Aの準備ができるまでのウェルで1倍KBを残します： <ol><li> 15.9ミリリットルまで530関心の基板μgの、ミエリン塩基性タンパク質の500μgの（MBP）、10倍の2.65ミリリットルKB、1 M DTTの13.25μL、 および H 2 Oに500を追加することによって、溶液Aを準備します。 </li></ol></LI&gt; <li>一度に1つは、1×KBリンスを除去ペーパータオルにブロットし、すぐに小容量のカセットを装着した自動液体ディスペンサーを用いて溶液Aの30μlを添加するシンクの上にプレートを反転。氷の上でプレートを保管してください。 </li><li> 2.5ミリリットルの10倍のM-ATP、500μCiのガンマ- 32 PのATP、 および H 2 Oに10ミリリットルを追加することによって、放射能作業領域に溶液Bを準備します。 <ol><li>よく吐出力による混合に役立つリピーターピペットを用いあたり溶液Bの20μLを加えます。覆い、30分間30℃のハイブリダイゼーションオーブンでインキュベート。 </li></ol></li><li> 30分後、氷にバックプレートを転送します。各ウェルマルチチャンネルピペットを使用して2倍のSDS溶解緩衝液50μlを追加します。次のステップにこの時点で進行、または便利になるまで-20℃でアルミホイルや店舗でプレートをシールすることができます。 </li></ol> 4.ランニング、染色、乾燥ゲル注：すべての作業は、エリアdesignaで実行する必要があります放射能のためのテッド。 <ol><li>ハイブリダイゼーションオーブンをオンにして、85℃に設定してください。室温で解凍プレート。一度オーブンオーブンで10分間サンプルを変性するためにインキュベートした温度、転写板に到達しました。 </li><li>ロード一度に複数の井戸を埋めるためにマルチチャンネルピペットを用いて、各反応15μlの26ウェルのプレキャストゲル。ケアは、すべてのヒントは、サンプルを追加する前に十分に対応して整列するように注意しなければなりません。これが組み込まれていないATPが含まれているとして、追跡用色素（青線）は、ゲルの底部から実行させてはいけない150 Vでゲルを実行します。 </li><li>ゲルを解体して、フィルムを露出オーバーになりますようにメスまたはストレートエッジを使用して、取り込まれていないATP（青線）を遮断します。ラベル付き容器にゲルを置き、15分間のクマシー染色でカバーしています。 </li><li>簡単に、クマシー染色を取り除くには、水でゲルを洗浄し、溶液を脱色追加。タンパク質がはっきりと見えるようになるまで、ゲルを脱色。 MBPのためのバンドと基板用バンドべき各サンプルの見えること。 </li><li>ゲルを乾燥させるには： <ol><li>ろ紙の大きなシートをカットし、乾燥機の上に置きます。 </li><li>それは滑らかで、しわがなくなるまで蒸留水にセロファンシートを湿らせて、紙の上に置きます。 </li><li>ゲルのためのノートを作り、セロハンシートの上にゲルを置きます。二セロファンシートを湿らせ、ゲルの上に置きます。 </li><li>素敵な均一な表面のためのすべてのバブルを（プレートシールローラは、この適しています）ロールアウト。 、フラップを閉じ、真空をオンにし、80℃で3時間、ゲルを乾燥させます。 </li></ol></li><li>ゲルが乾燥したら、信号を強化するには、画面を使用してXARフィルムにそれらを公開します。サランラップやビニール袋でカセットをラップし、霜を保つためにテープで密封します。 -80℃で一晩カセットを保管してください。 </li></ol> 5. XARフィルムを開発<ol><li>次の日、冷凍庫からカセットを除去し、室温で解凍してみましょう。フィルムを開発製造業者の指示に従ってフィルムプロセッサを用いて暗室。 注：キナーゼ基質のペアの証拠のためのフィルムを調べます。より長い第2の露光はまた、より弱いリン酸化事象を検出するのに有用であり得ます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphopeptide+mapping+and+identification+of+phosphorylation+sites.">Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).</li><li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications.">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS chem. 10, 63-71 (2015).</li><li>Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultradeep+human+phosphoproteome+reveals+a+distinct+regulatory+nature+of+Tyr+and+Ser/Thr-based+signaling.">Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling.</a> Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).</li><li>Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , (2006).</li><li>Boersema, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+qualitative+and+quantitative+profiling+of+tyrosine+phosphorylation+using+a+combination+of+phosphopeptide+immunoaffinity+purification+and+stable+isotope+dimethyl+labeling.">In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).</li><li>Hutti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+protein+kinase+phosphorylation+specificity.">A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity.</a> Nat Methods. 1, 27-29 (2004).</li><li>Johnson, S. A., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinomics:+methods+for+deciphering+the+kinome.">Kinomics: methods for deciphering the kinome.</a> Nat Methods. 2, 17-25 (2005).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+regulatory+systems+through+protein+interaction+domains.">Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains.</a> Science. 300, 445-452 (2003).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+yeast+protein+kinases+using+protein+chips.">Analysis of yeast protein kinases using protein chips.</a> Nat Genet. 26, 283-289 (2000).</li><li>Shah, K., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+approach+for+the+identification+of+direct+substrates+of+protein+kinases.">A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases.</a> Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).</li><li>Zou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKIS:+computational+identification+of+protein+kinases+for+experimentally+discovered+protein+phosphorylation+sites.">PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites.</a> BMC bioinform. 14, 247 (2013).</li><li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+active+and+kinase-deficient+kinome+collection+for+identification+of+kinases+regulating+hedgehog+signaling.">Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling.</a> Cell. 133, 537-548 (2008).</li><li>Jansson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+controls+CREB+activity+in+islet+cells+via+regulated+phosphorylation+of+TORC2.">Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).</li><li>Fu, A., Screaton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+kinomics+to+delineate+signaling+pathways:+control+of+CRTC2/TORC2+by+the+AMPK+family.">Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family.</a> Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).</li><li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion.">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome.">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

アプローチ14,15を記述する元の出版以来、180 GST-キナーゼの元のライブラリは、ヒトタンパク質キノームの420のメンバー、または〜80％ ​​にまで拡大されました。拡大ライブラリを使用すると、説明したようにプロトコルは、ホスホおよびデジタル信号増強を使用することによって短縮することができた、（必要と認めた場合）フィルムを開発するために4〜5日、その後1-4日かかります。注意しなければならないいくつかの重要なステップは、（プロトコルの概要について、図1を参照してください ）があります。まず、トランスフェクションの時点でバッチ拡張段階、96ウェルプレート中で（マイコプラズマフリー、拡張中にコンフルエントに到達させず、各継代でのトリプシン処理決して）細胞のストックの健康です。トランスフェクションが行われ（ステップ1.5）を取るとき、細胞を均一に播種すると、80％のコンフルエントにする必要があります。 第二に、ボリュームTRANSFを最小にするために、自動化液体ディスペンサを使用するトランスフェクション時に理想的ですERエラーは、このように、ウェル間の変動係数（「CVを &quot;）制限します。小さなボリュームの場合、精度を分配減少デッドボリュームと増加に起因する小容量カセット制限試薬損失でディスペンサーを当てはめます。過バナジン酸ナトリウム、パンチロシンホスファターゼ阻害剤を用いた治療工程は、標的キナーゼのリン酸化状態を増加させるために、一般的な刺激として使用されます。この段階でのカルシウムの含有は、長引くペルバナデート治療によって誘発される丸めに細胞の損失を防ぐ、細胞 - マトリックス接着を向上させます。このステップは、10分間のインキュベーション時間を厳守して行われるべきです。 すべてを使用することができる120 kDaのと同じ大きさのペプチド、タンパク質ドメイン、またはインタクトなタンパク質：第三に、キナーゼアッセイ自身のために、いくつかの組換え基質を選択する考慮事項があります。特定のリン酸化部位が知られている場合、ペプチド基質は、最も直接的なアプローチであるが、検出するのに十分大きいことが必要ですSDS-PAGEゲル上で。したがって、ペプチド基質は&gt; 25のMWを与える細菌からGSTに融合させ、精製することができます。より大きなタンパク質は、それらがおそらく折り畳まれ、それらが細胞にあるであろうとしてのリン酸化残基を露出、まだ彼らはリン酸化されることができ、追加の残基を含む、アッセイの信号を与えるという欠点が付属しているという利点があります。これは、両方の画面から候補キナーゼの検証をレンダリングするように私達の好みは、 インビボでリン酸化されることが知られており、生物学的事象を調節することが知られている残基を囲む15-20個のアミノ酸からなるペプチド基質を使用して画面を実行することですin vitroおよびin vivoではるかに高速です。 最後に、理想的には、タンパク質のアプローチの量や、ウェル当たり1μgのを超えています。もちろん、これは、基板のMWによって変化します。ウェル当たり少ないタンパク質は、意味のあるヒットを得ることができるが、それは信号を増大させるよう、ルールが適用される」よりは優れている &#39;：NOISE。勾配ゲルが乾燥時にあまりにも頻繁に割れている標準は、非勾配ゲルを推奨します。ゲルを乾燥させた後、ガイガーカウンターとバックグラウンドを超える放射性シグナルの検出は、アッセイの成功の優れた指標を与えます。 画面がインビトロであると複雑さの追加レベルが in vivoで存在するように、所定の基板の候補キナーゼ（複数可）は、細胞内で検証する必要があります。具体的には、画面はまだ、同じ細胞型において、または基板と同じ細胞内区画において発現されない、 インビトロで基質をリン酸化する生化学的能力を有している家族を識別することができます。 MARK2とMARK3はSer275にCRTC2をリン酸化することができキナーゼの画面の両方でヒットした一方で、例えば、唯一のMARK2はセル 14内の基板との複合体を形成しました。候補キナーゼの生理学的な関連性を確認するために使用することができる追加の一連の実験は以下のとおり。ファーSTは、候補キナーゼの同時発現以下のSDS-PAGE上の基板の移動度シフトは、確認コントロールとして使用することができます。適切なコントロールは、触媒的に不活性なキナーゼのような同時トランスフェクションは、特異性を確認することができます。第二に、基板は、野生型ではなく、触媒的に不活性キナーゼの存在下での基質へのリン酸の取り込みを確認するために、32 P-オルトリン酸と共にインキュベートされた細胞抽出物から免疫沈降させることができます。第三に、リン酸特異的抗体は、（既知の場合）ホスホ配列に対して生成され、キナーゼが過剰発現されたときに基質リン酸化の増加を確認することができます。標的部位で非リン酸化残基を担持する変異体基板を用いた二次スクリーニングは、事前phosphoantibodyの発生に大きなドメインおよび完全長タンパク質基質に特に重要な制御の特異性を確認することができます。キャンディを阻害する薬理学的阻害アプローチ日付キナーゼを用いることも可能で、まだ関連するキナーゼの阻害が過小評価現実であるよう注意が必要。最後に、細胞中の候補キナーゼ（単数または複数）のRNAi媒介性サイレンシングが続き、リン酸特異的抗体を用いて標的部位のリン酸化の減少をモニターするウェスタンブロッティングを行うことができます。

タンパク質の翻訳後修飾（PTMを）は、細胞内の通信のために不可欠です。おそらく全てのPTMの検討最高の細胞内局在性、コンフォメーション、安定性、それらの生化学的活性を含むタンパク質の機能の無数を調節するタンパク質キナーゼによって触媒されるリン酸化は、です。標的タンパク質上のリン酸化部位の同定は、トリプシンリンペプチドマッピングにより、またはリン酸化ペプチド1,2-について富化サンプルを使用して、今、標準プロテオミクス技術によって達成することができます。表現プロテオームの四分の三が3リン酸化されることが予想され、100万6までの推計で20万リン酸化部位5を特定しているが、これらの多くは、経路、またはプロテインキナーゼシグナル伝達、全く割り当てられた生物学を持っていません。 リン酸化部位の同定は比較的簡単ですが、比較的大きな挑戦はにあります基板のペア：これらのサイトを対象と同族キナーゼ（複数可）、我々はマッピングキナーゼと呼ぶプロセスが識別されます。いくつかのキナーゼを同定するための方法：基板対は、目的のキナーゼで開始し、その基質を探しまたは対象の基板から始まると修飾キナーゼ実験7-11または計算12を検索しようとするいずれかの記載されています。既知のリン酸化基質のためのキナーゼを同定するために、バイオインフォマティクスは、基板と沈殿複合体を形成するキナーゼをリン酸化残基（コンセンサス部位）に隣接する、ならびに特定のアミノ酸の短い保存配列を含むタンパク質を同定するために使用することができます。しかしながら、これらの方法は時間がかかり、多くの場合、成功して満たしていません。 私たちは、急速に所定の基板13をリン酸化することができるキナーゼを同定するための体系的な機能的なアプローチを開発しました。スクリーンアッセイは、優れた特定の生成します潜在的な同族のキナーゼのために非常に明確な選択と性、。生物学的シグナル伝達にリン酸化の中心性を考えると、画面は、事実上すべての細胞シグナル伝達経路14-16で発見するのに便利です。画面には、ヒトタンパ​​ク質キナーゼのライブラリーと、大規模なキナーゼアッセイを実施することを含みます。キナーゼは、細菌のグルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）タンパク質でタグ付けされており、組換え酵素があることを意味する、哺乳類細胞抽出物から精製される - 細菌から調製されたものとは異なり、 - 多くの場合に必要な上流のプロテインキナーゼの存在下で生成されます組換え酵素は、インビトロで活性を有すること。セリン、スレオニン、およびチロシンキナーゼ活性は、下流のキナーゼの活性化のために必要としながら実際には、酵母10内に存在する、酵母ゲノムは、500を超える遺伝子17と哺乳類キノームは、するために、かなり複雑になっていることを示す、122プロテインキナーゼをコードしレギュレーションより高次の生物に固有のプロセスをTE。さらに、（例えば、 その他の小分子、増殖因子、ホルモンなど）、細胞生物学およびヒトの疾患に関連した様々な刺激の効果は、適切なコンテキストに14,15モジュレートキナーゼ活性のために使用することができます。

<table><tbody><tr><td>Lysis buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.1</td></tr><tr><td>10x kinase buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.3</td></tr><tr><td>Human kinase plasmids</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST-tagged in house</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>supplement with 100&amp;nbsp;U/ml penicillin, 100&amp;nbsp;&amp;#956;g/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm cell culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipid-based transfection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Standard cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM pervanadate</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (20-200 &amp;#956;l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (1-10 &amp;#956;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 6-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione coated 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST tagged substrate</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myelin Basic Protein (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Repeater pipette (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS lysis buffer (100&amp;nbsp;ml)</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.4</td></tr><tr><td>26-well precast TGX gels</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest</td></tr><tr><td>Coomassie stain</td><td>Made in house</td><td></td><td>0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Made in house</td><td></td><td>10% acetic acid, 20% methanol</td></tr><tr><td>Labeled gel containers</td><td>Made in house</td><td></td><td>Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel</td></tr><tr><td>Whatman filter paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Cellophane sheets (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Gel dryer</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Double emulsion autoradiography film</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Film cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Intensifying screen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealing rubber roller</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinase-substrate pairs using high throughput screening

我々は、新規のシグナル伝達経路を解明するために使用することができ、リン酸化基質のための専用のヒトプロテインキナーゼを同定するためのスクリーニングプラットフォームを開発しました。我々のアプローチは、精製GSTタグ付きヒトプロテインキナーゼのライブラリーを使用すると、目的の組換えタンパク質基質を備えています。私たちは、CREB-規制転写コアクチベーター2（CRTC2）のグルコース調節サイトのキナーゼとしてのMAP /微小管親和性調節キナーゼ2（MARK2）を識別するために、β細胞の増殖に必要なタンパク質、ならびにこの技術を使用していますアダプタータンパク質ELMOのリン酸化による細胞の転移の調節因子としてのチロシンキナーゼのAXLファミリー。私たちはこの技術を記述し、それは、細胞が環境刺激に応答する方法の包括的なマップを確立するのを助けることができる方法について説明します。

画面の代表的な結果を図2に示す 。180は、CRTC2キナーゼならびに古典的なキナーゼアッセイ基質ミエリン塩基性タンパク質（MBP）のアミノ酸268から283に対応するGSTタグ化ペプチド基質を用いてスクリーニングしました。唯一の2つのキナーゼ、MARK2および高度に関連するキナーゼMARK3は、CRTC2ペプチドをリン酸化しました。それは多くのリン酸化残基を含有し、ゲルの底に向かっ、18 kDaので動作するようMBPは、全てのアッセイで内部コントロールとして含まれています。これは特異性の解釈を可能にする：いくつかのキナーゼは、堅牢基板およびMBPをリン酸化します。ここで注目すべきは、このように常にアッセイにおけるバックグラウンドのリン酸化があり、（無キナーゼコントロールすなわち ）GSTのみを含むウェルは、常にいくつかの内因性キナーゼ活性を浄化することです。これは基質のリン酸化が本物であることを排除していませんが、それは 、インビトロでのキナーゼの設定は以下の選択であることを示唆しているん。これは、キナーゼ基質特異性に関する結論を引き出すためにMWの異なる複数の基板を含むことが特に有益です。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig1.jpg" /> プロトコルにおける重要なステップを示す図1のフローチャート 。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53152/53152fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig2.jpg" /> ライブラリー（180ヒトプロテインキナーゼ）のバージョン1の画面の図の画面結果の2例。オートラジオグラフ（ヤンソンから再生ら 、2008）、マウスCRTC2のAA 268から283に対応するGST-ペプチド基質を使用して行います。 MBP、ミエリン塩基性タンパク質を示しています。複数の高度関連キナーゼによるubstrate選択は画面の機能です。各レーンは、異なるキナーゼアッセイからの反応生成物を表します。 MARK3（ゲル1）とMARK2（ゲル16）が、唯一のキナーゼはTORC2 268から283ペプチドをリン酸化するために、示されている。 <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53152/53152fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening at JoVE.com

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

identification-kinase-substrate-pairs-using-high-throughput

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K ビュー.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

ビデオ: Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

リン酸化部位決定のためのオリゴペプチド競合アッセイ

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

生化学

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

サイクリン依存性キナーゼ 1 の同定の in Vitroキナーゼによって特定のリン酸化のサイトの試金します。

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

ハイスループットインヒビタースクリーニングによる胚性幹細胞の多能性を調節するキナーゼを同定するための簡単な方法

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

発生生物学

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

新しいキナーゼタンパク質の堅牢な生化学的アプローチを用いて分子レベルでの特性解析

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2のキナーゼ活性を測定する in vitroで</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

生物学

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

バイオセンサーベースの高スループットバイオパンニングおよびバイオインフォマティクス分析戦略による、薬物-タンパク質相互作用のグローバル検証

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

生物工学

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

タンパク質 - タンパク質相互作用を検出するために、高密度機能タンパク質マイクロアレイのプロービング

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...