이 작품은 NSERC 부여에 의해 지원되었다 386634. 우리는 도움이 토론 Screaton 연구소의 회원들에게 감사의 말씀을 전합니다.

시약, 플레이트, 및 세포의 1. 준비 <ol><li> 25 mM 트리스 pH가 7.5, 150 mM의 염화나트륨, 50 mM의 불화 나트륨, 0.5 mM의 EDTA pH를 8.0, 0.5 % 트리톤-100, 5mM의 베타 - 글리세로 포스페이트, 5 % 글리세롤 : 500 ml의 용해 완충액을 만든다. 4 ℃에서 보관하십시오. 사용 1 mM의 디티 오 트레이 톨 (DTT), 1 mM의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF), 및 1 mM의 나트륨 바나 데이트를 추가하기 직전. 이 단계 후에, PMSF가 임의의 세정 완충액으로 요구되지 않는다. </li><li> 200 mM 트리스의 pH 7.5, 50 mM의 베타 글리세 (FW 216), 2 mM의 나트륨 바나 데이트 : 10 배 키나제 버퍼의 20 mL로한다. -20 ° C에서 1 ml의 튜브에 나누어지는 및 저장. 사용 5 mM의 DTT를 추가하기 직전. </li><li> 300 μM 아데노신 삼인산 (ATP), 66 밀리미터의 MgCl 2, -20 ° C에서 33 mM의 MnCl 2 1 ml의 튜브에 나누어 저장 : 10 배 M-ATP 버퍼의 20 mL로한다. </li><li> 배 도데 실 황산나트륨 100 mL로 (SDS)를 용해 완충액 : 1.5 g 트리스베이스, 글리세롤 20 ㎖, 30 ㎖의 H 2 O. 용해 및 HCl로 6.8에 산도를 조정합니다. 40 추가ml의 10 % SDS는 100 ㎖에 볼륨을 조정합니다. 25 mg의 브로 모 페놀 블루를 추가합니다. </li><li> 스팟 따라 96 웰 플레이트와 라벨 플레이트 세트에서 잘 당 GST-키나제 (14)를 인코딩 (25) NG / μL 포유 동물 발현 플라스미드의 4 μL. 사용할 때까지 -20 ° C에서 인감 및 동결 판. </li><li> 형질 전환 1-2 일 전에, CO 2 (최종 5 %)로 보충 된 37 ℃ 배양기에서 배양 HEK293T의 완전한 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) + 10 % 소 태아 혈청 (FBS)과 항생 물질의 세포. 트립신과 통로는 주식이 확장시&gt; 80 % 합류가 될 수 없습니다. 6 × 10 7 세포의 최소 화면 (80 % 합류에 HEK293T 세포의 약 3 × 15cm 요리)가 필요합니다. </li></ol> 2. 형질 참고 : 전체 프로토콜의 흐름도는 그림 1을 참조하십시오. <ol><li> 키나아제 플라스미드를 함유하는 플레이트를 동결 되었으면, 실온에서 해동차 우물의 바닥에서 습기를 수집하기 위해 3 분 동안 1,900 XG에 원심 분리기. </li><li> 지질 기반 형질 전환 시약의 312.7 μL와 감소 혈청 배지 (예를 들어, OPTI-MEM)의 8.6 ml의 혼합. 5 분 동안 앉아 보자. </li><li> 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 각 웰에 감소 혈청 매체의 10 μl를 추가합니다. </li><li> 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용 단계 2.2에서 감소 된 혈청 배지 / 형질 전환 시약 믹스 잘 당 10 μl를 추가합니다. 20-45 분 동안 앉아 보자. </li><li> 전체 80ml의 DMEM에 7.5 × 105 세포 / ml로 재현 탁 293T 세포. 잘 표준 볼륨 카세트 ​​장착 자동 액체 디스펜서를 사용하여 당 세포 현탁액 (즉, 7.5 × 10 4 세포)의 100 μl를 추가합니다. </li><li> 균일 한 세포 분포에 대한 현미경으로 우물을 확인하고 24 시간 동안 인큐베이터로 돌아갑니다. </li></ol> 3. GST-키나제 풀다운 <ol><li> F 확인resh : H 2 O의 540 μL와 0.2 M 나트륨 바나 데이트 60 μl를 혼합하여 4 mM의 pervanadate 솔루션 제 2 튜브 믹스 30 % 과산화수소 2.7 μL와 PBS 1.4 ml 중에. 함께 두 가지 솔루션을 추가하고 사용하기 전에 15 분 동안 앉아 보자. </li><li> (이것은 또한 너무 많은 난류를 생성로서 자동화 액체 디스펜서를 사용하지 않는) 단계 3.1에서 제조 pervanadate 2.5 μL,이어서 각 웰에 0.25 M CaCl2를 2 μL 분주 멀티 채널 피펫을 사용. 10 분 동안 37 ℃에서 각각의 판을 품어 후 얼음에 배치합니다. </li><li> 제 1 (시약의 제조)에 나타낸 바와 같이 DTT, PMSF, 나트륨 바나 데이트를 첨가하여 용해 완충액 35 mL로 제조. </li><li> 얼음에 판을 유지, 각 웰 진공 흡입기를 사용하는 매체를 제거합니다. 즉시 표준 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 50 μL / 웰의 차가운 얼음 용해 버퍼를 추가합니다. 를 Lyse에 얼음에 30 분 앉아 보자 (옵션 : 작은지면을 밀봉하여 여기에 필요한 경우 중지 할 수 있습니다전자 및 -80 ° C에서 저장. 얼음에, 해동 판)을 계속합니다. </li><li> 4 ℃에서 3 분 동안 1,900 XG에 스핀 판. </li><li> 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용하는 세포를 긁고 모든 내용을 전송 적절 V 바닥 96 웰 플레이트를 표시합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 1,900 XG에 스핀 판. </li><li> 회전하는 동안, 린스 100 μL / 웰의 (PMSF)없이 차가운 얼음 용해 버퍼와 글루타티온 코팅 된 플레이트 (각 96 웰 플레이트에 대해 하나)를 입력합니다. 얼음에 판을 보관하십시오. </li><li> 원심 분리기에서 V-바닥 플레이트를 제거합니다. 한 번에 하나는 종이 타월에 용해 버퍼와 얼룩을 흔들 싱크를 통해 글루타티온 판을 반전. 하단에있는 펠렛을 방해하지에주의하면서 판을 기울 멀티 채널 피펫을 사용하여 글루타티온 판에 V-바닥 판에서 용해 버퍼를 전송합니다. 판 커버와 결합하는 최소 2 시간 동안 얼음에 둡니다. </li><li> 2 시간 바인딩 단계의 마지막에 가까운, T을 보장 방사능 워크 스테이션을 준비그는 필요한 안전 조치는 방사성 작업 장소에 있습니다. 30 ° C로 설정 하이브리드 오븐. </li><li> 이 단계에서 필요하지 않은 제 1 절 PMSF에 표시된 추가 DTT 나트륨 바나 데이트에 의해 용해 완충액 200 ㎖를 준비합니다. </li><li> 용해 버퍼를 흔들 종이 타월에 가릴 수있는 싱크대 글루타티온 플레이트 전환. 헹구고 웰 (PMSF)없이 100 ㎕의 용해 완충액으로 3 배. 진행 할 준비가 될 때까지 세정에 보관 - 우물이 마른 앉게하지 마십시오. </li><li> 10 배 주식을 희석하고 표준 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하여 1X KB의 50 μL 1. 린스 판 한 번 섹션에 표시된대로 DTT를 추가하여 1X 키나제 버퍼 (KB) 55 mL로 준비합니다. 솔루션이 준비가 될 때까지 우물에 1X KB를 남겨주세요 : <ol><li> 15.9 ml의 최대 530 관심있는 기판의 μg의, 미엘린 염기성 단백질 500 μg의 (MBP), 10 배의 2.65 ml의 KB, 1 M DTT의 13.25 μL, 및 H 2 O 500을 추가하여 솔루션을 준비합니다. </li></ol></리&gt; <li> 한 번에 하나씩, 1X KB 린스를 제거 종이 수건에 오점, 바로 작은 볼륨 카세트를 장착하는 자동화 된 액체 디스펜서를 사용하는 솔루션의 30 μl를 추가 싱크대 위에 접시를 반전. 얼음에 판을 보관하십시오. </li><li> 2.5 ml의 10 배 M-ATP, 500 μCi를 감마 (32) P의 ATP, 및 H 2 O에 10 ㎖를 첨가하여 방사능 작업 영역 용액 B를 준비한다. <ol><li> 잘 배출 힘에 의한 혼합에 도움 리피터 피펫을 사용하여 당 용액 B 20 μl를 추가합니다. 덮고, 30 분 동안 30 ° C의 오븐에서 혼성화 부화. </li></ol></li><li> 30 분 후, 얼음에 다시 접시를 전송합니다. 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용하여 2 배 SDS 용해 버퍼의 50 μl를 추가합니다. 다음 단계로이 시점에서 진행, 또는 편리한 때까지 -20 ℃에서 알루미늄 호일 및 저장과 번호판을 봉인 할 수 있습니다. </li></ol> 4. 달리기, 염색, 건조 젤 참고 : 모든 작업은 지역 DESIGNA에서 수행되어야한다방사능에 대한 테드. <ol><li> 하이브리드 오븐의 전원을 켜고 85 ℃로 설정합니다. 실온에서 해동 판. 일단 오븐 오븐 10 분 샘플을 변성하는 동안 배양 온도, 이전 판에 도달했습니다. </li><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 반응의 15 μL와로드 26 웰 프리 캐스트 젤은 한 번에 여러 우물을 채우기 위해. 케어는 모든 팁 대응도 전에 샘플을 추가로 정렬 않도록주의해야합니다. 이 비법 인 ATP를 포함로 추적 염료 (파란 선)은 젤의 바닥 떨어져 실행하지 못하게 150 V.에서 젤을 실행합니다. </li><li> 젤을 해체하고 메스하거나 영화를 과다하므로 직선을 사용하여 비법 인 ATP (파란 선)을 차단. 라벨이 붙은 용기에 젤을 놓고 15 분 동안 쿠마 얼룩 커버. </li><li> 간단히, 쿠마 얼룩을 제거 물 젤을 씻어 및 솔루션을 destain 추가합니다. 젤 Destain 단백질은 명확하게 볼 수 있습니다 때까지. MBP를위한 밴드 및 기판 밴드해야각 샘플에 대한 표시. </li><li> 젤을 건조 : <ol><li> 필터 큰 종이를 잘라 건조기에 놓습니다. </li><li> 이 부드러운 때까지 증류수에 셀로판 시트를 적시고 무료 주름, 용지의 상단에 배치. </li><li> 젤의 순서를 기록하고, 셀로판 시트의 상단에 젤을 놓습니다. 두 번째 셀로판 시트를 적시고 젤 위에 놓습니다. </li><li> 좋은 균일 한 표면에 대한 모든 거품을 (플레이트 밀봉 롤러이 잘 작동) 출시. 플랩을 닫고 진공 켜고 80 ℃에서 3 시간 동안 젤을 건조. </li></ol></li><li> 겔이 건조되면, 신호를 강화하기 위해 스크린을 사용 XAR 필름에 노출. 사란 랩 또는 비닐 봉지와 카세트를 감싸고 서리을 유지하기 위해 테이프로 밀봉. -80 ° C 하룻밤에 카세트를 저장합니다. </li></ol> 5. XAR 필름 개발 <ol><li> 다음 날, 냉장고에서 카세트를 제거하고 실온에서 해동을 할 수 있습니다. 의 필름 개발암실은 제조자의 지시에 따른 필름을 사용하여 프로세서. 참고 : 키나제 기판 쌍의 증거에 대한 영화를 검사합니다. 두 번째 이상 노출도 약한 인산화 이벤트를 감지하는 데 유용 할 수 있습니다. </li></ol>

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	<li>Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphopeptide+mapping+and+identification+of+phosphorylation+sites.">Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).</li><li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications.">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS chem. 10, 63-71 (2015).</li><li>Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultradeep+human+phosphoproteome+reveals+a+distinct+regulatory+nature+of+Tyr+and+Ser/Thr-based+signaling.">Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling.</a> Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).</li><li>Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , (2006).</li><li>Boersema, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+qualitative+and+quantitative+profiling+of+tyrosine+phosphorylation+using+a+combination+of+phosphopeptide+immunoaffinity+purification+and+stable+isotope+dimethyl+labeling.">In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).</li><li>Hutti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+protein+kinase+phosphorylation+specificity.">A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity.</a> Nat Methods. 1, 27-29 (2004).</li><li>Johnson, S. A., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinomics:+methods+for+deciphering+the+kinome.">Kinomics: methods for deciphering the kinome.</a> Nat Methods. 2, 17-25 (2005).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+regulatory+systems+through+protein+interaction+domains.">Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains.</a> Science. 300, 445-452 (2003).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+yeast+protein+kinases+using+protein+chips.">Analysis of yeast protein kinases using protein chips.</a> Nat Genet. 26, 283-289 (2000).</li><li>Shah, K., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+approach+for+the+identification+of+direct+substrates+of+protein+kinases.">A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases.</a> Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).</li><li>Zou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKIS:+computational+identification+of+protein+kinases+for+experimentally+discovered+protein+phosphorylation+sites.">PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites.</a> BMC bioinform. 14, 247 (2013).</li><li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+active+and+kinase-deficient+kinome+collection+for+identification+of+kinases+regulating+hedgehog+signaling.">Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling.</a> Cell. 133, 537-548 (2008).</li><li>Jansson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+controls+CREB+activity+in+islet+cells+via+regulated+phosphorylation+of+TORC2.">Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).</li><li>Fu, A., Screaton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+kinomics+to+delineate+signaling+pathways:+control+of+CRTC2/TORC2+by+the+AMPK+family.">Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family.</a> Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).</li><li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion.">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome.">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

14,15 접근법을 설명 원래 공보 이후, 180 GST-키나제의 원래 라이브러리는 인간 단백질 kinome 420 부재, 또는 ~ 80 %로 확대되었다. 확장 된 라이브러리와 같은 설명 프로토콜 (필요하다고 인정하는) phosphorimaging 및 디지털 신호 향상의 사용에 의해 단축 될 수있는 필름을 개발 4~5일 다음 1~4일 걸립니다. 주의를 기울여야합니다 몇 가지 주요 단계 (프로토콜의 개요를 그림 1 참조)이 있습니다. 우선, 세포의 콘텐츠의 상태이다 (마이코 플라스마 무료, 팽창 중에 합류에 도달 할 수 없다, 각 통로에서 트립신) 배치 팽창 단계 동안 및 트랜시의 96 웰 플레이트에서. 형질 장소 (단계 1.5)를 취한다 때 세포는 균일 시드, 그리고 80 %의 합류해야한다. 둘째로, 그것은 볼륨 TRANSF을 최소화 자동화 액체 분배기를 사용하는 형질 감염 동안 적합ER 오류, 따라서 웰 사이의 변동 계수 ( &quot;CVS&quot;)을 한정. 감소 된 죽은 볼륨과 정확성을 분배 증가에 작은 볼륨 카세트 제한 시약 손실 디스펜서 피팅 작은 볼륨하십시오. 나트륨 pervanadate, 팬 티로신 포스파타제 억제제와 처리 단계는 표적 키나아제의 인산화 상태를 증가시키는 일반적인 자극으로서 사용된다. 이 단계에서의 칼슘의 포함으로 인해 장기간 pervanadate 처리에 의해 유도 반올림 세포 손실 방지, 세포 매트릭스의 밀착성을 증가시킨다. 이 단계는 10 분 배양 시간을 엄격하게 준수하여 수행해야합니다. 모두가 사용될 수있다 (120)만큼 클 kDa의 펩티드, 단백질 도메인, 또는 본래 단백질 : 셋째, 키나아제 분석 자체 몇몇 재조합 기판을 선택 사항이있다. 특정 인산화 부위를 안다면, 펩티드 기질은 가장 직선적 접근법이지만, 검출하기에 충분히 커야SDS-PAGE 젤에. 이와 같이, 펩티드 기질은&gt; 25 MW를 수득 세균 GST 융합 및 정제 할 수있다. 더 큰 단백질들은 가능​​성 접어 그들이 셀에 아직 그들이 인산화 및 분석에서의 신호를 줄 수있는 추가의 잔기를 포함 할 것이다 단점으로 와서 그들의 phosphorylatable 잔기가 노출 된 이점을 갖는다. 우리의 환경이 모두 스크린에서 후보 키나제의 유효성을 렌더링로서, 생체 내에서 인산화 될 알려져 있고 생물학적 사건을 조절하는 것으로 알려져있다 잔사를 둘러싸 15-20 아미노산으로 구성된 펩타이드 기질을 이용하여 화면을 실행하는 것 체외에서 훨씬 빠른 생체 내에서. 마지막으로, 단백질 접근 방식의 이상적인 양 또​​는 잘 당 1 μg의를 초과; 이것은 물론 기판의 MW에 따라 변한다. 웰 당 적은 단백질 의미 적중을 수득 할 수 있지만, 그것으로 신호를 증가 규칙 적용 &#39;더 나은 인&#39;노이그 자체. 그라데이션 젤은 건조 중에 너무 자주 균열로 표준, 비 그라데이션 젤을 권장합니다. 젤을 건조시킨 후, 가이거 카운터와 배경 위에 방사성 신호의 검출은 분석의 성공의 우수한 표시를 제공합니다. 화면 시험관에 추가의 복잡성 레벨이 생체 내에서 존재하는 한, 주어진 기판 후보 키나아제 (들)은 세포에서 검증되어야한다. 구체적으로는, 화면이 아직 동일한 세포 유형에서 또는 기판과 같은 세포 내 구획에서 발현되지 않는 생체 외 기질을 인산화하는 생화학 적 능력을 가지고 가족을 식별 할 수있다. MARK2 및 MARK3 모두 히트 Ser275의 인산화를 CRTC2 수 키나아제 화면에있는 동안, 예를 들어, 만 MARK2 셀 (14) 기판과의 착체 형성. 후보 키나아제의 생리 학적 관련성을 확인하는데 사용되는 추가의 일련의 실험은 다음과. 전나무세인트는 후보 키나아제의 동시 발현 다음 SDS-PAGE에 기판의 이동 변화는 확인 제어로 사용될 수있다. 적절한 제어 촉매 비활성 키나제의 그런에 cotransfection는 특이성을 확인할 수 있습니다. 둘째, 기판을 촉매 비활성을 야생형 키나제의 존재 하에서 기질에 인산염의 혼입을 확인 오르토 P-32과 함께 배양하고되지 않은 세포 추출물로부터 면역 침전 될 수있다. 셋째, 포스 포 - 항체 phosphoacceptor 시퀀스에 대해 생성 (알려진 경우) 및 키나제가 과발현되는 경우, 기판의 인산화의 증가를 확인 할 수있다. 목표 부위에서 비 phosphorylatable 잔사를 운반 돌연변이 기판을 이용한 이차 화면 전에 phosphoantibody 큰 도메인 및 전장 단백질 기질과 특히 중요한 제어의 발생에 특이성을 확인할 수있다. 약리 억제 칸디 억제 접근법날짜 키나아제가 또한 사용될 수있다, 그러나주의가 관련 키나아제의 억제로 발휘해야하는 과소 현실이다. 마지막으로, 수행 될 수있는 세포 내 키나제 후보 (들)의 침묵을 따라 웨스턴 블롯 포스 포 항체 표적 부위 인산화의 감소를 감시하기는 RNAi를 매개.

단백질 번역 후 변형 (PTMS)는 세포 내 통신을위한 필수적이다. 아마도 모든 PTMS의 연구 최고 세포 내 현지화, 형태, 안정성, 생화학 적 활동을 포함한 단백질 기능의 무수를 조절 단백질 인산화 효소에 의해 촉매 인산화이다. 표적 단백질의 인산화 부위의 식별은 트립신 포스 포 매핑 또는 인산화 펩티드 1,2- 위해 농축 된 샘플을 이용하여 현재 표준 프로테옴 기법에 의해 달성 될 수있다. 발현 프로테옴 사분의 삼가 3 인산화 될 것으로 예상하고 100 만 6까지 예상치 200,000 인산화 부위 5를 식별하는 동안, 이들의 대부분은 통로 또는 단백질 키나제 시그널링 어떠한 할당 생물학 없다. 인산화 사이트의 식별은 비교적 큰 도전이고, 비교적 간단하지만기판 쌍 :이 사이트를 대상으로 동족 키나제 (들), 우리가 매핑 키나제로 참조하는 프로세스를 식별합니다. 기판 쌍이 설명되었지만, 어느 주목 키나아제로 시작하고 그 기판을 찾고 관심 또는 기판에서 시작하여 개질 키나아제 7-11 또는 실험적 계산 (12)을 찾기 위해 시도 : 키나아제를 식별하기위한 여러 가지 방법. 공지 인산화 기판 키나제를 식별하는, 생물 정보학 기판과 강수량 복합체를 형성 키나제 인산화 잔사 (컨센서스 사이트) 측면뿐만 아니라 식별 아미노산의 짧은 보존 된 서열을 포함하는 단백질을 식별하는 데 사용될 수있다. 그러나, 이러한 방법은 시간이 많이 소요되어 종종 성공을 충족하지 않습니다. 우리는 주어진 빠르게 기판 (13)을 인산화 키나아제를 식별 체계적인 접근 기능을 개발 하였다. 스크린 분석법 우수한 특정을 생산잠재적 인 동족 키나제에 대한 아주 명확한 선택과 성만. 생물학적 신호에 인산화의 중심성을 감안할 때, 스크린은 거의 모든 세포 신호 전달 경로 14-16에서 발견에 유용합니다. 스크린은 인간 단백질 키나제의 라이브러리로 대규모 키나아제 분석을 수행하는 것을 포함한다. 키나아제는 박테리아 글루타치온 S 트랜스퍼 라제 (GST) 단백질로 태그 된 재조합 효소 즉, 포유 동물 세포 추출물로부터 정제 - 박테리아로부터 제조 된 것과 달리 - 종종 필요한 상류 단백질 키나제의 존재하에 생성되고 재조합 효소는 시험 관내에서 활성을 갖는. 세린, 트레오닌 및 티로신 키나제 활성이 하류 키나제 활성화에 필요하면서 실제로 효모 (10)에 존재하는, 효모 게놈은 500 유전자 17 포유류 kinome는,하기 위해 훨씬 더 복잡해질 것을 나타내는, 122 단백질 키나제를 코딩 REGULA고차 생물에 고유의 프로세스를 테. 또한, 세포 생물학 및 (등과 소분자, 성장 인자, 호르몬 등) 인간의 질병과 관련된 다른 자극의 효과는 적절한 컨텍스트 (14, 15)는 조절 키나제 활성에 사용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Lysis buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.1</td></tr><tr><td>10x kinase buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.3</td></tr><tr><td>Human kinase plasmids</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST-tagged in house</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>supplement with 100&amp;nbsp;U/ml penicillin, 100&amp;nbsp;&amp;#956;g/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm cell culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipid-based transfection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Standard cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM pervanadate</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (20-200 &amp;#956;l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (1-10 &amp;#956;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 6-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione coated 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST tagged substrate</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myelin Basic Protein (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Repeater pipette (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS lysis buffer (100&amp;nbsp;ml)</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.4</td></tr><tr><td>26-well precast TGX gels</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest</td></tr><tr><td>Coomassie stain</td><td>Made in house</td><td></td><td>0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Made in house</td><td></td><td>10% acetic acid, 20% methanol</td></tr><tr><td>Labeled gel containers</td><td>Made in house</td><td></td><td>Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel</td></tr><tr><td>Whatman filter paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Cellophane sheets (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Gel dryer</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Double emulsion autoradiography film</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Film cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Intensifying screen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealing rubber roller</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinase-substrate pairs using high throughput screening

우리는 새로운 신호 전달 경로를 밝히기 위해 사용될 수 인산화 기판 전용 인간 단백질 키나제를 식별하기위한 스크리닝 플랫폼을 개발했다. 우리의 접근 방식은 정제 GST - 태그 인간의 단백질 키나아제의 라이브러리와 관심의 재조합 단백질 기판의 사용을 특징으로한다. 우리는, CREB-규제 전사 보조 활성화 인자 2 (CRTC2)에 글루코스 조절 사이트 키나아제 MAP / 미세 소관 연관 조절 키나제 2 (MARK2)를 식별하는 베타 세포의 증식에 필요한 단백질뿐만 아니라을이 기술을 사용한 티로신의 액슬 제품군은 어댑터 단백질 엘모의 인산화에 의한 세포 전이의 규제로 키나아제. 우리는이 기술을 설명하고 세포가 환경 자극에 반응하는 방법의 포괄적 인지도를 구축하는 데 도움이 될 수 있습니다 방법에 대해 설명합니다.

화면에서 대표적인 결과는도 2에 도시되어있다. 180 키나아제는 CRTC2뿐만 아니라 고전 키나아제 검정 기질 미엘린 염기성 단백질 (MBP)로부터 AA 2백68부터 2백83까지 대응 GST 표지 된 펩티드 기질을 사용하여 스크리닝 하였다. 단 두 키나제, MARK2와 매우 관련 키나아제 MARK3는 CRTC2 펩타이드를 인산화. 그것은 많은 phosphorylatable 잔류 물을 포함하고 젤의 아래쪽으로, 18 kDa의에서 실행되는 MBP, 모든 분석에서 내부 통제 포함되어 있습니다. 이 특이성의 해석을 허용 : 일부 키나제는 견고 기판과 MBP를 인산화합니다. 여기에 참고로하여 항상 분석에서 배경 인산화가, (노 키나제 컨트롤 IE) 혼자 GST가 포함 된 우물은 항상 어떤 내인성 키나제 활성을 정화한다는 것입니다. 이 기판의 인산화가 진짜임을 배제하지 않지만, 그것은 이하 선택적 일 수있다 키나아제 설정 체외에서 그 제안 않는다.그것은 키나제 - 기질 특이성에 대한 결론을 도출 MW 서로 다른 여러 개의 기판을 포함하는 것이 특히 유익하다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig1.jpg" /> 그림 프로토콜의 주요 단계를 보여주는 1. 순서도. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53152/53152fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig2.jpg" /> 라이브러리 (180 인간의 단백질 키나아제)의 버전 1의 화면의 그림 화면 결과 2. 예. Autoradiographs은 (얀손에서 재생 등., 2008) 마우스 CRTC2의 AA 268-283에 해당하는 GST-펩타이드 기질을 사용하여 수행. MBP, 미엘린 염기성 단백질이 표시됩니다. S의 높은 수준의관련 키나아제에 의해 ubstrate 선택은 화면의 기능입니다. 각 레인은 별개의 키나제 분석에서 반응 생성물을 나타낸다. MARK3 (젤 1) MARK2 (겔 16), 유일한 키나제가 TORC2 268-283 펩타이드을 인산화하는, 표시됩니다. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53152/53152fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

identification-kinase-substrate-pairs-using-high-throughput

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K 조회수.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

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Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

연구

생화학

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

 종속 키 1의 시험관에서 키에 의해 인 산화 특정 사이트 분석 결과

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

높은 처리량 억제제 스크리닝에 의한 배아 줄기 세포의 다 능성을 조절하는 키나제를 확인하는 간단한 방법

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

발생학

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

다양 한 생 화 확 적인 접근을 사용 하 여 소설 CK2 키 기판의 식별

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

자체 조립된 인간 단백질 마이크로어레이에서 키나제 억제제 스크리닝

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

LRRK2의 키나제 활동 시금 체외에서</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

생물학

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

약물 단백질 상호 작용의 글로벌 검증을 위한 바이오센서 기반 고처리량 바이오패닝 및 생물정보학 분석 전략

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

생체공학

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

안쪽 정류기의 칼륨 채널의 소형 분자 변조기에 대한 높은 처리량 검사

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...