Name: identification of kinase-substrate pairs using high throughput screening
Uploaded: 2015-08-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
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Este trabalho foi apoiado pela concessão NSERC 386634. Gostaríamos de agradecer aos membros do Laboratório Screaton para discussões úteis.

1. Preparação dos reagentes, placas, e Células <ol><li> Adicione 500 ml de tampão de lise: Tris 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, NaF 50 mM, 0,5 mM EDTA pH 8,0, 0,5% Triton X-100, 5 mM beta-glicerofosfato, 5% de glicerol. Armazenar a 4 ° C. Imediatamente antes da utilização, adicionar 1 mM de ditiotreitol (DTT), 1 mM de fluoreto de fenilmetil sulfonil (PMSF), e 1 mM de vanadato de sódio. Após este passo, PMSF não é necessária em qualquer tampão de lavagem. </li><li> Adicione 20 ml de cinase 10X: Tris Buffer de 200 mM de pH 7,5, 50 mM beta-glicerofosfato (FW 216), vanadato de sódio a 2 mM. Da alíquota em tubos de 1 ml e armazenar a -20 ° C. Imediatamente antes de usar, adicionar DTT 5 mM. </li><li> Adicione 20 mL de tampão H-ATP 10x: 300 uM de adenosina trifosfato (ATP), 66 mM de MgCl2, 33 mM de MnCl 2. alíquota para tubos de 1 ml e armazenar a -20 ° C. </li><li> Adicione 100 ml de 2x dodecil sulfato de sódio (SDS) de tampão de lise: 1,5 g de base Tris, 20 ml de glicerol, 30 ml de H 2 O. Dissolver e ajustar o pH para 6,8 com HCl. Adicionar 40ml de SDS a 10%, ajustar o volume para 100 ml. Adicionar 25 mg de azul de bromofenol. </li><li> Spot 4 ul de 25 ng / uL do plasmídeo de expressão de mamífero que codificam uma cinase de GST-14 por poço em placas de conjuntos de 96 poços e as placas de etiqueta em conformidade. Seal e congelar placas a -20 ° C até à sua utilização. </li><li> 1-2 dias antes da transfecção, as células HEK293T cultura em meio de Eagle modificado por Dulbecco completo (DMEM) + 10% de soro fetal de bovino (FBS) e antibióticos numa incubadora a 37 ° C com CO 2 suplementado (final de 5%). Passage com tripsina e não permitir que o estoque para se tornar&gt; 80% confluentes durante a expansão. Um mínimo de 6 x 10 7 células são necessárias para a tela (aproximadamente 3 x 15 cm pratos de células HEK293T em 80% de confluência). </li></ol> 2. Transfecção Nota: Consulte a Figura 1 para um fluxograma de protocolo inteiro. <ol><li> Se placas contendo plasmídeos quinase foram congelados, descongele em temperatura ambiente umaND, centrifugar a 1900 xg durante 3 minutos para recolher a humidade no fundo dos poços. </li><li> Misturar 8,6 ml de meio de soro reduzido (por exemplo, meio OPTI-MEM), com 312,7 ul de reagente de transfecção à base de lípidos. Deixe descansar por 5 min. </li><li> Adicionar 10 ul de meio de soro reduzido para cada cavidade utilizando um dispensador de líquido automático equipado com um pequeno volume de cassete. </li><li> Adiciona-se 10 uL por poço de reagente de forma a mistura de soro / transfecção reduzida a partir do passo 2.2 utilizando um dispensador de líquido automático equipado com um pequeno volume de cassete. Deixe descansar por 20 a 45 min. </li><li> Ressuspender as células 293T em 7,5 x 10 5 células / ml em 80 ml ​​de DMEM completo. Adicionar 100 ul de suspensão de células (isto é, 7,5 x 10 4 células) por poço usando um distribuidor de líquido automático equipado com uma cassete de volume padrão. </li><li> Verifique poços sob o microscópio para distribuição uniforme de células e retornar à incubadora durante 24 h. </li></ol> 3. pulldown de GST-cinase <ol><li> Faça fresh: 4 mM de solução pervanadato por mistura de 60 ul de 0,2 M de vanadato de sódio, com 540 mL de H 2 O. Numa segunda mistura tubo de 2,7 mL de peróxido de 30% e 1,4 ml de PBS. Adicionar as duas soluções em conjunto e deixe descansar por 15 min antes do uso. </li><li> Usando uma pipeta de canais múltiplos (não utilizar um distribuidor de líquido automatizado uma vez que cria demasiada turbulência no poço) dispensar 2 ul de 0,25 M de CaCl2 em cada poço, seguido de 2,5 mL do pervanadato preparado no passo 3.1. Incubar cada placa a 37 ° C durante 10 min e, em seguida, colocar em gelo. </li><li> Prepare 35 ml de tampão de lise adicionando DTT, PMSF, e vanadato de sódio, tal como indicado na Seção 1 (Preparação de Reagentes). </li><li> Mantendo as placas em gelo, remover o meio de cada poço utilizando um aspirador de vácuo. Imediatamente adicionar 50 ul / poço de tampão de lise arrefecido em gelo utilizando um dispensador de líquido automático equipado com uma cassete de padrão. Deixe descansar 30 min em gelo para lise (opcional: pode parar por aqui, se necessário, por meio de selagem platE e armazenar a -80 ° C. Para continuar, placas de descongelamento no gelo). </li><li> Chapas giram a 1900 xg durante 3 min a 4 ° C. </li><li> Raspe células de cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos e para transferir todos os conteúdos apropriadamente marcada placas de 96 poços de fundo em V. Chapas giram a 1900 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> Durante a rotação, encher placas revestidas com glutationa (um para cada placa de 96 poços) com 100 ul / poço de tampão de lise arrefecido em gelo (sem adição de PMSF) como uma lavagem. Mantenha as placas no gelo. </li><li> Remover placas de fundo em V da centrífuga. Um de cada vez, inverter as placas de glutationa sobre uma pia para esvaziar a solução de lise e blot em uma toalha de papel. Transferir tampão de lise a partir das placas de fundo em V para as placas de glutationa por inclinação da placa e utilizando uma pipeta de canais múltiplos, tendo o cuidado de não perturbar o sedimento no fundo. Cubra as placas e deixar em gelo durante mínimo 2 horas de se ligar. </li><li> Perto do fim do passo de ligação 2 h, preparar uma estação de trabalho radioactividade, assegurando tele precauções de segurança necessárias estão no lugar para o trabalho radioativo. Definir forno de hibridação a 30 ° C. </li><li> Preparar 200 ml de tampão de lise por adição de DTT e vanadato de sódio tal como indicado no ponto 1. PMSF não é necessária nesta fase. </li><li> Inverter as placas de glutationa sobre uma pia para sacudir a tampão de lise e blot em uma toalha de papel. Lavar os poços 3x com 100 ul de tampão de lise (sem adição de PMSF). Não deixe que os poços sentar seco - mantê-los na lavagem até que esteja pronto para prosseguir. </li><li> Preparar 55 ml de tampão de quinase 1x (KB) diluindo o estoque de 10x e adição de DTT, tal como indicado no ponto 1. Lavar as placas uma vez com 50 ul de 1x KB utilizando um dispensador de líquido automático equipado com uma cassete de volume padrão. Deixar 1x KB em poços até uma solução pronta é: <ol><li> Prepare a Solução A pela adição de 500 a 530 ug de o substrato de interesse, 500 ug de proteína básica de mielina (MBP), 2,65 ml de 10x KB, 13,25 ul de DTT 1 M, e H2O até 15,9 ml. </li></ol></li&gt; <li> Um de cada vez, inverter as placas sobre uma pia para remover 1x KB enxaguamento, seque sobre toalha de papel, e imediatamente adicionar 30 ul de uma solução utilizando um dispensador de líquido automático equipado com um pequeno volume de cassete. Mantenha as placas no gelo. </li><li> Preparar a solução B na área de trabalho a radioactividade por adição de 2,5 ml de 10x H-ATP, 500 uCi de 32 P ATP gama-, e H 2 O a 10 ml. <ol><li> Adicionar 20 ul de solução B por poço utilizando uma pipeta de repetidor que auxilia na mistura, devido à força de ejecção. Cobrir e incubar em 30 ° C forno de hibridação durante 30 min. </li></ol></li><li> Após 30 minutos, a transferência de volta para as placas de gelo. Adicionar 50 ul de tampão de lise 2x SDS para cada poço utilizando uma pipeta de canais múltiplos. Pode prosseguir neste ponto para a próxima etapa, ou selar as placas com folha de alumínio e armazenar a -20 ° C até conveniente. </li></ol> 4. corrida, coloração e géis de secagem Nota: Todo o trabalho deve ser realizado em uma área DESIGNAted para a radioactividade. <ol><li> Ligue forno de hibridação e ajustado para 85 ° C. Placas de descongelamento em temperatura ambiente. Uma vez forno atingiu a temperatura, placas de transferência para forno e incubar por 10 min para desnaturar amostras. </li><li> Carga 26 poços géis pré-moldados com 15 ul de cada reacção utilizando uma pipeta de canais múltiplos para preencher vários poços de uma só vez. Cuidados devem ser tomados para que todas as dicas alinhar com as correspondentes bem antes de adicionar amostras. Execute gel em 150 V. Não deixe que o corante de rastreio (linha azul) funcionar fora do fundo do gel como esta contém a ATP não incorporado. </li><li> Desmontar os géis e cortou a ATP não incorporado (linha azul), utilizando um bisturi ou borda reta como ele vai expor demais os filmes. Coloque os gels em recipientes rotulados e cubra com Coomassie mancha para 15 min. </li><li> Remover a mancha de Coomassie, brevemente enxaguar os géis com água, e adicionar destain solução. Destain os géis até que as proteínas são claramente visíveis. Uma banda para MBP e uma banda para o substrato deveser visível para cada amostra. </li><li> Para secar o gel: <ol><li> Corte uma folha grande de papel de filtro e coloque-o no secador. </li><li> Molhe uma folha de celofane em água destilada até que esteja lisa e sem rugas, e colocá-lo no topo do papel. </li><li> Coloque os géis em cima da folha de celofane, fazendo uma nota da ordem de géis. Molhar uma segunda folha de celofane e colocar na parte superior dos géis. </li><li> Rolar para fora todas as bolhas (um rolo de vedação placa funciona bem para isso) para uma superfície uniforme agradável. Fechar a aba, ligar o vácuo, e secar o gel durante 3 horas a 80 ° C. </li></ol></li><li> Uma vez géis estão secos, expô-los a filme XAR com um ecrã de intensificar o sinal. Enrole a fita com saran wrap ou um saco plástico e feche com fita adesiva para impedir a entrada de geada. Armazenar a cassete a -80 ° C durante a noite. </li></ol> 5. Desenvolver XAR Films <ol><li> No dia seguinte, remove cassete do congelador e deixar descongelar à temperatura ambiente. Desenvolver o filme emuma câmara escura usando um processador de filme de acordo com as instruções do fabricante. Nota: Examinar os filmes para provas de pares quinase-substrato. Uma segunda exposição mais longa pode também ser útil para detectar eventos de fosforilação fracas. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Uma vez que as publicações originais que descrevem a abordagem 14,15, a biblioteca original de 180 GST-quinases foi ampliada para 420 membros, ou ~ 80% do kinome proteína humana. Com a biblioteca ampliada, o protocolo conforme descrito leva 4-5 dias e, em seguida, 1-4 dias para desenvolver filmes (como necessário), o que pode ser encurtado através da utilização de imagiologia com fósforo e o aumento do sinal digital. Há várias etapas-chave em que os cuidados devem ser tomados (veja a Figura 1 para uma descrição de protocolo). Primeiro, é a saúde da população de células (por micoplasma livre, nunca permitiu atingir a confluência, durante a expansão, e tratou-se com tripsina a cada passagem) durante a fase de expansão do lote e nas placas de 96 poços no momento da transfecção. As células devem ser uniformemente semeado, e 80% confluente quando transfecção tem lugar (Passo 1.5). Em segundo lugar, é ideal durante a transfecção para utilizar um distribuidor de líquido automatizado para minimizar o volume transferros de er, limitando assim o coeficiente de variação (&quot;cvs&quot;) entre os poços. Para pequenos volumes, ajustando o dispensador com um volume menor perda de limites cassete de reagente, devido à redução dos volumes mortos e aumentos de dispensação de precisão. O passo de tratamento com pervanadato de sódio, um inibidor de tirosina-fosfatase panela, é usado como um estímulo para aumentar geral estado de fosforilação de cinases alvo. Inclusão de cálcio nesta etapa aumenta a adesão de células-matriz, evitando a perda de células devido a arredondamentos provocada por tratamento pervanadato prolongado. Esta etapa deve ser feito com a estrita observância do tempo de incubação de 10 minutos. Em terceiro lugar, para o ensaio de quinase em si, há várias considerações ao seleccionar o substrato recombinante: péptidos, domínios de proteína, ou proteínas intactas tão grandes como 120 kDa podem ser utilizados. Se um local de fosforilação específica é conhecida, um substrato péptido é a abordagem mais direta, mas precisa ser suficientemente grande para detectarnum gel de SDS-PAGE. Assim, os substratos de péptidos podem ser fundidos com GST e purificado a partir de bactérias para dar um peso molecular de&gt; 25. Proteínas maiores têm a vantagem de que eles são provavelmente dobrada e os seus resíduos fosforilável exposta como estariam na célula, mas possuem a desvantagem de que eles vão incluir resíduos adicionais, que podem ser fosforilados e dão sinal no ensaio. A nossa preferência é para executar uma tela utilizando um substrato péptido constituído por 15-20 aminoácidos que rodeiam um resíduo que é conhecido por ser fosforilada in vivo e é conhecido por regular um evento biológico, já que isto torna a validação das cinases candidatos a partir da tela, tanto in vitro e in vivo muito mais rápido. Por último, de preferência a quantidade de abordagens de proteína ou superior a 1 ug por poço; Isto, obviamente, varia de acordo com o PM do substrato. Menos de proteína por poço pode produzir sucessos significativos, mas a &quot;mais é melhor&quot; regra aplica-se à medida que aumenta sinal: noiSE. Padrão, géis de gradiente não são recomendados como géis de gradiente de rachar muito frequentemente durante a secagem. Após a secagem dos geles, a detecção de um sinal radioactivo sobre o fundo com um contador Geiger dá uma excelente indicação de sucesso do ensaio. À medida que a tela é in vitro e níveis adicionais de complexidade existir in vivo, um candidato quinase (s) para um dado substrato deve ser validado em células. Especificamente, o ecrã pode identificar um membro da família que tem a capacidade para fosforilar a bioquímica substrato in vitro, mas não é expresso no mesmo tipo de célula ou no mesmo compartimento subcelular como substrato. Por exemplo, enquanto MARK2 e MARK3 eram ambos os acessos em uma tela para cinase que podem fosforilar CRTC2 em Ser275, única MARK2 formado um complexo com o substrato 14 em células. Segue-se uma série de experiências adicionais que podem ser utilizados para confirmar a relevância fisiológica de um candidato quinase. Abetor, os desvios de mobilidade do substrato em SDS-PAGE a seguir a co-expressão da quinase candidato pode ser utilizado como um controlo de confirmação. Controles apropriados, tais cotransfecção de uma quinase cataliticamente inativa pode confirmar especificidade. Em segundo lugar, o substrato pode ser imunoprecipitada a partir de extractos celulares que foram incubadas com 32 P-ortofosfato para confirmar a incorporação de fosfato no substrato na presença do tipo selvagem e não uma quinase cataliticamente inactivo. Em terceiro lugar, um anticorpo pode ser gerado fosfoespecï¿½ico contra a sequência phosphoacceptor (se conhecido) e utilizado para confirmar um aumento na fosforilação do substrato quando a cinase é sobre-expresso. Um ecrã secundário utilizando um substrato mutantes portadoras de um resíduo não-fosforilável no local alvo pode confirmar a especificidade antes da geração de um phosphoantibody, um controlo particularmente importante com substratos e maior domínio de proteína de comprimento completo. A inibição farmacológica abordagens para inibir um candidata quinase também pode ser usado, mas o cuidado deve ser exercido como inibição das cinases relacionadas é uma realidade subvalorizado. Por último, mediada por ARNi silenciamento do candidato quinase (s) nas células seguidos e western blotting para monitorizar a perda de local alvo fosforilação com um anticorpo fosfoespecï¿½ico pode ser realizada.

Proteína modificações pós-traducionais (PTMs) são essenciais para a comunicação intracelular. Talvez o melhor estudada de todas as PTMs fosforilação é catalisada por proteínas quinases, que regulam uma miríade de funções de proteínas, incluindo a sua actividade bioquímica, localização subcelular, conformação, e a estabilidade. A identificação de sítios de fosforilação de proteínas alvo pode ser realizada através de mapeamento triptico fosfopéptido ou por técnicas-padrão de proteómica agora utilizando amostras enriquecidas para péptidos fosforilados 1,2. Enquanto três quartos do proteoma expressas são esperados para ser fosforilada 3 e um identificado 200.000 locais de fosforilação 5, com estimativas de até 1 milhão de 6, muitos deles não têm atribuído biologia, via de sinalização, ou proteína quinase. Enquanto identificação de locais fosforilados é relativamente simples, uma comparativamente maior desafio éidentificar a cinase cognato (s) que tem como alvo estes locais, um processo que nos referimos como mapeamento de quinase: substrato pares. Várias abordagens para a identificação de quinase: substrato pares foram descritas, começando com uma quinase de interesse e procurando os seus substratos, ou a partir de um substrato de interesse e a tentativa de encontrar um modificador quinase 7-11 experimentalmente ou computacionalmente 12. Para identificar quinases para um substrato fosforilado conhecido, bioinformática pode ser usado para identificar proteínas que contêm uma sequência conservada curto de aminoácidos que flanqueiam o resíduo fosforilado (o local de consenso), bem como a identificação de quinases que formam um complexo com o substrato precipitável. No entanto, estas abordagens são demorados e muitas vezes não cumprem com sucesso. Nós desenvolvemos uma abordagem funcional sistemático para identificar rapidamente quinases que fosforilam pode um determinado substrato 13. O ensaio tela produz excelente específicodade, com a seleção muito clara para os potenciais quinases cognatas. Dada a centralidade da fosforilação de sinalização biológica, a tela é útil para a descoberta em praticamente todos os celulares vias de sinalização 14-16. A tela envolve a realização de um ensaio de quinase em larga escala com uma biblioteca de proteínas quinases humanos. As cinases foram marcados com glutationa bacteriano S-transferase (GST) de proteínas e são purificados a partir de extractos de células de mamíferos, o que significa que as enzimas recombinantes - ao contrário do que as preparadas a partir de bactérias - são gerados na presença das proteínas quinases a montante muitas vezes necessários para a enzimas recombinantes para ter actividade in vitro. Com efeito, enquanto que a actividade da cinase de serina, treonina e tirosina necessária para a activação a jusante de quinase estão presentes na levedura 10, o genoma da levedura codifica 122 cinases de proteína, indicando que o kinome de mamífero, com mais de 500 genes 17, tornou-se significativamente mais complexa, a fim de regulate os processos originais para os organismos de ordem mais elevada. Além disso, o efeito de diferentes estímulos relevantes para a biologia celular e doença humana (tal como pequenas moléculas, factores de crescimento, hormonas, etc.) podem ser usados ​​para modular a actividade de quinase 14,15 num contexto apropriado.

<table><tbody><tr><td>Lysis buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.1</td></tr><tr><td>10x kinase buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.3</td></tr><tr><td>Human kinase plasmids</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST-tagged in house</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>supplement with 100&amp;nbsp;U/ml penicillin, 100&amp;nbsp;&amp;#956;g/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm cell culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipid-based transfection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Standard cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM pervanadate</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (20-200 &amp;#956;l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (1-10 &amp;#956;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 6-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione coated 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST tagged substrate</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myelin Basic Protein (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Repeater pipette (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS lysis buffer (100&amp;nbsp;ml)</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.4</td></tr><tr><td>26-well precast TGX gels</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest</td></tr><tr><td>Coomassie stain</td><td>Made in house</td><td></td><td>0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Made in house</td><td></td><td>10% acetic acid, 20% methanol</td></tr><tr><td>Labeled gel containers</td><td>Made in house</td><td></td><td>Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel</td></tr><tr><td>Whatman filter paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Cellophane sheets (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Gel dryer</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Double emulsion autoradiography film</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Film cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Intensifying screen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealing rubber roller</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinase-substrate pairs using high throughput screening

Nós desenvolvemos uma plataforma de rastreio para identificar proteínas quinases específicas de substratos fosforilados humanos que podem ser utilizados para elucidar novas vias de transdução de sinal. A nossa abordagem apresenta a utilização de uma biblioteca de proteínas quinases humano marcado com GST purificada e um substrato da proteína recombinante de interesse. Usámos esta tecnologia para identificar MAP / microtúbulo-regulação afinidade quinase 2 (MARK2) como a quinase para um local regulada por glucose, em reguladas pela CREB transcricional coativador 2 (CRTC2), uma proteína necessária para a proliferação das células beta, assim como a família de tirosina-quinases Axl como reguladores de metástases de células por fosforilação da proteína adaptadora ELMO. Descrevemos essa tecnologia e discutir como ela pode ajudar a estabelecer um mapa abrangente de como as células respondem a estímulos ambientais.

Os resultados representativos de uma tela são mostrados na Figura 2. 180 quinases foram rastreadas utilizando um substrato de péptido marcado com GST correspondente aos aa 268-283 da CRTC2, bem como a proteína básica clássico ensaio de quinase substrato de mielina (MBP). Apenas duas cinases, MARK2 e o MARK3-quinase altamente relacionados com o peptídeo fosforilado CRTC2. MBP é incluído como um controlo interno em todos os ensaios, uma vez que contém muitos resíduos fosforilável e roda a 18 kDa, em direcção ao fundo do gel. Isto permite uma interpretação da especificidade: alguns quinase vai robustamente fosforilar um substrato e MBP. De notar aqui é que os poços que contêm GST isolada (ou seja, os controlos sem quinase) sempre purificar alguma actividade de quinase endógena, portanto, existe sempre a fosforilação de fundo no ensaio. Enquanto isto não exclui que a fosforilação do substrato é real, ela sugere que in vitro no ajuste da quinase pode ser menos selectiva.É particularmente informativo para incluir vários substratos de diferentes MW para tirar conclusões acerca da especificidade quinase-substrato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxograma mostrando etapas fundamentais no protocolo. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53152/53152fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig2.jpg" /> Figura 2. Exemplo da tela resultado. Autorradiografias de uma tela de uma versão da biblioteca (180 proteínas cinases humanos) realizada utilizando substrato GST-péptido correspondente aos aa 268-283 de rato CRTC2 (reproduzido de Jansson et ai., 2008). MBP, proteína básica de mielina é indicado. O elevado grau de sseleção ubstrate por quinases relacionadas é uma característica da tela. Cada uma das pistas representa os produtos de reacção de um ensaio de cinase distinta. MARK3 (Gel 1) e MARK2 (Gel 16), os únicos quinases para fosforilar TORC2 268-283 peptídeo, são indicadas. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53152/53152fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Identificação de pares Kinase-substrato utilizando High Throughput Screening


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

identification-kinase-substrate-pairs-using-high-throughput

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K visualizações.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

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Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Ensaio de Competição Oligopeptídica para Determinação de Sítio de Fosforilação

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Bioquímica

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

Identificação da quinase Cyclin-dependente 1 sítios de fosforilação específica por uma quinase In Vitro do ensaio

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

Um método simples para identificar quinases que regulam a pluripotência de células estaminais embrionárias por meio de triagem de inibidores de alto rendimento

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Biologia do Desenvolvimento

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Identificação de substratos de quinase CK2 novela usando uma abordagem bioquímica versátil

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

Caracterização no nível molecular usando abordagens bioquímicas robustas de uma nova proteína quinase

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

Triagem de inibidores da quinase em Microarrays de proteínas humanas Automontados

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Doseamento do atividade da quinase de LRRK2 In vitro</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Biologia

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

Estratégia de análise de biopanning e bioinformática baseada em biosensor para a validação global de interações medicamentosas-proteínas

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Bioengenharia

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

High-throughput screening para pequenas moléculas Moduladores de canais de potássio Interiores retificador

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...