עבודה זו נתמכה על ידי מענק NSERC 386634. ברצוננו להודות לחברי המעבדה Screaton לדיונים מועילים.

1. הכנת ריאגנטים, צלחות, ותאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מיליליטר חיץ תמוגה: 25 מ&quot;מ טריס pH 7.5, 150 מ&quot;מ NaCl, 50 מ&quot;מ NAF, 0.5 mM EDTA pH 8.0, 0.5% TritonX-100, 5 מ&quot;מ בטא glycerophosphate, גליצרול 5%. חנות ב 4 מעלות צלזיוס. מייד לפני השימוש, מוסיף dithiothreitol 1 מ&quot;מ (DTT), פלואוריד 1 מ&quot;מ sulfonyl phenylmethyl (PMSF), וvanadate נתרן 1 מ&quot;מ. לאחר שלב זה, PMSF אינו נדרש בכל חיץ לשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 20 מיליליטר של 10x קינאז מאגר: 200 מ&quot;מ טריס pH 7.5, 50 בטא glycerophosphate מ&quot;מ (FW 216), vanadate נתרן 2 מ&quot;מ. Aliquot ב 1 מיליליטר צינורות ולאחסן ב -20 ° C. מייד לפני השימוש, מוסיף 5 מ&quot;מ DTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות 20 מיליליטר של 10x חיץ M-ATP: 300 מיקרומטר אדנוזין טריפוספט (ATP), 66 מ&quot;מ MgCl 2, 33 Aliquot מ&quot;מ MnCl 2. ב 1 מיליליטר צינורות ולאחסן ב -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך של סולפט dodecyl נתרן 2x 100 מיליליטר (SDS) תמוגה חיץ: 1.5 בסיס גרם טריס, 20 מיליליטר גליצרול, H 30 מיליליטר 2 O. ממיסים ולהתאים את ה- pH 6.8 עם HCl. הוסף 40מיליליטר 10% SDS, להתאים את עוצמת קול עד 100 מיליליטר. הוסף 25 bromophenol הכחול מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום 4 μl של 25 ng / פלסמיד ביטוי היונקים μl קידוד GST-קינאז 14 לכל גם בקבוצות של 96 צלחות גם וצלחות תווית בהתאם. צלחות חותם והקפאה ב -20 ° C עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-2 ימים לפני transfection, תאי HEK293T התרבות בנשר הבינוני (DMEM) + 10% בסרום שור עוברי (FBS) שונה Dulbecco המלא ואנטיביוטיקה ב37 ° C חממה בתוספת CO 2 (5% סופיים). מעבר עם טריפסין ואינם מאפשר המניה להפוך&gt; 80% ומחוברות בהרחבה. מינימום של 6 x 10 7 תאים נדרשים עבור המסך (3 x 15 סנטימטר מנות של תאי HEK293T כ בנקודת מפגש 80%). </li></ol> 2. Transfection הערה: ראה איור 1 עבור תרשים זרימה של כל פרוטוקול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם צלחות המכילות פלסמידים קינאז הוקפאו, הפשרה בטמפרטורת חדרND צנטריפוגות ב 1,900 XG במשך 3 דקות כדי לאסוף כל לחות בחלק התחתון של בארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 8.6 מיליליטר של מדיום מופחת בסרום (למשל, OPTI-MEM) עם 312.7 μl של מגיב transfection שומנים מבוסס. בואו לשבת במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl של מדיום סרום מופחת לכל גם באמצעות מצויד בקלטת נפח קטנה מנפק נוזל אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 μl לכל גם בתמהיל מגיב בינוני סרום / transfection המופחת מצעד 2.2 באמצעות מצויד בקלטת נפח קטנה מנפק נוזל אוטומטי. בואו לשבת במשך 20 עד 45 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי Resuspend 293T על 7.5 x 10 5 תאים / מיליליטר ב 80 מיליליטר של DMEM המלא. להוסיף השעיה תא (כלומר 7.5 x 10 4 תאים) 100 μl לכל גם באמצעות מצויד בקלטת נפח סטנדרטית מנפק נוזל אוטומטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו בארות תחת מיקרוסקופ לחלוקת תא אחיד ולחזור לחממה עבור 24 שעות. </li></ol> הנפתח 3. GST-קינאז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך Fפתרון pervanadate 4 מ&quot;מ על ידי ערבוב 60 μl של 0.2 M vanadate נתרן עם 540 μl של H 2 O.: ריש בשילוב צינור שני 2.7 μl של 30% חמצן ו -1.4 מיליליטר של PBS. להוסיף שני פתרונות יחד ולתת לשבת במשך 15 דקות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה רבה (לא משתמש במתקן נוזלי אוטומטי כפי שהוא יוצר יותר מדי מערבולת בבאר) לוותר על 2 μl של 0.25 מ &#39;CaCl 2 בכל טוב, ואחריו 2.5 μl של pervanadate מוכן בשלב 3.1. דגירה כל צלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ולאחר מכן למקם על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 35 מיליליטר של חיץ תמוגה ידי הוספת DTT, PMSF, וvanadate נתרן כפי שצוין בסעיף 1 (הכנת ריאגנטים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על צלחות על קרח, להסיר בינוני מכל גם באמצעות aspirator ואקום. מייד להוסיף 50 μl / טוב של חיץ תמוגה קר כקרח באמצעות מצויד בקלטת סטנדרטית מנפק נוזל אוטומטי. בואו לשבת 30 דקות על קרח לlyse (אופציונאלי: ניתן לעצור כאן במידת צורך על ידי איטום platדואר ואחסון ב -80 ° C. כדי להמשיך, צלחות הפשרה על קרח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות ספין ב1,900 XG במשך 3 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרד תאים מכל טוב בעזרת פיפטה רבה ולהעביר את כל התוכן לכותרתו כראוי צלחות 96 גם V-תחתון. צלחות ספין ב1,900 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך ספין, למלא צלחות גלוטתיון מצופים (אחד לכל צלחת 96-היטב) עם 100 μl / היטב חיץ קרח קר תמוגה (ללא PMSF) כשטיפה. שמור צלחות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר צלחות V-תחתון מצנטריפוגות. אחד בכל פעם, להפוך את צלחות גלוטתיון מעל כיור כדי לנער את מאגר תמוגה והכתם על מגבת נייר. העבר את מאגר תמוגה מהצלחות V-תחתון לצלחות גלוטתיון ידי הטיית הצלחת ובעזרת פיפטה רבה, להיות זהיר, כדי לא להפריע את הכדור בחלק התחתון. לכסות צלחות ולהשאיר על קרח עבור שעה 2 מינימום להיקשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרוב לסוף הצעד המחייב 2 שעות, להכין תחנת עבודה רדיואקטיביות, הבטחה לאהוא אמצעי בטיחות דרוש נמצא במקום עבודת רדיואקטיבי. תנור הכלאה להגדיר עד 30 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 200 מיליליטר של חיץ תמוגה ידי vanadate DTT ונתרן הוספה כאמורה בסעיף 1. PMSF אינו נדרש בשלב זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את צלחות גלוטתיון מעל כיור כדי לנער את מאגר תמוגה ולמחוק על מגבת נייר. בארות לשטוף 3x עם 100 חיץ תמוגה μl (ללא PMSF). אל תתנו לבארות לשבת יבשות - לשמור אותם בשטיפה עד מוכן להמשיך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 55 מיליליטר של חיץ 1x קינאז (KB) על ידי דילול המניות 10x והוספת DTT כפי שצוין בסעיף 1. צלחות לשטוף פעם אחת עם 50 μl של 1x KB באמצעות מצויד בקלטת נפח סטנדרטית מנפק נוזל אוטומטי. השאר 1x KB בבארות עד פתרון מוכן: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון על ידי הוספת 500-530 מיקרוגרם של המצע של עניין, 500 מיקרוגרם של חלבון המיאלין בסיסי (MBP), 2.65 מיליליטר של 10x KB, 13.25 μl של 1 M DTT, ו- H 2 O עד 15.9 מיליליטר. </li></ol></li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד בכל פעם, להפוך את הצלחות מעל כיור כדי להסיר שטיפת KB 1x, למחוק על מגבת נייר, ומייד להוסיף 30 μl של הפתרון באמצעות מצויד בקלטת נפח קטנה מנפק נוזל אוטומטי. שמור צלחות על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון B באזור עבודת הרדיואקטיביות על ידי הוספת 2.5 מיליליטר 10x M-ATP, ATP 32 P 500 gamma- μCi, ו- H 2 O ל -10 מיליליטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של הפתרון B לכל גם באמצעות פיפטה מהדר אשר מסייעת בערבוב בשל כוח פליטה. מכסים ודגירה בתנור הכלאה 30 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות, להעביר צלחות בחזרה לקרח. הוסף 50 μl של חיץ תמוגה 2x SDS זה גם בעזרת פיפטה רבה. יכול להמשיך בשלב זה לשלב הבא, או לאטום את הצלחות בנייר אלומיניום ולאחסן ב -20 ° C עד נוח. </li></ol> 4. ריצה, מכתים, וג&#39;לי ייבוש הערה: כל העבודה צריכה להתבצע בdesigna אזורטד לרדיואקטיביות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל תנור הכלאה ולהגדיר עד 85 מעלות צלזיוס. צלחות הפשרה בטמפרטורת חדר. ברגע שהתנור הגיע טמפרטורה, צלחות העברה לתנור ודגירה של 10 דקות ללפגל דגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עומס 26 היטב מראש יצוק ג&#39;לי עם 15 μl של כל תגובה באמצעות פיפטה רבה כדי למלא כמה בארות ובעונה אחת. יש להקפיד שכל הטיפים ליישר עם מקביל היטב לפני הוספת דגימות. הפעל ג&#39;ל ב 150 V. אל תתנו צבע המעקב (קו כחול) לברוח מתחתית הג&#39;ל כזה מכיל ATP מאוגדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את ג&#39;לי ומנותק ATP מאוגדים (קו כחול) באמצעות אזמל או קצה ישר כפי שהוא יהיה לחשוף יותר מדי הסרטים. מניחים את ג&#39;לי במכולות שכותרתו ולכסות עם כתם Coomassie במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את כתם Coomassie, בקצרה לשטוף את ג&#39;לי עם מים, ולהוסיף destain פתרון. Destain ג&#39;לי עד החלבונים נראים בבירור. להקה לMBP ולהקה למצע צריךיהיה גלוי לכל דגימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבש את ג&#39;לי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך גיליון גדול של נייר סינון ולמקם אותו במייבש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרטיב גיליון צלופן במים מזוקקים עד שהוא חלק ולהתקמט בחינם, ומניח אותו על גבי הנייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את ג&#39;לי על גבי גיליון נייר צלופן, מה שהופך את הערה של סדר ג&#39;לי. להרטיב גיליון צלופן שני ומניח על גבי ג&#39;לים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מרדדים כל הבועות (רולר איטום צלחת עובד היטב עבור זה) למשטח אחיד נחמד. סגור את הדש, להדליק את הוואקום, ולייבש את ג &#39;לים 3 שעות על 80 מעלות צלזיוס. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהג&#39;לי הוא יבשים, לחשוף אותם לסרט XAR באמצעות מסך כדי להגביר את האות. עטוף את הקלטת עם ניילון נצמד או שקית ניילון ולאטום עם קלטת כדי לשמור את כפור. אחסן את הקלטת בלילה -80 ° C. </li></ol> 5. פיתוח XAR סרטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת, להסיר קלטת מהמקפיא ולתת הפשרה בטמפרטורת חדר. לפתח את הסרט בחדר חושך באמצעות מעבד סרט על פי הוראות יצרן. הערה: בדוק את הסרטים לראיות של זוגות קינאז-מצע. חשיפה ארוכה יותר שנייה יכולה להיות שימושית גם כדי לזהות אירועי זירחון חלשים. </li></ol>

<ol>
	<li>Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphopeptide+mapping+and+identification+of+phosphorylation+sites.">Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).</li><li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications.">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS chem. 10, 63-71 (2015).</li><li>Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultradeep+human+phosphoproteome+reveals+a+distinct+regulatory+nature+of+Tyr+and+Ser/Thr-based+signaling.">Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling.</a> Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).</li><li>Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , (2006).</li><li>Boersema, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+qualitative+and+quantitative+profiling+of+tyrosine+phosphorylation+using+a+combination+of+phosphopeptide+immunoaffinity+purification+and+stable+isotope+dimethyl+labeling.">In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).</li><li>Hutti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+protein+kinase+phosphorylation+specificity.">A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity.</a> Nat Methods. 1, 27-29 (2004).</li><li>Johnson, S. A., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinomics:+methods+for+deciphering+the+kinome.">Kinomics: methods for deciphering the kinome.</a> Nat Methods. 2, 17-25 (2005).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+regulatory+systems+through+protein+interaction+domains.">Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains.</a> Science. 300, 445-452 (2003).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+yeast+protein+kinases+using+protein+chips.">Analysis of yeast protein kinases using protein chips.</a> Nat Genet. 26, 283-289 (2000).</li><li>Shah, K., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+approach+for+the+identification+of+direct+substrates+of+protein+kinases.">A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases.</a> Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).</li><li>Zou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKIS:+computational+identification+of+protein+kinases+for+experimentally+discovered+protein+phosphorylation+sites.">PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites.</a> BMC bioinform. 14, 247 (2013).</li><li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+active+and+kinase-deficient+kinome+collection+for+identification+of+kinases+regulating+hedgehog+signaling.">Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling.</a> Cell. 133, 537-548 (2008).</li><li>Jansson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+controls+CREB+activity+in+islet+cells+via+regulated+phosphorylation+of+TORC2.">Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).</li><li>Fu, A., Screaton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+kinomics+to+delineate+signaling+pathways:+control+of+CRTC2/TORC2+by+the+AMPK+family.">Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family.</a> Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).</li><li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion.">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome.">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מאז הפרסומים המקוריים המתארים את הגישה 14,15, הספרייה המקורית של 180 GST-קינאז הורחבה 420 חברים, או ~ 80% מkinome החלבון האנושי. עם הספרייה המורחבת, הפרוטוקול כפי שתואר לוקח 4-5 ימים ולאחר מכן 1-4 ימים כדי לפתח סרטים (כהכרחי), אשר יכול להתקצר על ידי שימוש בphosphorimaging ושיפור אותות דיגיטלי. יש כמה שלבים עיקריים שבו יש להקפיד (ראה איור 1 לסקירה של פרוטוקול). ראשון, היא הבריאות של המניה של תאים (mycoplasma חופשי, לא אפשר להגיע למפגש בהרחבה, וטופל בטריפסין בכל קטע) בשלב ההרחבה אצווה וב96 הצלחות גם בזמן של transfection. תאים צריכים להיות אחיד זרע, ומחוברות 80% כאשר transfection מתרחש (שלב 1.5). שנית, הוא אידיאלי במהלך transfection להשתמש מנפק נוזל אוטומטי כדי למזער transf נפחטעויות אה, ובכך להגביל מקדם של וריאציות (&quot;cvs&quot;) בין בארות. לנפחים קטנים, מתאימים מנפק עם אובדן מגיב גבולות קלטת נפח קטן יותר בשל כרכים מתים מופחתים ועלייה מחלק דיוק. צעד הטיפול בpervanadate נתרן, מעכב phosphatase טירוזין מחבת, משמש כגירוי כללי להגדיל מעמד זירחון של קינאזות היעד. הכללה של סידן בשלב זה מגבירה הידבקות התא-מטריקס, מניעת אובדן תא בגלל עיגול שהושרו על ידי טיפול pervanadate ממושך. צעד זה צריך להיעשות עם הקפדה על זמן דגירה של 10 דקות. שלישית, לassay קינאז עצמו, יש כמה שיקולים בעת בחירת מצע רקומביננטי: פפטידים, תחומים חלבון, או חלבונים שלמים גדולים כמו 120 kDa ניתן להשתמש בכל. אם אתר זירחון ספציפי ידוע, מצע פפטיד הוא הגישה הכי ישר קדימה, אבל צריך להיות גדול מספיק כדי לזהותעל ג&#39;ל SDS-PAGE. לפיכך, ניתן התמזגו מצעי פפטיד לGST ומטוהרים מחיידקים לתת MW של&gt; 25. יש חלבונים גדולים יותר היתרון כי הם סביר מקופלים ושאריות phosphorylatable נחשפו כפי שהם יהיו בתא, עדיין מגיעים עם החסרון שהם יכללו שאריות נוספות שיכול להיות פוספורילציה ולתת אות בassay. ההעדפה שלנו היא להפעיל מסך באמצעות מצע פפטיד המורכב מחומצות אמינו המקיפות 15-20 שאריות שידועה שphosphorylated in vivo וידוע להסדיר אירוע ביולוגי, כמו זה הופך אימות של קינאזות המועמד מהמסך שני במבחנת in vivo הרבה יותר מהר. אחרון, באופן אידיאלי הסכום של גישות חלבון או עולה 1 מיקרוגרם לכל גם; זה כמובן משתנה עם MW של המצע. חלבון פחות לכל גם יכול להניב להיטים משמעותיים, אבל &quot;יותר הוא טוב יותר&quot; כלל חל כפי שהוא מגביר אות: NOISE. סטנדרטי, ג&#39;לי ללא שיפוע מומלץ כג&#39;לי שיפוע לפצח לעתים קרובות מדי במהלך ייבוש. לאחר ייבוש ג&#39;ל, זיהוי של אות רדיואקטיבי על רקע עם מונה גייגר נותן אינדיקציה מצוינת להצלחה של assay של. כמסך הוא במבחנה ורמות נוספות של מורכבות קיימות in vivo, קינאז מועמד (ים) למצע נתון חייב להיות מאומת בתאים. באופן ספציפי, המסך עשוי מבני משפחה שיש לו את היכולת ביוכימיים לphosphorylate המצע במבחנה, עדיין לא באה לידי ביטוי באותו סוג התא או בתא subcellular כמצע לזהות. לדוגמא, בעוד MARK2 וMARK3 היו שני הלהיטים במסך לקינאז שיכול phosphorylate CRTC2 על Ser275, רק MARK2 יצר מורכב עם המצע בתאים 14. להלן סדרה של ניסויים נוספים שניתן להשתמש בי כדי לאשר את הרלוונטיות הפיזיולוגיות של קינאז מועמד. אשוחרח, משמרות ניידות של המצע על SDS-PAGE הבא Coexpression של קינאז המועמד יכול לשמש כביקורת אישור. בקרות מתאימות כגון cotransfection של קינאז catalytically פעיל יכולות לאשר סגוליות. שנית, את המצע ניתן immunoprecipitated מתמציות תא שכבר מודגרות עם 32 P-orthophosphate כדי לאשר התאגדות של פוספט לתוך המצע בנוכחות wildtype ולא קינאז catalytically לא פעיל. שלישית, נוגדן phosphospecific יכול להיות שנוצר נגד רצף phosphoacceptor (אם ידוע) ומשמש כדי לאשר עלייה בזירחון מצע כאשר קינאז מבוטא ביתר. מסך המשני באמצעות מצע מוטציה נושא שאריות הלא phosphorylatable באתר היעד יכול לאשר סגוליות לפני הדור של phosphoantibody, שליטה חשובה במיוחד עם מצעי תחום גדול וחלבון באורך מלא. עיכוב תרופתי גישות לעכב קנדייכול לשמש גם קינאז תאריך, עדיין יש להיזהר כמו עיכוב של קינאזות קשורה הוא מציאות אינה מוערכת. אחרון, RNAi בתיווך ההשתקה של קינאז המועמד (ים) בתאים ואחרי ומערבי סופג לפקח אובדן זירחון אתר היעד עם נוגדן phosphospecific יכול להתבצע.

שינויי חלבון לאחר translational (PTMs) חיוניים לתקשורת תאית. אולי הכי טוב למדו מכל PTMs הוא זרחון, מזורז על ידי קינאז חלבון, המסדיר את מספר עצום של פונקציות חלבון, כוללים הפעילות ביוכימית שלהם, לוקליזציה subcellular, קונפורמציה, ויציבות. זיהוי של אתרי זירחון על חלבוני יעד יכול להתבצע על ידי מיפוי phosphopeptide tryptic או על ידי טכניקות proteomic עכשיו סטנדרטיות באמצעות דגימות מועשרים לפפטידים phosphorylated 1,2. בעוד שלושה רבעים מproteome הביעה צפויים להיות phosphorylated 3 וזיהה 200,000 אתרי זירחון 5, עם הערכות עד 1 מ&#39;6, רבים מהם אין לי ביולוגיה הוקצתה, מסלול איתות, או חלבון kinase. בעוד זיהוי של אתרי פוספורילציה הוא יחסית פשוט, אתגר גדול יותר הוא יחסיתלזהות אותו מקור קינאז (ים) שמכוון את האתרים הללו, תהליך שאנו מכנים קינאז מיפוי: זוגות מצע. מספר גישות לזיהוי קינאז: זוגות מצע תוארו, או מתחיל עם קינאז של עניין ומחפש מצעים שלה או מתחיל עם מצע של עניין ומנסה למצוא קינאז שינוי בניסוי 7-11 או המחשוב 12. לזהות קינאזות למצע phosphorylated ידוע, ניתן להשתמש ביואינפורמטיקה לזהות חלבונים המכילים רצף נשמר קצר של חומצות אמינו משני צדי שאריות פוספורילציה (אתר הקונצנזוס), כמו גם זיהוי קינאז היוצרים מורכב precipitable עם המצע. עם זאת, גישות אלה הן זמן רב ולעתים קרובות אינו עומדות בהצלחה. פיתחנו גישה פונקציונלית שיטתית לזהות במהירות קינאז שיכול phosphorylate מצע נתון 13. Assay המסך מייצר ספציפי מצוינתity, עם מבחר מאוד ברור לקינאז מקור הפוטנציאלי. בהתחשב במרכזיותה של זירחון לאיתות ביולוגית, המסך שימושי לגילוי במסלולי איתות כמעט בכל תא 14-16. המסך כולל ביצוע assay קינאז בקנה מידה גדולה עם ספרייה של קינאזות חלבון האנושית. קינאז תויג עם S-transferase גלוטתיון חיידקי חלבון (GST) והם מטוהרים מתמציות תאים יונקים, מה שאומר שאנזימי רקומביננטי - בניגוד לאלה שהוכנו מחיידקים - נוצרים בנוכחות חלבון קינאז במעלה הזרם לעתים קרובות נדרש ל אנזימי רקומביננטי יש פעילות במבחנה. ואכן, תוך פעילות קינאז סרין, תראונין, וטירוזין קינאז הנדרשת להפעלה במורד הזרם נמצא בשמרים 10, שמרי הגנום מקודד חלבון קינאז 122, המציין כי kinome היונקים, עם למעלה מ -500 גנים 17, הפך באופן משמעותי יותר מורכב כדי Regulate התהליכים ייחודיים לאורגניזמים מסדר גבוהים יותר. יתר על כן, ההשפעה של גירויים שונים רלוונטיים לביולוגיה של תא ומחלות של בני אדם (כגון מולקולות קטנות, גורמי גדילה, הורמונים, וכו &#39;) יכולה לשמש לפעילות קינאז 14,15 לווסת בהקשר מתאים.

<table><tbody><tr><td>Lysis buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.1</td></tr><tr><td>10x kinase buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.3</td></tr><tr><td>Human kinase plasmids</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST-tagged in house</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>supplement with 100&amp;nbsp;U/ml penicillin, 100&amp;nbsp;&amp;#956;g/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm cell culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipid-based transfection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Standard cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM pervanadate</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (20-200 &amp;#956;l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (1-10 &amp;#956;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 6-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione coated 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST tagged substrate</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myelin Basic Protein (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Repeater pipette (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS lysis buffer (100&amp;nbsp;ml)</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.4</td></tr><tr><td>26-well precast TGX gels</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest</td></tr><tr><td>Coomassie stain</td><td>Made in house</td><td></td><td>0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Made in house</td><td></td><td>10% acetic acid, 20% methanol</td></tr><tr><td>Labeled gel containers</td><td>Made in house</td><td></td><td>Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel</td></tr><tr><td>Whatman filter paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Cellophane sheets (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Gel dryer</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Double emulsion autoradiography film</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Film cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Intensifying screen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealing rubber roller</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinase-substrate pairs using high throughput screening

פיתחנו פלטפורמת הקרנה לזהות קינאזות חלבון האנושית ייעודית למצעי phosphorylated אשר יכול לשמש כדי להבהיר מסלולי העברת אותות רומן. הגישה שלנו כוללת שימוש בספרייה של קינאזות חלבון אנושי מתויג GST מטוהר ומצע חלבון רקומביננטי של עניין. השתמשנו בטכנולוגיה זו כדי לזהות קינאז MAP / microtubule ויסות זיקה 2 (MARK2) כקינאז לאתר מוסדר גלוקוז על-מוסדר CREB תעתיק Coactivator 2 (CRTC2), חלבון דרוש להתפשטות תאי ביתא, כמו גם משפחת אקסל של טירוזין קינאז כרגולטורים של גרורות תא על ידי זירחון של חלבון המתאם ELMO. אנו מתארים את הטכנולוגיה הזו ולדון איך זה יכול לעזור להקים מפה מקיפה של כמה תאים מגיבים לגירויים סביבתיים.

נציגי תוצאות ממסך מוצגות באיור 2. 180 קינאז הוקרן באמצעות מצע פפטיד GST מתויג המתאים לaa 268-283 מCRTC2 כמו גם חלבון המיאלין מצע assay קינאז הקלאסי הבסיסי (MBP). רק שתי קינאזות, MARK2 וMARK3 קינאז הקשורים מאוד phosphorylated פפטיד CRTC2. MBP נכלל כבקרה פנימית בכל מבחני, כפי שהוא מכיל הרבה שאריות phosphorylatable ופועל ב -18 kDa, לכיוון החלק התחתון של הג&#39;ל. זה מאפשר לפרשנות של סגוליות: כמה קינאז חסונה יהיה phosphorylate מצע וMBP. ראוי לציין כאן הוא שהבארות המכילות GST לבד (כלומר לא שולט קינאז) תמיד לטהר כמה פעילות קינאז אנדוגני, וכך תמיד יש זירחון רקע בassay. אמנם זה לא פוסל את זה זירחון של המצע הוא אמיתי, זה מצביע על כך שבמבחנה הגדרת קינאז עשוי להיות פחות בררן.זה במיוחד אינפורמטיבי לכלול מצעים מרובים של MW שונה כדי להסיק מסקנות לגבי סגוליות קינאז-מצע. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig1.jpg" /> איור 1. תרשים זרימה המציגה שלבים עיקריים בפרוטוקול. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53152/53152fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig2.jpg" /> איור 2. דוגמא של תוצאת מסך. Autoradiographs של מסך של גרסת 1 של הספרייה (180 קינאזות חלבון האנושית) בוצע באמצעות מצע GST-פפטיד המקביל לaa 268-283 של CRTC2 עכבר (לשכפל מJansson et al., 2008). MBP, חלבון המיאלין בסיסי מצויינים. הרמה הגבוהה של יםבחירת ubstrate ידי קינאז קשור היא תכונה של המסך. כל מסלול מייצג את המוצרים מתגובת assay קינאז מובחן. MARK3 (ג&#39;ל 1) וMARK2 (ג&#39;ל 16), קינאזות רק לphosphorylate TORC2 268-283 פפטיד, מצוינים. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53152/53152fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening at JoVE.com

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

identification-kinase-substrate-pairs-using-high-throughput

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Views.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Video: Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

Oligopeptide Assay תחרות עבור זרחון קביעת האתר

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

זיהוי של קינאז תלוי-Cyclin 1 אתרי זירחון ספציפיים על-ידי קינאז במבחנה Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

שיטה פשוטה לזהות קינאזות כי לווסת עובריים גזע עובריים גזע על ידי תפוקה גבוהה מעכב הקרנה

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Developmental Biology

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

זיהוי של סובסטרטים קינאז CK2 הרומן תוך שימוש בגישה הביוכימי רב-תכליתי

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

אפיון ברמה המולקולרית באמצעות גישות ביוכימיות איתנות של חלבון קינאז חדש

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

הקרנת מעכבי קינאז במיקרוערכים של חלבון אנושי מורכב בעצמו

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

Assaying פעילות קינאז של LRRK2 במבחנה</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

ביו-panning מבוסס Biosensor ואסטרטגיית ניתוח ביואינפורמטיקה לאימות גלובלי של אינטראקציות עם חלבונים תרופתיים

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Bioengineering

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

הקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה הקטנה של ערוצי אשלגן מיישרים פנימה

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

חיטוט Microarrays חלבון פונקציונלי בצפיפות גבוהה לזיהוי חלבונים אינטראקציות

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...