Name: a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening
Uploaded: 2017-05-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

CACWは、医学研究評議会博士課程学生の支援を受けています。 GMFは、Medical Research CouncilのNew Investigator Award（MR / N000609 / 1）およびTenovus Scotlandの研究助成金によって一部サポートされています。

1.低分子キナーゼ阻害剤ライブラリーの照合<ol><li>ハーバードメディカルスクールの統合ネットワークベースの細胞シグネチャー（LINCS）ライブラリー、228の強力かつ選択的なキナーゼ阻害剤（http://lincs.hms.harvard.edu）の標的収集物など、公開されているキナーゼ阻害剤コレクションのインヒビターライブラリーを、 、および酵素キナーゼ阻害剤セット（PKIS）は、産業研究者（https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS）によって組み立てられた376の化合物コレクションである13 。あるいは、市販の化合物から注文されたキナーゼ阻害剤コレクションを組み立てる。 注：私たちの研究室では、51の一次標的キナーゼをカバーする72種類の強力かつ選択的なツールキナーゼ阻害剤を集めました。これらはすべて商業的な情報源から入手できます。 </li><li>複数の濃度で最適なハイスループット処理を行うために、キナーゼインヒビターを96ウェルプレートに組み込む（1,1,0 and 0.01mM）。ナイーブおよびプライムされた多能性状態をそれぞれ促進することが知られている、DMSOのみを含有する各プレート対照ウェルおよび参照対照インヒビターPD173074（FGFRi）およびルキソリチニブ（JAKi）を含む。スプレッドシートまたは類似のソフトウェアに注釈を付ける。 </li></ol> 2. mESC培養条件とスクリーン作製の手順<ol><li> 0.1％（w / v）ゼラチン5mLを10cmプレートに添加して0.1％ゼラチン被覆10cm皿を調製し、室温で5分間インキュベートする。ゼラチンを吸引し、プレートを2分間乾燥させる。 </li><li> 100ng / mLのGST-LIF、10％のウシ胎仔血清および5％のノックアウト血清を含有する標準mESC培地（ 材料表参照）中の0.1％ゼラチンコート10cmディッシュ上の37℃5％CO 2での任意の標準mESC系統を培養する。置換。培地を毎日交換し、継代mESCを2日毎に約80％コンフルエンシーで1：5〜1：10の希釈率で交換する。 </li><li> mESCを通過させるために、培地を吸引し、5mLの水で洗浄する（PBS）をプレートあたり1個ずつ含む。 </li><li> 1mLのmESCsあたり1mLのトリプシン-EDTA（0.05％トリプシン、0.02％EDTA）を添加し、37℃で10分間インキュベートする。 </li><li>トリプシン処理した細胞を4mLのmESC培地に再懸濁し、1,200rpmで5分間遠心分離する。 </li><li>徹底的に細胞ペレットを5mLのmESC培地に再懸濁し、上下にピペッティングして単一細胞懸濁液を生成する。 </li><li> 10μLの細胞懸濁液と10μLのTrypan Blue（0.4％）を組み合わせて細胞を計数する。細胞計数室に置くか、または血球計算盤および光学顕微鏡を使用する。 </li><li>マルチチャンネルピペットを使用して、0.1％ゼラチンコートした96ウェルプレートに3×10 3個の mESCを最終体積100μLで播種する。 </li><li>マルチチャネルピペットを使用して、1：100希釈（1μL阻害剤を100μLの培地に加えた）でキナーゼ阻害剤を適用する。穏やかに培地を混合し、阻害剤と細胞懸濁液を混合し、細胞が均一な分布のアクロを確保するために1時間組織培養フードに定着することを可能にするめっき表面はssです。培地を交換することなく48時間培養した。 注：1 / 0.1 / 0.01mMのストックプレートは、それぞれ10/1 /0.1μMの最終阻害剤濃度を与えるであろう。オフターゲット効果を最小限に抑えながら一次標的キナーゼの効果的な阻害を確実にするために、1μMの最終濃度でスクリーニングを開始することを推奨する。 </li></ol>キナーゼ阻害剤スクリーニング分析<ol><li>マルチチャネルアスピレーターとピペットを使用して200μLのPBSで96ウェルmESCプレートを洗浄する。 </li><li> 150μLの溶解緩衝液（20mM Tris pH7.4,150mM NaCl、1mM EDTA、1％NP-40（v / v）、0.5％デオキシコール酸ナトリウム（w / v）、10mMβ-グリセロホスフェート、10mMのピロリン酸ナトリウム、1mMのNaF、2mMのNa 3 VO 4 、完全プロテアーゼインヒビターカクテル錠剤）。 </li><li> V底96ウェルプレート中で1,500×gで30分間遠心分離して抽出物を清澄化する。 </li><li> 100μLの上清をニトロセル上に固定化する96穴バキュームドットブロットマニホールドを使用して1μgの膜で洗浄した。 </li><li>膜を乾燥させ、40mLのPonceau Sで染色して一貫した転写を確実にする。 </li><li>膜をTBSTで洗浄し、TBST / 3％（w / v）ミルク中でブロックする。 </li><li> TBST / 3％（w / v）のミルクパウダー中で1：1,000（v / v）の希釈度で一晩、NanogおよびDnmt3b抗体をインキュベートする。 </li><li>膜をTBST中で3×10分で洗浄し、TBST / 3％（w / v）ミルク中で1：10,000（v / v）の希釈で30mLの二次抗体中でインキュベートする。 </li><li>デジタルイムノブロッティングイメージングシステムを使用して開発します。 注：可能であれば、定量的蛍光イムノブロッティングを使用してNanogおよびDnmt3bを検出します。しかし、蛍光イムノブロッティングによるDnmt3bのバックグラウンドシグナルは高すぎます。したがって、800nmの蛍光抗ウサギ（Nanog）および抗マウスHRP（Dnmt3b）二次抗体が使用される。 </li></ol> 4.真正多能性調節因子としてのスクリーニングデータの解析と阻害剤の検証<ol><li>イムノブロッティング解析ソフトウェアを使用してNanogおよびDnmt3bシグナルを定量し、スプレッドシートまたは同様のソフトウェアに値をインポートします。 DMSOコントロールと比較して、すべてのサンプルについてNanog：Dnmt3b比を計算する。また、キナーゼ阻害剤がmESC生存率を変化させることによってNanog：Dnmt3b比に影響しないことを確実にするために、全NanogおよびDnmt3bシグナルを決定する。 </li><li>ナイーブ多能性（Nanog：対照より高いDnmt3b比）およびプライムされた多能性（Nanog：対照よりも低いDnmt3b比）を促進する阻害剤を同定するために、ランク付けされたNanog：Dnmt3b比を使用する。コントロール値から2倍の偏差でカットオフを設定し、合計Nanog + Dnmt3bシグナルを生成するキナーゼ阻害剤を除外するナイーブ（高Nanog：Dnmt3b比）および下塗り（低Nanog：Dnmt3b比）多能性状態を安定化させるキナーゼ阻害剤の高い信頼性のリストを生成するために、DMSO対照値の50％。 </li><li> 2mLの培地で6ウェルあたり2×10 5個の細胞にmESCを播種し、培地を交換することなく、1μMで48時間、キナーゼ阻害剤を添加することにより、キナーゼ阻害剤を検証する。 </li><li>溶解緩衝液中のmESCを溶解し、従来のSDS-PAGEイムノブロッティングによりNanogおよびDnmt3b発現を分析する。 </li><li>ナイーブ多能性マーカーKlf2およびKlf4、およびOct4についてのSDS-PAGEイムノブロッティングによるヒットをさらに検証し、48時間のインヒビター処置後に多能性が維持されることを確実にする。 </li></ol>

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).</li><li>Nichols, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Naive+and+primed+pluripotent+states.">Naive and primed pluripotent states.</a> Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).</li><li>Boroviak, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage-Specific+Profiling+Delineates+the+Emergence+and+Progression+of+Naive+Pluripotency+in+Mammalian+Embryogenesis.">Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis.</a> Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).</li><li>Tesar, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+cell+lines+from+mouse+epiblast+share+defining+features+with+human+embryonic+stem+cells.">New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells.</a> Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).</li><li>Brons, I. G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+pluripotent+epiblast+stem+cells+from+mammalian+embryos.">Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos.</a> Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).</li><li>Festuccia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Esrrb+is+a+direct+Nanog+target+gene+that+can+substitute+for+Nanog+function+in+pluripotent+cells.">Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells.</a> Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).</li><li>Ficz, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+signaling+inhibition+in+ESCs+drives+rapid+genome-wide+demethylation+to+the+epigenetic+ground+state+of+pluripotency.">FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency.</a> Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Klf4+reverts+developmentally+programmed+restriction+of+ground+state+pluripotency.">Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency.</a> Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).</li><li>Chambers, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanog+safeguards+pluripotency+and+mediates+germline+development.">Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development.</a> Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).</li><li>Findlay, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+domains+of+Sos1/Grb2+are+finely+tuned+for+cooperative+control+of+embryonic+stem+cell+fate.">Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate.</a> Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).</li><li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3.">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).</li><li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FGF+stimulation+of+the+Erk1/2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment.">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).</li><li>Elkins, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+characterization+of+the+Published+Kinase+Inhibitor+Set.">Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set.</a> Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).</li><li>Williams, C. A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erk5+Is+a+Key+Regulator+of+Naive-Primed+Transition+and+Embryonic+Stem+Cell+Identity.">Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity.</a> Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).</li><li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conversion+of+human+fibroblasts+into+functional+cardiomyocytes+by+small+molecules.">Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules.</a> Science. 352 (6290), (2016).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+reprogramming+of+fibroblasts+into+neural+stem+cells+by+signaling-directed+transcriptional+activation.">Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation.</a> Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).</li></ol>

著者らは、この研究から生じる利害の衝突を宣言していない。

ここでは、ナイーブプライム多能性移行の制御におけるキナーゼシグナル伝達経路の役割を調べるための広くアクセス可能な方法論を示す。これは、ESC分野の重要な問題に取り組んでいます。ナイーブおよびプライムされた多能性状態の主要な転写調節因子を同定するために、ハイスループットのゲノミクスおよび転写ミックスアプローチが日常的に使用されているが、多能性シグナル伝達ネットワークを解明することは困難であることが判明している。私たちは今、mESCにおけるナイーブプライム多能性転移を制御するキナーゼを同定するために、化学的インヒビターを用いる柔軟な戦略を提供する。これは、細胞シグナリングおよびESC生物学を研究するほとんどの研究所で利用可能な単純な機器、試薬および材料に依存する。このプラットフォームの成功にとって重要なのは、ナイーブおよびプライムド多能性状態間の移行を定量化するための堅牢なアッセイの開発です。このアッセイを確立するためには、細胞プレート密度、インヒビターインキュベーション時間およびイムノブロッティング条件。 小分子アプローチは、治療用ESCアプリケーション15,16における合理的使用のための牽引力を獲得している。小分子スクリーニングの主要な強みは、効率的な細胞摂取のためにツール化合物が設計および/または修飾されていることである。トランスフェクション効率は限定されず、レンチウイルスなどの危険な送達系の使用は必要ではない。さらに、インヒビターは、R​​NAiおよびCRISPR / Cas9のような遺伝的/ゲノム干渉技術を妨げる機能的重複を克服する、キナーゼファミリー内の複数のアイソフォーム（ 例えば、 Fgfr1-4、Jak1-3）をしばしば阻害する。より強力で選択的なツール化合物が学術および医薬品創薬プログラムの両方から入手可能になるにつれて、十分に理解されていないキナーゼは、ESC研究の最前線に押し出されます。したがって、我々は、この高いラウンド・プット・スクリーニング・アプローチは、ESCの中核的な規制ネットワークの研究の新たな道を開きます。 この技術の1つの小さな制限は、最も強力で選択的な小分子阻害剤でさえもインビボで複数の無関係なキナーゼに関与し、阻害することである。しかしながら、ますます包括的なキナーゼ阻害剤プロファイリングデータは、キナーゼ阻害剤の機能的標的を容易に同定することを可能にする（http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase - 阻害剤）。最後に、原理的には、高品質イムノブロッティング抗体が利用可能な小分子収集および/または細胞アッセイを調べるために、我々のプラットフォームを適用することができる。これにより、多能性調節における複数の調節系の研究が可能になり、多様な細胞プロセスを改変する小分子阻害剤の同定が容易になる。具体的には、本発明者らは、エピゲンのような新生小分子コレクションStructural Genomics Consortium（http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics）によって開発されているticプローブは、多能性移行のさらなる新規レギュレーターを明らかにする可能性を秘めています。

胚性幹細胞（ESC）は、多能性1として知られる現象である、成体における任意の細胞型に自己複製または分化する能力を有する。最近の証拠によれば、発達的に異なる多能性状態が存在し、「ナイーブ」および「プライミング」多能性2と呼ばれる。ナイーブESCは、着床前胚3に見られるものと同様の発達状態を表す。対照的に、初回刺激多能性ESCは、多能性を終了し、特殊な胚系統に分化する4,5 。 ナイーブおよびプライムされた多能性状態は、異なる遺伝子調節ネットワークによって特徴付けられる。ナイーブ多能性は、Nanog、Krueppel様転写因子（Klfs）、Rex1 2およびEsrrbなどの主要多能性転写因子の発現によって特徴付けられる<supclass = &quot;xref&quot;&gt; 6。マウスESC（mESC）では、プライミングされた多能性は、ナイーブマーカーの発現の減少、および特異的なDNAメチルトランスフェラーゼDnmt3b 7を含む特定の遺伝子発現サインを特徴とする。 インビボで 、初回刺激多能性移植後胚盤葉幹細胞（EpiSC） 4,5 は 、EpiblastマーカーFgf5およびBrachyury 8のような系統プライミングのマーカーをさらに発現する。 mESCは、 in vitroでナイーブプライミング多能性移行を制御する機構をプローブするための扱いやすいモデルを提供する。白血病抑制因子（LIF）およびウシ胎児血清（FBS）で培養すると、mESCはナイーブおよびプライムド多能性状態の間で動的な移行を起こす9,10 。ナイーブな遺伝子調節ネットワークを促進するLIF-Jak-Stat3シグナル伝達機能11 </線維芽細胞増殖因子4（Fgf4）Erk1 / 2経路を介した自己分泌シグナル伝達は、初回刺激状態12への移行を促進する。しかしながら、異なる多能性状態を特定する際のプロテインキナーゼの役割を系統的に評価することは依然として課題である。 ここでは、ナイーブプライム化多能性移行のキナーゼ調節剤のための標的化された小分子スクリーニングを行うための定量的かつスケーラブルなプラットフォームを説明する。私たちは単純なmESC培養条件と標準的な試薬、材料と機器を使用して、これまで知られていなかった未知の多能性を安定化させるキナーゼ阻害剤を発見して検証します。さらに、エピジェネティックレギュレーターを標的とする新興インヒビターライブラリーのような他の小分子コレクションのスクリーニングを含む、この技術の潜在的な応用を議論する。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;mESC media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CCE mESCs</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;nbsp;SCRC-1023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Media</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>Final: 2 mM</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Final: 50 U/ml</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>Final: 0.1 mM</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor (GST fusion)</td><td>MRC-PPU reagents and services</td><td></td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Thermo</td><td>PMC9484</td><td>Final: 100 ng/mL</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Final: 0.1 mM</td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Final: 1 mM</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828-028</td><td>Final: 5%</td></tr><tr><td>Defined Fetal Bovine Serum</td><td>Fisher</td><td>10703464</td><td>Final: 10%</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;TC materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red</td><td>Thermo</td><td>25300054&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Sigma</td><td>1890</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96-Well Microplates</td><td>Thermo</td><td>156545</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, no calcium, no magnesium</td><td>Gibco</td><td>14190136</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96 well plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>651261</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Lysis Buffer&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>VWR</td><td>97061</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>1% NP-40</td><td>Sigma</td><td>9016-45-9</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Deoxycholate</td><td>Sigma</td><td>D6750-100g</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-glycerophosphate</td><td>Sigma</td><td>G9422</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyrophosphate</td><td>Sigma</td><td>13472-36-1</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>Sigma</td><td>450022</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>Roche Complete Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td><td>Sigma</td><td>CO-RO</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Milk Powder</td><td>Marvel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Western Blotting&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 &amp;micor;M&amp;nbsp; Pore size (20 cm x 20 cm Sheets) (25 Sheet)</td><td>GE</td><td>10401191</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P7170-1L</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Laboratory Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minifold I System</td><td>GE</td><td>10447850</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc imager</td><td>BioRad</td><td>1708280&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>LiCor Odyssey Imager</td><td>LiCor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse Nanog</td><td>Reprocell</td><td>RCAB001P</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Dnmt3b</td><td>Imgenex</td><td>IMG-184A</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Donkey anti-Rabbit</td><td>Licor</td><td>926-32213</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse-HRP</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf2</td><td>Millipore</td><td>09-820</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Klf4</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AF3158</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Oct4</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td></td></tr></tbody></table>

a simple method to identify kinases that regulate embryonic stem cell pluripotency by high-throughput inhibitor screening

胚性幹細胞（ESC）は、自己複製するか、または多能性として知られる現象であるすべての細胞型に分化することができる。明確な多能性状態が記載されており、「ナイーブ」および「下塗り」多能性と呼ばれる。ナイーブプライム遷移を制御するメカニズムはあまり理解されていません。特に、我々は、キナーゼ機能をプローブするための高品質のツール化合物の利用可能性が高まるにもかかわらず、ナイーブ及びプライムされた多能性状態を指定するプロテインキナーゼについて十分に知られていないままである。ここでは、マウスESCにおけるナイーブプライム化多能性転移のキナーゼ調節剤のための標的化された小分子スクリーニングを実施するためのスケーラブルなプラットフォームを記載する。このアプローチは、単純な細胞培養条件および標準的な試薬、材料および装置を利用して、多分化能に対するこれまで評価されていない効果を有するキナーゼ阻害剤を明らかにし、検証する。我々は、この技術の潜在的な用途について論じている。これには、他の小分子ますます洗練されたキナーゼ阻害剤やエピジェネティックなツール化合物の新興ライブラリーなどのコレクションです。

ここに示した手順（ 図1 ）を用いて、mESC多能性を調節するものを同定するために、228の強力かつ選択的なキナーゼ阻害剤のLINCSライブラリーをスクリーニングする。ライブラリーは、1：100希釈については0.1mMの濃度で、mESCでは1μMの最終スクリーニング濃度で調製する。 48時間後、mESCを溶解し、NanogおよびDnmt3b発現の定量的ドットブロット分析のために抽出物を調製した（ 図2 、上）。他のスクリーニング濃度の結果は、簡潔にするためにここには示していない。 Nanog：各キナーゼ阻害剤および化合物ランクでDnmt3b比を決定し、2倍カットオフを適用する（ 図2 、下）。コントロールに対する全NanogおよびDnmt3bシグナルをインヒビターランキングに重ね、0.5xカットオフに供して、有意なmESC毒性を示すインヒビターのトリアージを可能にする。ナイーブStaを安定化させるキナーゼ阻害剤を選択するteは、従来のNanog / Dnmt3bイムノブロッティング（ 図3 ）を用いて検証されている。これらの阻害剤の主要キナーゼ標的を表1に示す 。我々はまた、このスクリーニングの適用可能性が、下塗り状態14を安定化させるインヒビターを同定することを実証している。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig1.jpg" /> 図1：ナイーブプライミング移行を調節するキナーゼ阻害剤のスクリーニングのためのワークフロー。 mESCを、1μMの最終濃度で228化合物キナーゼ阻害剤ライブラリーで処理した。溶解物を調製し、免疫ドットブロット分析のためにニトロセルロース膜上に移し、NanogおよびDnmt3bレベルを決定した（図はWilliams ら 14から適合した）。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55515/55515fig1large.jpg" target="_blank">他を見るにはここをクリックしてください</a><html>この数字のアーガーバージョン。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig2.jpg" /> 図2：ナイーブプライム化多能性スクリーニング分析およびインヒビター同定。 （Top）代表的なNanogおよびDnmt3bイムノドットブロット画像。 （底部）各キナーゼ阻害剤についてのNanogおよびDnmt3b値をDMSO対照に対して決定し、Nanog：Dnmt3b比および全相対Nanog + Dnmt3bシグナルを決定し、阻害剤をDMSO対照と比較してランク付けした。 DMSO対照の2倍の閾値を超えるNanog：Dnmt3b比を変更することが判明した阻害剤は、ナイーブまたはプライムされた多能性の原動力として同定された。 DMSO対照より2倍低い閾値は、mESC生存を損なうトリアージインヒビターに設定した。さらなる確認のために選択された阻害剤が強調表示されている。 （図はWilliams ら 14から適応されている ）。s / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt;この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55515/55515fig3.jpg" /> 図3：選択されたヒット化合物の確認。 mESCを、1μMAZD4547（選択的FGFR阻害剤）または図2のスクリーニングから同定された指示された阻害剤のいずれかで処理した。ナノグ：標準SDS-PAGEおよびイムノブロット分析により決定したDnmt3bレベル。相対Nanog：Dnmt3bおよびNanog + Dnmt3bの数値は下の表に示されており、ナイーブ多能性状態を安定化する阻害剤は緑色で強調されている。 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55515/55515fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> 化合物 </td><td colspan="2"> 主要ターゲット </td><td> その他のターゲット </td></tr><tr><td> AV-951 </td><td colspan="2"> VEGFR </td><td></td></tr><tr><td> HG-6-64-01 </td><td colspan="2"> ABL、BRAF、RET、CSF1R、EGFR、EPHA8、FGFR、FLT3、KIT、LOK、MAP4K1、p38b、MUSK、PDGFR、TAOK3、TNNI3K </td><td></td></tr><tr><td> WH-4-023 </td><td colspan="2"> Lck </td><td> Src </td></tr><tr><td> R4406 </td><td colspan="2"> Syk </td><td></td></tr><tr><td> GW-572016 </td><td colspan="2"> HER2 </td><td> EGFR </td></tr><tr><td> KIN001-244 </td><td colspan="2"> PDK1 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-4-145 </td><td colspan="2"> CSF1R、DDR1、EGFR、TIE1、PDGFR2 </td><td></td></tr><tr><td> WZ-7043 </td><td colspan="2"> CSF1R、DDR1、FGFRおよびTAO1 </td><td></td></tr><tr><td> GW786034 </td><td colspan="2"> VEGFR1 </td><td> VEGFR2、VEGFR3、＃160; </td></tr><tr><td> AZD-1480 </td><td colspan="2"> JAK2 </td><td></td></tr></tbody></table> 表1：選択されたヒット化合物およびその主要キナーゼ標的。

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening at JoVE.com

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

ここで、我々は、ナイーブプライム多能性転移のキナーゼレギュレーターの標的小分子スクリーニングを実施するための定量的かつスケーラブルなプロトコルを提示する。

ハイスループットインヒビタースクリーニングによる胚性幹細胞の多能性を調節するキナーゼを同定するための簡単な方法

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

a-simple-method-to-identify-kinases-that-regulate-embryonic-stem-cell

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

6.4K ビュー.  University of Dundee. ここで、我々は、ナイーブプライム多能性転移のキナーゼレギュレーターの標的小分子スクリーニングを実施するための定量的かつスケーラブルなプロトコルを提示する。 

ビデオ: A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

化学物質安全性のスクリーニングおよびシステム生物学データの生成のために発生毒性アッセイベースのヒト多能性幹細胞

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

発生生物学

Kinetic Measurement and Real Time Visualization of Somatic Reprogramming

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease phenotypes. Recent advances have identified more efficient and safe methods for introduction of reprogramming factors. However, there are few tools to monitor and track the progression of reprogramming. Current methods for monitoring reprogramming rely on the qualitative inspection of morphology or staining with stem cell-specific dyes and antibodies. Tools to dissect the progression of iPSC generation can help better understand the process under different conditions from diverse cell sources. 
This study presents key approaches for kinetic measurement of reprogramming progression using flow cytometry as well as real-time monitoring via imaging. To measure the kinetics of reprogramming, flow analysis was performed at discrete time points using antibodies against positive and negative pluripotent stem cell markers. The combination of real-time visualization and flow analysis enables the quantitative study of reprogramming at different stages and provides a more accurate comparison of different systems and methods. Real-time, image-based analysis was used for the continuous monitoring of fibroblasts as they are reprogrammed in a feeder-free medium system. The kinetics of colony formation was measured based on confluence in the phase contrast or fluorescence channels after staining with live alkaline phosphatase dye or antibodies against SSEA4 or TRA-1-60. The results indicated that measurement of confluence provides semi-quantitative metrics to monitor the progression of reprogramming.

The protocol presented in this study describes methods for the real-time monitoring of reprogramming progression via the kinetic measurement of positive and negative pluripotent stem cell markers using flow cytometry analysis. The protocol also includes the imaging-based assessment of morphology, and marker or reporter expression during iPSC generation.

体細胞の再プログラミングの反応速度測定とリアルタイムの可視化

Somatic reprogramming has enabled the conversion of adult cells to induced pluripotent stem cells (iPSC) from diverse genetic backgrounds and disease ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

多彩な生化学的アプローチを用いた新規 CK2 キナーゼ基板の識別

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

生化学

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

心原性誘導効率を定量化するために修飾されたマウス胚性幹細胞ベースのアッセイ

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

生物学

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies have been proposed and implemented for the identification of new mediators of TCR signaling, which would improve the understanding of T-cell processes, including activation and thymic selection. We describe a screening assay that enables the identification of molecules that influence TCR signaling based on the activation of developing thymocytes. Strong TCR signals cause developing thymocytes to activate apoptotic machinery in a process known as negative selection. Through the application of kinase inhibitors, those with targets that affect TCR signaling are able to override the process of negative selection. The method detailed in this paper can be used to identify inhibitors of canonical kinases with established roles in the TCR signaling pathways and also inhibitors of new kinases yet to be established in the TCR signaling pathways. The screening strategy here can be applied to screens of higher throughput for the identification of novel druggable targets in TCR signaling.

Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

This paper uses a flow-cytometry-based assay to screen libraries of chemical inhibitors for the identification of inhibitors and their targets that influence T-cell receptor signaling. The methods described here can also be expanded for high-throughput screenings.

T 細胞受容体を介してライブラリ化学阻害剤のスクリーニングのメディエーターの同定

The T-cell receptor (TCR) signaling pathway comprises a multitude of mediators that transmit signals upon the activation of the TCR. Different strategies ...

免疫・感染学

Oct4GiP Reporter Assay to Study Genes that Regulate Mouse Embryonic Stem Cell Maintenance and Self-renewal

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will greatly facilitate the use of ES cells for developmental biology studies, disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine (reviewed in 1,2).
To expedite the identification and characterization of novel regulators of ES cell maintenance and self-renewal, we developed a fluorescence reporter-based assay to quantitatively measure the self-renewal status in mouse ES cells using the Oct4GiP cells 3. The Oct4GiP cells express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the Oct4 gene promoter region 4,5. Oct4 is required for ES cell self-renewal, and is highly expressed in ES cells and quickly down-regulated during differentiation 6,7. As a result, GFP expression and fluorescence in the reporter cells correlates faithfully with the ES cell identity 5, and fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis can be used to closely monitor the self-renewal status of the cells at the single cell level 3,8.
Coupled with RNAi, the Oct4GiP reporter assay can be used to quickly identify and study regulators of ES cell maintenance and self-renewal 3,8. Compared to other methods for assaying self-renewal, it is more convenient, sensitive, quantitative, and of lower cost. It can be carried out in 96- or 384-well plates for large-scale studies such as high-throughput screens or genetic epistasis analysis. Finally, by using other lineage-specific reporter ES cell lines, the assay we describe here can also be modified to study fate specification during ES cell differentiation.

We describe a fluorescence reporter assay to quickly identify and characterize genes that regulate mouse embryonic stem cell maintenance and self-renewal.

マウス胚性幹細胞の維持と自己複製を制御する遺伝子を研究するためにOct4GiPレポーターアッセイ

Pluripotency and self-renewal are two defining characteristics of embryonic stem cells (ES cells). Understanding the underlying molecular mechanism will ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

ヒト多能性のための代替培養はセル生産、メンテナンス、および遺伝子解析幹

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel signal transduction pathways. Our approach features the use of a library of purified GST-tagged human protein kinases and a recombinant protein substrate of interest. We have used this technology to identify MAP/microtubule affinity-regulating kinase 2 (MARK2) as the kinase for a glucose-regulated site on CREB-Regulated Transcriptional Coactivator 2 (CRTC2), a protein required for beta cell proliferation, as well as the Axl family of tyrosine kinases as regulators of cell metastasis by phosphorylation of the adaptor protein ELMO. We describe this technology and discuss how it can help to establish a comprehensive map of how cells respond to environmental stimuli.

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...