وأيد هذا العمل عن طريق منح NSERC 386634. ونود أن نشكر أعضاء مختبر Screaton لإجراء مناقشات مفيدة.

1. إعداد الكواشف، لوحات، والخلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 500 مل العازلة تحلل: 25 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 50 ملي ناف، 0.5 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0، 0.5٪ TritonX-100، 5 ملي بيتا سكرولي، 5٪ الجلسرين. تخزينها في 4 ° C. مباشرة قبل الاستخدام، إضافة 1 ملي dithiothreitol (DTT)، 1 ملم phenylmethyl السلفونيل الفلورايد (PMSF)، و 1 ملي فانادات الصوديوم. بعد هذه الخطوة، غير مطلوب PMSF في أي العازلة الشطف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 20 مل من 10X كيناز العازلة: 200 ملي تريس درجة الحموضة 7.5، 50 ملي بيتا سكرولي (FW 216)، 2 مم فانادات الصوديوم. قسامة في 1 مل الأنابيب وتخزينها في -20 ° C. مباشرة قبل الاستخدام، إضافة 5 ملي DTT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 20 مل من 10X M-ATP العازلة: 300 ميكرومتر ثالث فسفات الأدينوزين (ATP)، 66 ملي MgCl 2، 33 ملم MnCl 2. قسامة في 1 مل الأنابيب وتخزينها في -20 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل 100 مل من 2X دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) تحلل العازلة: 1.5 غرام قاعدة تريس، 20 مل الجلسرين، 30 مل H 2 O. حل وضبط درجة الحموضة إلى 6.8 مع حمض الهيدروكلوريك. إضافة 40مل 10٪ SDS، وضبط مستوى الصوت إلى 100 مل. إضافة 25 ملغ الأزرق برموفينول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بقعة 4 ميكرولتر من 25 نانوغرام / ميكرولتر الثدييات التعبير البلازميد ترميز-GST كيناز 14 لكل بئر في مجموعات من 96 لوحات جيدة ولوحات التسمية وفقا لذلك. وختم تجميد لوحات في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1-2 أيام قبل ترنسفكأيشن، وخلايا ثقافة HEK293T في كامل Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) والمضادات الحيوية في 37 ° C حاضنة تستكمل مع CO 2 (النهائية 5٪). مع مرور التربسين ولا تسمح الأوراق المالية لتصبح&gt; 80٪ متموجة خلال التوسع. ويلزم ما لا يقل عن 6 × 10 7 خلايا للشاشة (حوالي 3 × 15 سم أطباق من الخلايا HEK293T في 80٪ التقاء). </li></ol> 2. ترنسفكأيشن ملاحظة: انظر الشكل 1 للاطلاع على سير بروتوكول بأكمله. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان قد تم تجميدها لوحات تحتوي على البلازميدات كيناز، ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لالثانية الطرد المركزي في 1900 x ج لمدة 3 دقائق لجمع أي رطوبة في الجزء السفلي من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلط 8.6 مل من انخفاض متوسط ​​المصل (على سبيل المثال، OPTI-MEM) مع 312.7 ميكرولتر من الدهون على أساس كاشف ترنسفكأيشن. اتركيه لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر من انخفاض متوسط ​​المصل إلى كل بئر باستخدام موزع السائل الآلي مزودة كاسيت حجم صغير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 ميكرولتر لكل بئر من انخفاض متوسط ​​المصل / ترنسفكأيشن مزيج كاشف من الخطوة 2.2 باستخدام موزع السائل الآلي مزودة كاسيت حجم صغير. اتركيه لمدة 20 إلى 45 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخلايا 293T على 7.5 × 10 5 خلية / مل في 80 مل من DMEM. إضافة 100 ميكرولتر من التعليق الخلية (أي 7.5 × 10 4 خلايا) لكل بئر باستخدام موزع السائل الآلي مزودة حجم الكاسيت القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من الآبار تحت المجهر لتوزيع الخلايا موحد والعودة إلى الحاضنة لمدة 24 ساعة. </li></ol> المنسدلة 3. GST-كيناز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل وresh: 4 ملي حل pervanadate عن طريق خلط 60 ميكرولتر من 0.2 M فانادات الصوديوم مع 540 ميكرولتر من H 2 O. في مزيج الأنبوب الثاني 2.7 ميكرولتر من 30٪ بيروكسيد و 1.4 مل من برنامج تلفزيوني. إضافة الحلين معا، وترك الجلوس لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ماصة الأقنية (لا تستخدم موزع السائل الآلي لأنها تخلق الكثير من الاضطراب في البئر) الاستغناء 2 ميكرولتر من 0.25 M CaCl 2 في كل بئر، تليها 2.5 ميكرولتر من pervanadate أعدت في الخطوة 3.1. احتضان كل لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة ثم ضع على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 35 مل من تحلل العازلة بإضافة DTT، PMSF، وفانادات الصوديوم كما هو مبين في القسم 1 (إعداد الكواشف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حفظ وحات على الجليد، وإزالة المتوسطة من كل بئر باستخدام الشافطة فراغ. على الفور إضافة 50 ميكرولتر / بئر الجليد العازلة تحلل الباردة باستخدام موزع السائل الآلي مزودة كاسيت القياسية. اتركيه مدة 30 دقيقة على الجليد لليز (اختياري: يمكن أن تتوقف هنا إذا لزم الأمر عن طريق ختم بلاته وتخزينها في -80 ° C. للمتابعة، لوحات ذوبان الجليد على الجليد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحات تدور في 1900 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تتخلص الخلايا من كل بئر باستخدام ماصة الأقنية ونقل جميع محتويات المسمى بشكل مناسب لوحات 96 بئر V-القاع. لوحات تدور في 1900 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أثناء الدوران، وملء الجلوتاثيون المغلفة لوحات (واحد لكل لوحة 96-جيدا) مع 100 ميكرولتر / بئر الجليد العازلة تحلل الباردة (بدون PMSF) باعتباره شطف. الحفاظ على لوحات على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة لوحات V-السفلي من أجهزة الطرد المركزي. في وقت واحد، عكس لوحات الجلوتاثيون أكثر من بالوعة لنفض العازلة تحلل وصمة عار على منشفة ورقية. نقل العازلة تحلل من لوحات V-القاع إلى لوحات الجلوتاثيون عن طريق إمالة لوحة وباستخدام ماصة الأقنية، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه في الجزء السفلي. تغطية لوحات وترك على الجليد لمدة لا تقل 2 ساعة الربط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على مقربة من نهاية الخطوة ملزم 2 ساعة، وإعداد محطة عمل النشاط الإشعاعي، وضمان رانه احتياطات السلامة الضرورية هي في مكان للعمل الإشعاعي. ضبط الفرن التهجين إلى 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 200 مل من تحلل العازلة بإضافة DTT والصوديوم فانادات كما هو مبين في القسم 1. PMSF ليس مطلوبا في هذه المرحلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس لوحات الجلوتاثيون أكثر من بالوعة لنفض العازلة تحلل وصمة عار على منشفة ورقية. شطف الآبار 3X مع 100 ميكرولتر العازلة تحلل (بدون PMSF). لا تدع الآبار الجلوس الجافة - الاحتفاظ بها في شطف حتى على استعداد للمضي قدما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 55 مل من 1X العازلة كيناز (KB) من خلال تمييع الأسهم 10X وإضافة DTT كما هو مبين في القسم 1. لوحات شطف مرة واحدة مع 50 ميكرولتر من 1X KB باستخدام موزع السائل الآلي مزودة حجم الكاسيت القياسية. ترك 1X KB في الآبار حتى حل A جاهز: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل A بإضافة 500-530 ميكروغرام من الركيزة المصالح، 500 ميكروغرام من البروتين الأساسي المايلين (ب ب)، 2.65 مل من 10X KB، 13.25 ميكرولتر من 1 M DTT، وH 2 O ما يصل الى 15.9 مل. </li></ol></لى&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> في وقت واحد، عكس لوحات أكثر من بالوعة لإزالة 1X KB شطف، وصمة عار على منشفة ورقية، وعلى الفور إضافة 30 ميكرولتر من محلول A باستخدام موزع السائل الآلي مزودة كاسيت حجم صغير. الحفاظ على لوحات على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحل B في منطقة العمل الإشعاعي وذلك بإضافة 2.5 مل 10X M-ATP، 500 μCi أشعة غاما 32 P ATP، وH 2 O إلى 10 مل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من محلول B لكل بئر باستخدام ماصة مكرر الذي يساعد في خلط بسبب قوة الطرد. تغطية واحتضان في 30 ° C الفرن التهجين لمدة 30 دقيقة. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 30 دقيقة، ونقل لوحات إلى جليد. إضافة 50 ميكرولتر من 2X SDS العازلة تحلل إلى كل بئر باستخدام ماصة الأقنية. يمكن المضي قدما في هذه المرحلة إلى الخطوة التالية، أو ختم لوحات مع رقائق الألومنيوم وتخزينها في -20 درجة مئوية حتى مريحة. </li></ol> 4. الجري، تلطيخ، والمواد الهلامية التجفيف ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الأعمال في منطقة DESIGNAتيد لنشاط إشعاعي. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الفرن التهجين وتعيين إلى 85 درجة مئوية. لوحات ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. مرة واحدة وصلت درجة حرارة الفرن، لوحات نقل إلى الفرن واحتضان لمدة 10 دقيقة لتفسد العينات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 26-كذلك المواد الهلامية مسبقة الصب مع 15 ميكرولتر من كل رد فعل باستخدام ماصة الأقنية لملء العديد من الآبار في وقت واحد. ويجب الحرص على أن جميع النصائح محاذاة مع المقابلة بشكل جيد قبل أن يضيف العينات. تشغيل هلام في 150 V. لا تدع تتبع صبغ (الخط الأزرق) تشغيل الخروج من الجزء السفلي من هلام لأن هذا يحتوي على ATP غير مدمج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفكيك المواد الهلامية وقطع ATP غير مدمج (الخط الأزرق) باستخدام مشرط أو حافة مستقيمة لأنها سوف إفرط في التعريض الأفلام. وضع المواد الهلامية في حاويات وصفت وتغطي مع Coomassie وصمة عار لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة وصمة عار Coomassie، لفترة وجيزة شطف المواد الهلامية مع الماء، وإضافة يزيل اللون الحل. يزيل اللون المواد الهلامية حتى البروتينات هي واضحة للعيان. فرقة لMBP وفرقة لالركيزة ينبغييكون لكل عينة واضحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتجفيف المواد الهلامية: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ورقة كبيرة من ورق الترشيح ووضعه على مجفف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الرطب ورقة السيلوفان في الماء المقطر حتى على نحو سلس وتجعد الحرة، ووضعه على رأس ورقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الجل على رأس ورقة السيلوفان، مما يجعل علما ترتيب المواد الهلامية. الرطب ورقة السيلوفان الثانية ووضع على رأس المواد الهلامية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح جميع فقاعات (لوحة ختم الأسطوانة يعمل بشكل جيد لهذا) لطيفة سطح موحدة. إغلاق رفرف، بدوره على فراغ، وتجفيف المواد الهلامية لمدة 3 ساعة على 80 درجة مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة الهلام جافة، يعرضهم لفيلم XAR باستخدام الشاشة لتكثيف الإشارة. التفاف كاسيت مع التفاف ساران أو كيس من البلاستيك وختم بشريط لمنع دخول الصقيع. تخزين الكاسيت في -80 درجة مئوية خلال الليل. </li></ol> 5. تطوير XAR أفلام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في اليوم التالي، وإزالة كاسيت من الثلاجة والسماح ذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة. تطوير الفيلم فيغرفة مظلمة باستخدام معالج الفيلم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: فحص الأفلام عن أدلة على أزواج كيناز الركيزة. A التعرض الطويل الثاني ويمكن أيضا أن تكون مفيدة للكشف عن أحداث الفسفرة الأضعف. </li></ol>

<ol>
	<li>Meisenhelder, J., Hunter, T., van der Geer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphopeptide+mapping+and+identification+of+phosphorylation+sites.">Phosphopeptide mapping and identification of phosphorylation sites.</a> Curr Protoc Mol Biol. 18, Unit 18 19 (2001).</li><li>Doll, S., Burlingame, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry-based+detection+and+assignment+of+protein+posttranslational+modifications.">Mass spectrometry-based detection and assignment of protein posttranslational modifications.</a> ACS chem. 10, 63-71 (2015).</li><li>Sharma, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultradeep+human+phosphoproteome+reveals+a+distinct+regulatory+nature+of+Tyr+and+Ser/Thr-based+signaling.">Ultradeep human phosphoproteome reveals a distinct regulatory nature of Tyr and Ser/Thr-based signaling.</a> Cell rep. 8, 1583-1594 (2014).</li><li>Cohen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+protein+function+by+multisite+phosphorylation--a+25+year+update.">The regulation of protein function by multisite phosphorylation--a 25 year update.</a> Trends Biochem Sci. 25, 596-601 (2000).</li><li>Walsh, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Posttranslation Modification of Proteins: Expanding Nature's Inventory. , (2006).</li><li>Boersema, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-depth+qualitative+and+quantitative+profiling+of+tyrosine+phosphorylation+using+a+combination+of+phosphopeptide+immunoaffinity+purification+and+stable+isotope+dimethyl+labeling.">In-depth qualitative and quantitative profiling of tyrosine phosphorylation using a combination of phosphopeptide immunoaffinity purification and stable isotope dimethyl labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 9, 84-99 (2010).</li><li>Hutti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+method+for+determining+protein+kinase+phosphorylation+specificity.">A rapid method for determining protein kinase phosphorylation specificity.</a> Nat Methods. 1, 27-29 (2004).</li><li>Johnson, S. A., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinomics:+methods+for+deciphering+the+kinome.">Kinomics: methods for deciphering the kinome.</a> Nat Methods. 2, 17-25 (2005).</li><li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+regulatory+systems+through+protein+interaction+domains.">Assembly of cell regulatory systems through protein interaction domains.</a> Science. 300, 445-452 (2003).</li><li>Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+yeast+protein+kinases+using+protein+chips.">Analysis of yeast protein kinases using protein chips.</a> Nat Genet. 26, 283-289 (2000).</li><li>Shah, K., Shokat, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+genetic+approach+for+the+identification+of+direct+substrates+of+protein+kinases.">A chemical genetic approach for the identification of direct substrates of protein kinases.</a> Methods Mol Biol. 233, 253-271 (2003).</li><li>Zou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKIS:+computational+identification+of+protein+kinases+for+experimentally+discovered+protein+phosphorylation+sites.">PKIS: computational identification of protein kinases for experimentally discovered protein phosphorylation sites.</a> BMC bioinform. 14, 247 (2013).</li><li>Varjosalo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+active+and+kinase-deficient+kinome+collection+for+identification+of+kinases+regulating+hedgehog+signaling.">Application of active and kinase-deficient kinome collection for identification of kinases regulating hedgehog signaling.</a> Cell. 133, 537-548 (2008).</li><li>Jansson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+controls+CREB+activity+in+islet+cells+via+regulated+phosphorylation+of+TORC2.">Glucose controls CREB activity in islet cells via regulated phosphorylation of TORC2.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 10161-10166 (2008).</li><li>Fu, A., Screaton, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+kinomics+to+delineate+signaling+pathways:+control+of+CRTC2/TORC2+by+the+AMPK+family.">Using kinomics to delineate signaling pathways: control of CRTC2/TORC2 by the AMPK family.</a> Cell Cycle. 7, 3823-3828 (2008).</li><li>Abu-Thuraia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axl+phosphorylates+elmo+scaffold+proteins+to+promote+rac+activation+and+cell+invasion.">Axl phosphorylates elmo scaffold proteins to promote rac activation and cell invasion.</a> Mol Cell Biol. 35, 76-87 (2015).</li><li>Manning, G., Whyte, D. B., Martinez, R., Hunter, T., Sudarsanam, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+kinase+complement+of+the+human+genome.">The protein kinase complement of the human genome.</a> Science. 298, 1912-1934 (2002).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

منذ المنشورات الأصلية واصفا نهج 14،15، تم توسيع المكتبة الأصلي من 180 GST-تحركات إلى 420 عضوا، أو ~ 80٪ من kinome البروتين البشري. مع مكتبة الموسعة، البروتوكول كما هو موضح يستغرق 4-5 أيام ثم 1-4 أيام لتطوير الأفلام (بحسب ما تقتضيه الضرورة)، والتي يمكن اختصارها عن طريق استخدام phosphorimaging وتعزيز الإشارات الرقمية. هناك العديد من الخطوات الرئيسية التي يجب توخي الحذر (انظر الشكل 1 لمحة عامة عن بروتوكول). أولا، هو صحة المخزون من الخلايا (الميكوبلازما الحرة، لم يسمح للوصول إلى نقطة التقاء أثناء التوسع، وتعامل مع التربسين في كل ممر) خلال مرحلة التوسع دفعة وفي 96 لوحات جيدة في وقت ترنسفكأيشن. وينبغي أن تكون خلايا المصنف موحد، و 80٪ متموجة عندما يأخذ ترنسفكأيشن مكان (الخطوة 1.5). ثانيا، وهو مثالي خلال ترنسفكأيشن لاستخدام موزع السائل الآلية لتقليل حجم transfأخطاء إيه، مما يحد من معامل الاختلافات (&quot;السير الذاتية&quot;) بين الآبار. لأحجام صغيرة، تركيب موزع مع أصغر حجم الخسائر حدود كاسيت كاشف بسبب انخفاض كميات الميتة وزيادة الاستغناء عن الدقة. يستخدم الخطوة العلاج مع pervanadate الصوديوم، وعموم التيروزين الفوسفاتيز المانع، كحافز العام لزيادة حالة الفسفرة من تحركات الهدف. إدراج الكالسيوم في هذه الخطوة يزيد خلية مصفوفة التصاق، ومنع فقدان الخلية بسبب التقريب التي تسببها العلاج pervanadate طويلة. يجب أن تتم هذه الخطوة مع الالتزام الصارم فترة حضانة 10 دقيقة. ثالثا، لفحص كيناز نفسه، هناك عدة اعتبارات عند اختيار الركيزة المؤتلف: الببتيدات، المجالات بروتين، أو البروتينات سليمة كبيرة مثل 120 كيلو دالتون يمكن لجميع استخدامها. إذا كان من المعروف موقع الفسفرة معين، ركيزة الببتيد هو النهج الأكثر مباشرة إلى الأمام، ولكن يجب أن تكون كبيرة بما يكفي للكشف عنعلى هلام SDS-PAGE. وهكذا، ركائز الببتيد يمكن تنصهر GST وتنقيته من البكتيريا لإعطاء ميجاوات من&gt; 25. البروتينات الكبيرة لديها ميزة أنها من المرجح مطوية وبقاياها phosphorylatable يتعرض لأنها ستكون في الخلية، ولكن تأتي مع العيب أنها سوف تشمل المخلفات الإضافية التي يمكن أن تكون فسفرته وإعطاء إشارة في الفحص. لدينا الأفضلية لتشغيل الشاشة باستخدام ركيزة الببتيد يتكون من 15-20 الأحماض الأمينية المحيطة بقايا ما هو معروف أن فسفرته في الجسم الحي وكما هو معروف لتنظيم حدث بيولوجي، وهذا يجعل التحقق من تحركات المرشح من الشاشة على حد سواء في المختبر والمجراة أسرع بكثير. وأخيرا، من الناحية المثالية كمية النهج البروتين أو يتجاوز 1 ميكروغرام لكل بئر. هذا بالطبع يختلف مع MW الركيزة. أقل من البروتين لكل بئر يمكن أن تسفر عن إصابات ذات معنى، ولكن &#39;أكثر هو أفضل &quot;تنطبق القاعدة كما أنه يزيد إشارة: نويحد ذاتها. المعيار، ينصح المواد الهلامية غير التدرج كما صدع المواد الهلامية التدرج في كثير من الأحيان أثناء التجفيف. بعد تجفيف المواد الهلامية، والكشف عن إشارة المشعة على خلفية مع عداد جيجر يعطي مؤشرا ممتازا على نجاح الفحص. كما الشاشة في المختبر وجود مستويات إضافية من التعقيد في الجسم الحي، يجب التحقق من صحة كيناز مرشح ل ركيزة معينة في الخلايا. على وجه التحديد، الشاشة قد تحدد أحد أفراد الأسرة التي لديها القدرة الحيوية إلى الفوسفات الركيزة في المختبر، ولكن ليس أعرب في نفس نوع من الخلايا أو في نفس التحت خلوية والركيزة. على سبيل المثال، في حين كانت MARK2 وMARK3 كل من يضرب في شاشة لكيناز التي يمكن أن الفوسفات CRTC2 على Ser275، فقط MARK2 شكلت مجمع مع الركيزة في الخلايا 14. وفيما يلي سلسلة من التجارب الإضافية التي يمكن استخدامها لتأكيد أهمية الفسيولوجية للكيناز مرشح. خشب التنوبالحادي و، والتحولات تنقل الركيزة على SDS-PAGE التالية coexpression من كيناز مرشح يمكن استخدامها كوسيلة لمراقبة تأكيد. يمكن أن الضوابط المناسبة هذا cotransfection من كيناز الخاملة حفاز تأكيد التحديد. ثانيا، الركيزة يمكن immunoprecipitated من مقتطفات الخلية التي تم حضنت مع 32 P-الفوسفاتية لتأكيد إدماج الفوسفات إلى الركيزة في وجود wildtype وليس كيناز الخاملة حفاز. ثالثا، يمكن توليد الأجسام المضادة ضد phosphospecific تسلسل phosphoacceptor (إذا كان معروفا) وتستخدم لتأكيد زيادة في الركيزة الفسفرة عندما هى overexpressed كيناز. شاشة الثانوية باستخدام الركيزة متحولة يحمل بقايا غير phosphorylatable في موقع الهدف يمكن تأكيد خصوصية قبل جيل من phosphoantibody، عنصر تحكم أهمية خاصة مع نطاق أكبر وبروتين كامل طول ركائز. النهج تثبيط الدوائية لمنع وكانديويمكن أيضا تاريخ كيناز استخدامها، ولكن يجب توخي الحذر كما تثبيط تحركات ذات الصلة واقع تقدر حق قدرها. وأخيرا، رني بوساطة إسكات كيناز مرشح (ق) في خلايا المتبعة والنشاف الغربي لمراقبة فقدان الموقع المستهدف الفسفرة مع الأجسام المضادة phosphospecific لا يمكن أن يؤديها.

البروتين التعديلات بعد متعدية (PTMs) ضرورية للتواصل بين الخلايا. ولعل أفضل درس لجميع PTMs هو الفسفرة، يحفزه تحركات البروتينات، التي تنظم عدد لا يحصى من وظائف البروتين، بما في ذلك نشاطهم الكيمياء الحيوية، وتوطين التحت خلوية، التشكل، والاستقرار. تحديد المواقع الفسفرة على البروتينات الهدف يمكن تحقيقه عن طريق التعيين phosphopeptide زيتية أو عن طريق تقنيات البروتين الآن القياسية باستخدام عينات المخصب لالببتيدات فسفرته 1،2. في حين من المتوقع أن يتم فسفرته 3 ثلاثة أرباع بروتيوم أعرب وحددت 200،000 مواقع الفسفرة 5، مع تقديرات تصل إلى 1000000 6، وكثير من هؤلاء ليس لهم علم الأحياء المخصصة، مما يشير إلى مسار أو بروتين كيناز. في حين تحديد المواقع فسفرته واضح ومباشر نسبيا، تحديا أكبر نسبيا هوتحديد كيناز وما شابه ذلك (ق) التي تستهدف هذه المواقع، وهي عملية نطلق عليه رسم الخرائط كيناز: أزواج الركيزة. عدة طرق لتحديد كيناز: وقد وصفت أزواج الركيزة، إما بدءا من كيناز من الفائدة وتبحث عن ركائز، أو بدءا ركيزة من الاهتمام ومحاولة لإيجاد كيناز المعدلة تجريبيا 11/07 أو حسابيا 12. لتحديد تحركات لالركيزة فسفرته معروف، المعلوماتية الحيوية يمكن استخدامها لتحديد البروتينات التي تحتوي على تسلسل الحفظ قصيرة من الأحماض الأمينية المرافقة بقايا فسفرته (موقع الإجماع)، فضلا عن تحديد تحركات التي تشكل مجمع precipitable مع الركيزة. ومع ذلك، هذه الأساليب هي مضيعة للوقت، وغالبا ما لا تفي بالنجاح. قمنا بتطوير نهج وظيفي منتظم لتحديد بسرعة تحركات التي يمكن أن الفوسفات ركيزة معينة (13). فحص الشاشة تنتج تحديدا ممتازإيتي، مع اختيار واضحة جدا لتحركات المشابهة المحتملة. ونظرا لمركزية الفسفرة إلى الإشارات البيولوجية، والشاشة هي مفيدة لاكتشاف خلية تقريبا في جميع مسارات إشارات 14-16. ينطوي على الشاشة إجراء فحص كيناز على نطاق واسع مع مكتبة من تحركات البروتينات البشرية. تم الموسومة تحركات مع الجلوتاثيون البكتيرية S-ترانسفيراز (GST) البروتين وتنقيته من مقتطفات خلايا الثدييات، وهو ما يعني أن الإنزيمات المؤتلف - على عكس تلك التي أعدت من البكتيريا - تتولد في وجود تحركات البروتينات المنبع في كثير من الأحيان اللازمة ل الانزيمات المؤتلف أن يكون النشاط في المختبر. في الواقع، في حين سيرين، ثريونين، والتيروزين النشاط كيناز اللازمة لتفعيل كيناز المصب الموجودة في الخميرة 10، الجينوم الخميرة بترميز 122 تحركات البروتينات، مشيرا إلى أن kinome الثدييات، مع أكثر من 500 جين 17، أصبحت أكبر بكثير من مجمع ل العاديهالشركة المصرية للاتصالات العمليات الفريدة للكائنات العليا. وعلاوة على ذلك، فإن تأثير المحفزات المختلفة ذات الصلة لبيولوجيا الخلية والأمراض التي تصيب البشر (مثل الجزيئات الصغيرة، عوامل النمو والهرمونات وغيرها) يمكن أن تستخدم ل14،15 تعدل النشاط كيناز في سياق مناسب.

<table><tbody><tr><td>Lysis buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.1</td></tr><tr><td>10x kinase buffer</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.2</td></tr><tr><td>10x M-ATP</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.3</td></tr><tr><td>Human kinase plasmids</td><td>Orfeome, Invitrogen, Origene</td><td></td><td>GST-tagged in house</td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>CS003595</td><td></td></tr><tr><td>293T cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3002201</td><td>supplement with 100&amp;nbsp;U/ml penicillin, 100&amp;nbsp;&amp;#956;g/ml streptomycin, 10% fetal calf serum.</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; incubator</td><td>Sanyo</td><td>MCO-17AIC</td><td></td></tr><tr><td>15 cm cell culture dishes</td><td>Fisher Scientific</td><td>877224</td><td></td></tr><tr><td>Reduced serum medium</td><td>Invitrogen</td><td>22600-050</td><td></td></tr><tr><td>Lipid-based transfection reagent</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid dispenser</td><td>Thermo Scientific</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Small cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>24073295</td><td></td></tr><tr><td>Standard cassette attachment</td><td>Thermo Scientific</td><td>14072670</td><td></td></tr><tr><td>4 mM pervanadate</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 3.1</td></tr><tr><td>0.25 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (20-200 &amp;#956;l)</td><td>Labnet</td><td>p4812-200</td><td></td></tr><tr><td>Multichannel pipette (1-10 &amp;#956;l)</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661040</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 6-well plates</td><td>Evergreen Scientific</td><td>290-8116-01V</td><td></td></tr><tr><td>Glutathione coated 96-well plates</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-15240</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization oven</td><td>Biostad</td><td>350355</td><td></td></tr><tr><td>GST tagged substrate</td><td>Made in house</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myelin Basic Protein (MBP)</td><td>Sigma</td><td>M1891</td><td></td></tr><tr><td>Repeater pipette (1 ml)</td><td>Eppendorf</td><td>22266209</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P gamma-ATP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU502Z500UC</td><td></td></tr><tr><td>2x SDS lysis buffer (100&amp;nbsp;ml)</td><td>Made in house</td><td></td><td>See Protocol step 1.4</td></tr><tr><td>26-well precast TGX gels</td><td>BioRad</td><td>567-1045</td><td>gel percentage required is dependent on the molecular weight of the substrate of interest</td></tr><tr><td>Coomassie stain</td><td>Made in house</td><td></td><td>0.1% Coomassie R250, 10% acetic acid, 40% methanol</td></tr><tr><td>Coomassie destain</td><td>Made in house</td><td></td><td>10% acetic acid, 20% methanol</td></tr><tr><td>Labeled gel containers</td><td>Made in house</td><td></td><td>Used plastic lids from empty tip boxes, just big enough to contain one gel</td></tr><tr><td>Whatman filter paper</td><td>Fisher Scientific</td><td>57144</td><td></td></tr><tr><td>Cellophane sheets (2)</td><td>BioRad</td><td>165-0963</td><td></td></tr><tr><td>Gel dryer</td><td>Labconco</td><td>4330150</td><td></td></tr><tr><td>Double emulsion autoradiography film</td><td>VWR</td><td>IB1651454</td><td></td></tr><tr><td>Film cassette</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBAC-1417</td><td></td></tr><tr><td>Intensifying screen</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBIS-1417</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealing rubber roller</td><td>Sigma</td><td>R1275</td><td></td></tr></tbody></table>

identification of kinase-substrate pairs using high throughput screening

قمنا بتطوير منصة الفحص لتحديد مخصصة تحركات البروتينات البشرية للركائز فسفرته والتي يمكن استخدامها لتوضيح رواية مسارات نقل الإشارة. نهجنا ميزات استخدام مكتبة تنقية الموسومة GST تحركات البروتينات البشرية وركيزة البروتين المؤتلف من الاهتمام. وقد استخدمنا هذه التكنولوجيا لتحديد MAP / أنيبيب التنظيم تقارب كيناز 2 (MARK2) كما كيناز لموقع التنظيم الجلوكوز على الخاضعة للرقابة CREB الترانسكربتي Coactivator 2 (CRTC2)، وهو بروتين اللازم لتكاثر الخلايا بيتا، وكذلك الأسرة AXL التيروزين كيناز كما المنظمين من ورم خبيث الخلية عن طريق الفسفرة من البروتين محول ELMO. وصفنا هذه التكنولوجيا ومناقشة كيف يمكن أن يساعد على وضع خريطة شاملة لكيفية استجابة الخلايا للمؤثرات البيئية.

وتظهر نتائج ممثلة من شاشة في الشكل 2. تم فحص 180 تحركات باستخدام الببتيد الركيزة GST الموسومة الموافق أأ 268-283 من CRTC2 وكذلك البروتين الأساسي الكلاسيكي كيناز فحص الركيزة المايلين (ب ب). اثنين فقط من تحركات، MARK2 وMARK3 كيناز ذات الصلة للغاية مفسفر الببتيد CRTC2. يتم تضمين MBP باعتبارها الرقابة الداخلية في جميع المقايسات، كما أنه يحتوي على العديد من بقايا phosphorylatable ويمتد على 18 كيلو دالتون، نحو الجزء السفلي من هلام. هذا يسمح لتفسير خصوصية: فإن بعض كيناز الفوسفات بقوة ركيزة وMBP. وتجدر الإشارة هنا إلى أن الآبار التي تحتوي GST وحده (أي أي ضوابط كيناز) تنقية دائما بعض النشاط كيناز الذاتية، وبالتالي هناك دائما الفسفرة الخلفية في الفحص. في حين أن هذا لا يستبعد أن الفسفرة من الركيزة الحقيقية، فإنه يشير إلى أن في المختبر في وضع كيناز قد تكون أقل انتقائية.فإنه من المفيد بشكل خاص لتشمل ركائز متعددة من اختلاف MW استخلاص استنتاجات بشأن كيناز الركيزة خصوصية. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig1.jpg" /> الشكل 1. مخطط يبين الخطوات الرئيسية في البروتوكول. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53152/53152fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 2" src="/files/ftp_upload/53152/53152fig2.jpg" /> يقوم الشكل 2. مثال على نتائج الشاشة. Autoradiographs من شاشة من صفحة 1 من المكتبة (180 تحركات البروتينات البشرية) باستخدام GST-الببتيد الركيزة الموافق أأ 268-283 من الماوس CRTC2 (مستنسخة من جانسون وآخرون، 2008). MBP، يشار البروتين الأساسي المايلين. درجة عالية من الصورةاختيار ubstrate التي كتبها تحركات ذات الصلة هي ميزة من الشاشة. كل حارة يمثل نواتج التفاعل من كيناز فحص متميزة. MARK3 (جل 1) وMARK2 (جل 16)، وتحركات الوحيدة لالفوسفات TORC2 268-283 الببتيد، والمشار إليها. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53152/53152fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening at JoVE.com

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

identification-kinase-substrate-pairs-using-high-throughput

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

8.1K Views.  Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute. Protein phosphorylation is a central feature of how cells interpret and respond to information in their extracellular milieu. Here, we present a high throughput screening protocol using kinases purified from mammalian cells to rapidly identify kinases that phosphorylate a substrate(s) of interest.

Video: Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects biological functions and characteristics of the cell. Currently, the most common method for discovering phosphorylation sites is by liquid chromatography/mass spectrometry (LC/MS) analysis, a rapid and sensitive method. However, relatively labile phosphate moieties are often released from phosphopeptides during the fragmentation step, which often yields false-negative signals. In such cases, a traditional in vitro kinase assay using site-directed mutants would be more accurate, but this method is laborious and time-consuming. Therefore, an alternative method using peptide competition may be advantageous. The consensus recognition motif of 5&#39; adenosine monophosphate-activated protein kinase (AMPK) has been established1 and was validated using a positional scanning peptide library assay2. Thus, AMPK phosphorylation sites for a novel substrate could be predicted and confirmed by the peptide competition assays. In this report, we describe the detailed steps and procedures for the in vitro oligopeptide-competing kinase assay by illustrating AMPK-mediated nuclear factor erythroid 2-related factor 2 (Nrf2) phosphorylation. To authenticate the phosphorylation site, we carried out a sequential in vitro kinase assay using a site-specific mutant. Overall, the peptide competition assay provides a method to screen multiple potential phosphorylation sites and to identify sites for validation by the phosphorylation site mutants.

Peptide competition assays are widely used in a variety of molecular and immunological experiments. This paper describes a detailed method for an in vitro oligopeptide-competing kinase assay and the associated validation procedures, which may be useful to find specific phosphorylation sites.

أوليغوببتيد مسابقة الفحص لتحديد موقع الفسفرة

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Biochemistry

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; however, the number of identified targets for Cdk1, particularly in human cells is still low. The identification of Cdk1-specific phosphorylation sites is important, as they provide mechanistic insights into how Cdk1 controls the cell cycle. Cell cycle regulation is critical for faithful chromosome segregation, and defects in this complicated process lead to chromosomal aberrations and cancer.
Here, we describe an in vitro kinase assay that is used to identify Cdk1-specific phosphorylation sites. In this assay, a purified protein is phosphorylated in vitro by commercially available human Cdk1/cyclin B. Successful phosphorylation is confirmed by SDS-PAGE, and phosphorylation sites are subsequently identified by mass spectrometry. We also describe purification protocols that yield highly pure and homogeneous protein preparations suitable for the kinase assay, and a binding assay for the functional verification of the identified phosphorylation sites, which probes the interaction between a classical nuclear localization signal (cNLS) and its nuclear transport receptor karyopherin &#945;. To aid with experimental design, we review approaches for the prediction of Cdk1-specific phosphorylation sites from protein sequences. Together these protocols present a very powerful approach that yields Cdk1-specific phosphorylation sites and enables mechanistic studies into how Cdk1 controls the cell cycle. Since this method relies on purified proteins, it can be applied to any model organism and yields reliable results, especially when combined with cell functional studies.

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is activated in the G2 phase of the cell cycle and regulates many cellular pathways. Here, we present a protocol for an in vitro kinase assay with Cdk1, which allows the identification of Cdk1-specific phosphorylation sites for establishing cellular targets of this important kinase.

تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

A Simple Method to Identify Kinases That Regulate Embryonic Stem Cell Pluripotency by High-throughput Inhibitor Screening

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been described, termed &#34;na&#239;ve&#34; and &#34;primed&#34; pluripotency. The mechanisms that control na&#239;ve-primed transition are poorly understood. In particular, we remain poorly informed about protein kinases that specify na&#239;ve and primed pluripotent states, despite increasing availability of high-quality tool compounds to probe kinase function. Here, we describe a scalable platform to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition in mouse ESCs. This approach utilizes simple cell culture conditions and standard reagents, materials and equipment to uncover and validate kinase inhibitors with hitherto unappreciated effects on pluripotency. We discuss potential applications for this technology, including screening of other small molecule collections such as increasingly sophisticated kinase inhibitors and emerging libraries of epigenetic tool compounds.

Here, we present a quantitative and scalable protocol to perform targeted small molecule screens for kinase regulators of the na&#239;ve-primed pluripotent transition.

طريقة بسيطة لتحديد الحركات التي تنظم تعدد القدرات الجذعية للخلايا الجذعية من خلال فحص المانع عالي الإنتاجية

Embryonic stem cells (ESCs) can self-renew or differentiate into all cell types, a phenomenon known as pluripotency. Distinct pluripotent states have been ...

Developmental Biology

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

تحديد ركائز كيناز CK2 الرواية باستخدام نهج بيوكيميائية تنوعاً

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Characterization at the Molecular Level using Robust Biochemical Approaches of a New Kinase Protein

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important roles for the cell and may unravel new cellular processes. Among proteins, kinases are major actors as they belong to cell signaling pathways and have the ability to switch on or off many processes crucial to the fate of the cell, such as cell growth, division, differentiation, motility, and death.
In this study, we focused on a new potential kinase protein, LIMK2-1. We demonstrated its existence by Western Blot using a specific antibody. We evaluated its interaction with an upstream regulating protein using coimmunoprecipitation experiments. Coimmunoprecipitation is a very powerful technique able to detect the interaction between two target proteins. It may also be used to detect new partners of a bait protein. The bait protein may be purified either via a tag engineered to its sequence or via an antibody specifically targeting it. These protein complexes may then be separated by SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrylamide Gel) and identified using mass spectrometry. Immunoprecipitated LIMK2-1 was also used to test its kinase activity in vitro by &#947;[32P] ATP labeling. This well-established assay may use many different substrates, and mutated versions of the bait may be used to assess the role of specific residues. The effects of pharmacological agents may also be evaluated since this technique is both highly sensitive and quantitative. Nonetheless, radioactivity handling requires particular caution. Kinase activity may also be assessed with specific antibodies targeting the phospho group of the modified amino acid. These kinds of antibodies are not commercially available for all the phospho modified residues.

We characterized a new kinase protein using robust biochemical approaches: Western Blot analysis with a dedicated specific antibody on different cell lines and tissues, interactions by coimmunoprecipitation experiments, kinase activity detected by Western Blot using a phospho-specific antibody and by &#947;[32P] ATP labeling.

توصيف على المستوى الجزيئي باستخدام نهج كيميائية حيوية قوية لبروتين كيناز جديد

Extensive whole genome sequencing has identified many Open Reading Frames (ORFs) providing many potential proteins. These proteins may have important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

فحص مثبطات كيناز في ميكروصفائف البروتين البشري المجمعة ذاتيا

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a GTPase domain (termed ROC, for Ras of Complex proteins) and a kinase domain1. The discovery in 2004 of mutations in LRRK2 that cause Parkinson's disease (PD) resulted in LRRK2 being the focus of a huge volume of research into its normal function and how the protein goes awry in the disease state2,3. Initial investigations into the function of LRRK2 focused on its enzymatic activities4-6. Although a clear picture has yet to emerge of a consistent alteration in these due to mutations, data from a number of groups has highlighted the importance of the kinase activity of LRRK2 in cell death linked to mutations7,8. Recent publications have reported inhibitors targeting the kinase activity of LRRK2, providing a key experimental tool9-11. In light of these data, it is likely that the enzymatic properties of LRRK2 afford us an important window into the biology of this protein, although whether they are potential drug targets for Parkinson's is open to debate.
A number of different approaches have been used to assay the kinase activity of LRRK2. Initially, assays were carried out using epitope tagged protein overexpressed in mammalian cell lines and immunoprecipitated, with the assays carried out using this protein immobilised on agarose beads4,5,7. Subsequently, purified recombinant fragments of LRRK2 in solution have also been used, for example a GST tagged fragment purified from insect cells containing residues 970 to 2527 of LRRK212. Recently, Dani&euml;ls et al. reported the isolation of full length LRRK2 in solution from human embryonic kidney cells, however this protein is not widely available13. In contrast, the GST fusion truncated form of LRRK2 is commercially available (from Invitrogen, see table 1 for details), and provides a convenient tool for demonstrating an assay for LRRK2 kinase activity. Several different outputs for LRRK2 kinase activity have been reported. Autophosphorylation of LRRK2 itself, phosphorylation of Myelin Basic Protein (MBP) as a generic kinase substrate and phosphorylation of an artificial substrate - dubbed LRRKtide, based upon phosphorylation of threonine 558 in Moesin - have all been used, as have a series of putative physiological substrates including &alpha;-synuclein, Moesin and 4-EBP14-17. The status of these proteins as substrates for LRRK2 remains unclear, and as such the protocol described below will focus on using MBP as a generic substrate, noting the utility of this system to assay LRRK2 kinase activity directed against a range of potential substrates.

Assaying the Kinase Activity of LRRK2 in vitro

Leucine Rich Repeat Kinase 2 is a large multidomain kinase, mutations in which are the most common genetic cause of Parkinson's disease. Analysis of the kinase activity of this protein has proven to be a crucial tool in understanding the biology and dysfunction of this protein. In this paper, in vitro assaying of the kinase activity of LRRK2 and a selection of its mutants is described, providing an experimental system to examine phosphorylation of putative substrates and potential dysfunction of LRRK2 in disease.

يعاير النشاط كيناز من LRRK2 في المختبر</em

Leucine Rich Repeat Kinase 2 (LRRK2) is a 2527 amino acid member of the ROCO family of proteins, possessing a complex, multidomain structure including a ...

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

Biopanning المعالجة البيولوجية القائمة على الاستشعار الحيوي واستراتيجية تحليل المعلوماتية الحيوية للتحقق العالمي من التفاعلات البروتين المخدرات

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Bioengineering

High-throughput Screening for Small-molecule Modulators of Inward Rectifier Potassium Channels

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, atrial fibrillation, and pain1,2. For the most part, however, progress toward understanding their therapeutic potential or even basic physiological functions has been slowed by the lack of good pharmacological tools. Indeed, the molecular pharmacology of the inward rectifier family has lagged far behind that of the S4 superfamily of voltage-gated potassium (Kv) channels, for which a number of nanomolar-affinity and highly selective peptide toxin modulators have been discovered3. The bee venom toxin tertiapin and its derivatives are potent inhibitors of Kir1.1 and Kir3 channels4,5, but peptides are of limited use therapeutically as well as experimentally due to their antigenic properties and poor bioavailability, metabolic stability and tissue penetrance. The development of potent and selective small-molecule probes with improved pharmacological properties will be a key to fully understanding the physiology and therapeutic potential of Kir channels.
The Molecular Libraries Probes Production Center Network (MLPCN) supported by the National Institutes of Health (NIH) Common Fund has created opportunities for academic scientists to initiate probe discovery campaigns for molecular targets and signaling pathways in need of better pharmacology6. The MLPCN provides researchers access to industry-scale screening centers and medicinal chemistry and informatics support to develop small-molecule probes to elucidate the function of genes and gene networks. The critical step in gaining entry to the MLPCN is the development of a robust target- or pathway-specific assay that is amenable for high-throughput screening (HTS).
Here, we describe how to develop a fluorescence-based thallium (Tl+) flux assay of Kir channel function for high-throughput compound screening7,8,9,10.The assay is based on the permeability of the K+ channel pore to the K+ congener Tl+. A commercially available fluorescent Tl+ reporter dye is used to detect transmembrane flux of Tl+ through the pore. There are at least three commercially available dyes that are suitable for Tl+ flux assays: BTC, FluoZin-2, and FluxOR7,8. This protocol describes assay development using FluoZin-2. Although originally developed and marketed as a zinc indicator, FluoZin-2 exhibits a robust and dose-dependent increase in fluorescence emission upon Tl+ binding. We began working with FluoZin-2 before FluxOR was available7,8 and have continued to do so9,10. However, the steps in assay development are essentially identical for all three dyes, and users should determine which dye is most appropriate for their specific needs. We also discuss the assay's performance benchmarks that must be reached to be considered for entry to the MLPCN. Since Tl+ readily permeates most K+ channels, the assay should be adaptable to most K+ channel targets.

Methods for developing and validating a quantitative fluorescence assay for measuring the activity of inward rectifier potassium (Kir) channels for high-throughput compound screening is presented.

الفرز الفائق الإنتاجية الصغيرة للجزيء المغيرون من الداخل قنوات البوتاسيوم المعدل

Specific members of the inward rectifier potassium (Kir) channel family are postulated drug targets for a variety of disorders, including hypertension, ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an affinity purified yeast kinase fusion protein containing a V5-epitope tag for read-out. Purified kinase is obtained through culture of a yeast strain optimized for high copy protein production harboring a plasmid containing a Kinase-V5 fusion construct under a GAL inducible promoter. The yeast is grown in restrictive media with a neutral carbon source for 6 hr followed by induction with 2% galactose. Next, the culture is harvested and kinase is purified using standard affinity chromatographic techniques to obtain a highly purified protein kinase for use in the assay. The purified kinase is diluted with kinase buffer to an appropriate range for the assay and the protein microarrays are blocked prior to hybridization with the protein microarray. After the hybridization, the arrays are probed with monoclonal V5 antibody to identify proteins bound by the kinase-V5 protein. Finally, the arrays are scanned using a standard microarray scanner, and data is extracted for downstream informatics analysis1,2 to determine a high confidence set of protein interactions for downstream validation in vivo.

Using protein microarrays containing nearly the entire S. cerevisiae proteome is probed for rapid unbiased interrogation of thousands of protein-protein interactions in parallel. This method can be utilized for protein-small molecule, posttranslational modification, and other assays in high-throughput.

التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...