このプロトコルは、細胞または組織のライセートのような複雑な生物学的サンプルから特定の標識およびそれに続くCK2基質の濃縮および同定を可能にする。この方法は、任意の細胞タイプまたは組織に適用することができる。このようにして、種々の生物学的文脈におけるCK2の研究を促進する。
この手順のデモンストレーションは、私の研究室の大学院生であるジョン・チョイノフスキです。まず、テキストプロトコルで概説されているように組織サンプルまたは培養細胞を機械的に融液し、合計900マイクロリットルのサンプルを収集する。17倍、重力500倍、摂氏4度で3分間遠心分離機。
次いで、上清の270マイクロリットルを3つの新しい1.7ミリリットルマイクロ遠心分離管のそれぞれに移す。入力コントロールとして使用する残りの上清の40マイクロリットルを取り除き、新しいチューブに移します。すべてのサンプルを氷の上に置きます。
まず、ここに示すように、3つのサンプルチューブのそれぞれにラベルを付けます。キナーゼ反応チューブに、CK2の2.7マイクロリットルと2.5ミリモルGTPgammaSの2.7マイクロリットルを加えます。チューブをフリックして混ぜ、すぐに氷の上に置きます。
GTPgammaS専用チューブに、2.7ミリモルGTPgammaSの2.7マイクロリットルと2.7マイクロリットルのリシスバッファーを加えます。このチューブをフリックして混ぜ、すぐに氷の上に置きます。PNBMにのみチューブにリシスバッファーの5.4マイクロリットルを追加します。
チューブをフリックして混ぜ、すぐに氷の上に置きます。3本のチューブを摂氏30度の水浴に1分間インキュベートします。この後、各チューブに1ミリリットルあたり12ミリグラムで13.5マイクロリットルのPNBMを加えます。
チューブを反転してサンプルを混合し、室温で1時間インキュベートします。サンプルがインキュベートされている間、次に示すように、読み込むサンプルの各列にラベルを付けます。各カラムを数回反転させて、記憶バッファー内のSephadex G-25樹脂を再懸濁させてカラムを準備します。
各列をクランプスタンドに取り付け、約5分間邪魔されずに座らせて樹脂を落ち着かせます。次に、各列の下の開口部の下にチューブを配置します。各列の上部と下部の両方からキャップを取り外し、ストレージバッファが重力によってチューブに排出されるようにします。
ストレージバッファーが使い果たされたら、各カラムに約2.7ミリリットルのLysis Bufferを追加して平衡化し、フローを収集して廃棄します。Lysis バッファを追加し、フローを 3 回破棄するこのプロセスを繰り返します。開始するには、各サンプルをそれぞれの列にロードします。
フローを収集し、破棄します。各カラムに420マイクロリットルのLysis Bufferを加え、サンプルを洗浄します。Lysis バッファが列を通してフィルター処理し、フローを収集して破棄します。
次に、サンプル収集のために各列の下の位置にチューブを配置します。各カラムに500マイクロリットルのLysis Bufferを加える。キナーゼ反応でチオリン酸化およびアルキル化されたCK2基質の濃縮集団を含む流れを収集します。
GTPgammaSのみの反応は、存在する任意の内因性CK2によってチオリン酸化およびアルキル化された基質を含む。PNMBのみの反応は、バックグラウンドアルキル化タンパク質を含む。溶出入力制御サンプルとして各溶出から80マイクロリットルを取り除く。
次に、各サンプルを200マイクロリットルを含む2つのチューブに分割します。各管に対して、抗チオリン酸エステルまたは免疫グロブリンGのいずれかであることをラベル付けする。.抗チオリン酸エステルチューブのそれぞれに2.8マイクログラムの抗チオリン酸エステル抗体を加えます。
各IGGチューブに2.8マイクログラムのアイソタイプコントロール抗体を加えます。その後、2時間摂氏4度で回転器の上にチューブを置きます。サンプルインキュベーションの最後の15分間、きれいなカミソリの刃を使用して、P200ピペットチップの端部を切り落とし、ゲージサイズを大きくします。
使用の直前に、アガロースビーズを含む貯蔵管を短時間渦に入れます。カットピペットチップを使用して、新しい1.7ミリリットルマイクロ遠心チューブに免疫沈降ごとにビーズスラリーの100マイクロリットルを移します。ビーズが落ち着くのを防ぐために、各転送の前にビーズを渦に入れるのが重要です。
チューブを17、500倍の重力、摂氏4度で1分間遠心分離します。上清を取り除き、捨てます。200マイクロリットルのLysisバッファーを加え、短時間渦を混ぜてビーズを再懸濁します。
このプロセスを繰り返し、遠心分離し、ビーズを洗浄します。最後の洗浄の後、ビーズを氷の上に置いて、準備が整うまで進みます。サンプルがインキュベートを終えたら、17、500倍の重力、摂氏4度で3分間遠心分離します。
次いで、各サンプルの200マイクロリットルを洗浄されたビーズを含むチューブに移す。チューブを摂氏4度の回転器に1時間置きます。次に、チューブを17倍、重力の500倍、摂氏4度で1分間遠心します。
各上清から40マイクロリットルを取り除き、枯渇制御として保存します。上清の残りの部分を取り除き、ビーズを邪魔しないように注意してください。サンプルを洗浄するには、それぞれに200マイクロリットルのライシスバッファーを加え、短時間で渦を出します。
17、500倍の重力で遠心分離機、摂氏4度で1分間、上清を捨てる。この洗浄と遠心分離プロセスを3回繰り返し、ビーズを乱さないように注意してください。この後、ビーズを含む各サンプルに2Xサンプルバッファーの50マイクロリットルを追加します。
入力コントロール、溶出入力コントロール、および枯渇制御を含む他のすべてのサンプルでは、6X サンプル バッファーの 8 マイクロリットルを追加します。ピペット各チューブは、ビーズを含むチューブを除いて混合し、SDS-PAGEを続行する前に5分間摂氏95度ですべてのサンプルを加熱します。免疫沈降が成功したかどうかを評価するには、ビーズから除外された各サンプルの25〜30マイクロリットルを別の12.5%ポリアクリルアミドゲルで実行します。
各ゲルをクマシーブルーで染色し、実験プロトコルの様々な段階から濃縮タンパク質を可視化します。新しい、きれいなカミソリの刃を使用して、慎重にそれらのおおよその分子量をメモしながら、キナーゼ反応抗チオリン酸エステルIPレーンに存在する任意のユニークなバンドを切除します。新しいカミソリの刃は、それぞれのユニークなバンドに使用する必要があります。
この技術の根底にあるのは、この技術は、CK2がリン酸化基の転写にGTPを用いるという異常な能力である。外因性CK2ホロ酵素をGTPアナログと共に添加すると、GTPgammaSは、細胞ライセートに、内因性CK2基質のチオリン酸化を生じる。アルキル化試薬p-ニトロベンジルメシル酸を用いたライセートの後の処理は、これらの特定の基質タンパク質上にチオリン酸エステル部分を生成し、抗チオリン酸エステル抗体を使用して免疫沈降させ、最終的には質量分析によって同定することができる。
ここに示す代表的な陽性結果では、CK2依存性、チオリン酸化およびその後のアルキル化が成功した。予想通り、ウェスタンブロッティングによる強化された抗チオリン酸エステルシグナルは、完全なキナーゼ反応を含むレーンでのみ観察され、GTPgammaSのみおよびPNMBのみで処理されたサンプルでは観察されない。免疫沈降およびほのめかされたタンパク質のクーマシーブルー染色ゲルと、陽性の結果も示す。
複数のユニークなバンドは、抗チオリン酸エステルIPレーンでのみ明らかであるように、ライセートは外因性CK2およびGTPgammaSでインキュベートされた。マークされたバンドは、その後、ゲルから切除され、質量分析によってタンパク質同定のために提出される。この手順に従って、質量分析法によって同定された推定CK2基質は、標準的なin vitroキナーゼアッセイにおけるCK2依存性リン酸化などの追加アプローチを使用して検証されなければならない。
