אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואיד מוח אנושי המכיל מיקרוגליה ונוירונים תושבים על ידי שילוב תאים פרוגניים פלוריפוטנטיים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים בתהליך האינדוקציה והפיתוח של אורגנואידים עצביים. שיטה זו מספקת מודל לחקר האינטראקציות בין מיקרוגליה לתאי עצב במהלך התפתחות המוח האנושי. אורגנואידים תלת-ממדיים במוח הם מיני מוחות הנוצרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים או iPSCs.
כחלופה לבעלי חיים ולנבדקים אנושיים, נעשה בהם שימוש נרחב בחיקוי מוחות אנושיים בחקר התפתחות המוח והפרעות נוירולוגיות. הם כלים נהדרים לקידום מחקר בריאות האדם. פרוטוקולים קונבנציונליים לאורגנואידים תלת-ממדיים של מוח אנושי מייצרים רק לעתים רחוקות מיקרוגליה, התא החיסוני השוכן במוח האנושי, מכיוון שתאים אלה נובעים משושלת עוברית שונה מאשר נוירונים.
בעוד שניתן להוסיף מיקרוגליה לאורגנואידים במוח בשלב מאוחר יותר של התמיינות, יש צורך בשיטה לחיקוי טוב יותר של התפתחות המוח האנושי. רוב הפרוטוקולים האחרים מוסיפים HPCs או מיקרוגליה בסוף יצירת האורגנואידים במוח. אנו מייצרים גופים עובריים מ-iPSCs ו-HPCs מעורבים לפני אינדוקציה עצבית.
זה עשוי לחקות טוב יותר את התפתחות המוח האנושי מכיוון שמבשרי מיקרוגליה נודדים למוח בשלב מוקדם מאוד של ההתפתחות. בנוסף, שימוש ב-HPC חוסך זמן התמיינות כולל מכיוון שפרוטוקולי התמיינות microglia נמשכים לרוב יותר מ-30 יום. לכן, הפרוטוקול שלנו יכול לחסוך זמן ועלויות ריאגנטים.
כדי להתחיל, תרבית פירקה תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם או iPSCs בצלחת של 12 בארות המכילה מיליליטר אחד של מדיום E8 Flex, דגרה על התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. למחרת, בדקו את המושבות במיקרוסקופ וספרו את מספר המושבות על ידי סריקת כל השדות בבאר. החלף את המדיום במיליליטר אחד של מדיום A מהערכה ההמטופואטית.
החזירו את הצלחת לחממה למשך 48 שעות. ביום השלישי, החלף 500 מיקרוליטר של המדיום המושקע ב-500 מיקרוליטר של מדיום A טרי, ודגירה למשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, צפו בצמיחת התאים ובהתמיינות ממושבות ה-iPSC.
החלף את המדיום במיליליטר אחד של בינוני B.עקוב אחר התמיינות התאים תחת המיקרוסקופ ובצע החלפת חצי מדיום עם 500 מיקרוליטר של מדיום B כל יומיים למשך שישה עד שבעה ימים. ביום 10, שימו לב לנוכחותם של תאים עגולים בודדים בהירים עם מורפולוגיה של תאי אב המטופויאטיים רגילים, או HPCs, צפים או מחוברים באופן רופף לתא השכבה השטוחה עם כמה אגרגטים רופפים. לאחר מכן, אספו את כל ה-HPCs המובחנים על ידי פיפטינג למעלה ולמטה שלוש פעמים עם קצה פיפטה של מיליליטר אחד.
העבירו את התאים לצינור של 15 מיליליטר. צנטריפוגה את תרחיף התאים ב-300G למשך חמש דקות והשעיה מחדש של הגלולה במיליליטר אחד של Medium B.הוסף 20 מיקרוליטר של תרחיף תאים לתא ספירת תאים וספור את התאים באמצעות מד תאים. התאם את ריכוז התאים למיליון תאים למיליליטר באמצעות מדיום B.טכניקת תרבית הדילול הסדרתי הפיקה מספרים וגדלים מתאימים של מושבות iPSC עם מושבות שהראו שינויים מורפולוגיים משמעותיים עד סוף התרבית במדיום A.לאחר שלושה ימים במדיום B, נצפתה התמיינות HPC עם הופעת תאים עגולים הומוגניים.
ביום העשירי, ה-HPCs יצרו בעיקר אשכולות דמויי מושבה ללא פסולת משמעותית. לאחר איסוף HPCs מובחנים מ-iPSCs אנושיים, ודא שתרבית ה-iPSC הגיעה למפגש של 80%. הוסף 500 מיקרוליטר של תמיסת שטיפה נגד היצמדות לבאר אחת של צלחת המיקרו באר, תוך מזעור היווצרות בועות.
סובב את הצלחת ב-2,000 גרם למשך חמש דקות ברוטור דלי מתנדנד המצויד במחזיקי צלחות. הסר את תמיסת השטיפה לחלוטין ושטוף את הבארות פעמיים עם מיליליטר אחד של DPBS ולאחר מכן עם מיליליטר אחד של DMEM/F-12 מבלי ליצור בועות. טפל ב-iPSCs עם מיליליטר אחד של תמיסת ACCUTASE כדי ליזום דיסוציאציה של תאים.
התבונן בתאים מתחת למיקרוסקופ, ושים לב לסימנים של הפרדת תאים בזמן שהתאים נשארים מחוברים לתחתית. החלף את תמיסת ACCUTASE במיליליטר אחד של מדיום DMEM/F-12, ולאחר מכן, ערבב למעלה ולמטה כדי לפרק את התאים לתאים בודדים. העבירו את התאים המנותקים לצינור של 15 מיליליטר והוסיפו מדיום DMEM/F-12 כדי להגיע לנפח סופי של חמישה מיליליטר.
צנטריפוגה של התאים ב-300G למשך חמש דקות והשעיית הגלולה במיליליטר אחד של מדיום E8 Flex. ספור את התאים כדי להתאים את ריכוז התאים למיליון תאים למיליליטר במדיום E8 Flex. לאחר מכן, ערבבו iPSCs עם HPCs ביחס של שניים לאחד לתוך הבאר של צלחת תרבית הבאר המיקרו.
הוסף מיקרוליטר אחד של תמיסת מלאי מעכב ROCK Y-27632 לכל מיליליטר אחד של מדיום לתוך הסופרנטנט ונער את הצלחת מצד לצד. סובב את הצלחת ב-300G למשך חמש דקות והתבונן תחת המיקרוסקופ כדי לוודא שהתאים התיישבו בבארות המיקרו. דגרו על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
לאחר 48 שעות, התבונן בתאים מתחת למיקרוסקופ להיווצרות גופים עובריים, או EBs. לאחר מכן, טפל בצלחת תרבית תאים של 24 בארות עם 500 מיקרוליטר של מאגר שטיפה נגד היצמדות למשך 15 דקות ליצירת צלחת חיבור נמוכה. שטפו את הבארות פעמיים עם מיליליטר אחד של DPBS והוסיפו מיליליטר אחד של מדיום E8 Flex לכל באר.
בעזרת קצה פיפטה ברוחב מיליליטר אחד, השעו מחדש את ה- EBs בצלחת תרבית הבאר המיקרו. לאחר מכן, עבור כל באר של צלחת 24 הבארות הנמוכה, הוסף 100 מיקרוליטר של מדיום המכיל את ה-EBs. דגרו את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות.
כדי להתחיל, הפשירו את החלקים של מטריצת קרום המרתף על קרח למשך 30 דקות. ביום השני לאחר היווצרות ה-EB, בעזרת קצה פיפטה מקורר מראש של 20 מיקרוליטר, הוסף 15 מיקרוליטר של מטריצת קרום הבסיס הקרה כקרח בטיפות קטנות על גבי המדיום כדי לצפות את ה-EBs. מניחים את הצלחת בחממה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 48 שעות.
ביום הרביעי לאחר היווצרות EB, הסר בזהירות 500 מיקרוליטר של מדיום מבלי להפריע ל-EBs וחזור על ציפוי מטריצת ממברנת הבסיס כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן, הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום אינדוקציה עצבית של תאי גזע פלוריפוטנטיים על גבי התאים. הנח את הצלחת בחממת תאים של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
ביום השישי והשמיני, בצע שינוי חצי בינוני על ידי החלפה זהירה של 500 מיקרוליטר של מדיום ב-500 מיקרוליטר של מדיום אינדוקציה עצבית טרי. לאחר הדגירה בימים 10, 12 ו-14, בצע שינוי חצי בינוני עם מדיום תאי גזע עצביים. ביום ה-15, העבירו את הכדורים המכילים היטב, יחד עם המדיום, לצלחת חדשה של 12 בארות שטופלה בתמיסת שטיפה נגד היצמדות.
הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום התבגרות עצבי על גבי התרבות. במהלך שלב ההתבגרות, עקוב אחר המדיום לאיתור סימנים של דלדול חומרים מזינים כגון שינוי צבע. אם נצפתה דלדול חומרים מזינים, העבירו את האורגנואיד לצלחת של שש בארות.
ביום ה-17, השלם את מדיום ההתבגרות בציטוקינים למשך שישה ימים כדי להקל על התבגרות המיקרוגליה. לבסוף, ביום ה-23, אסוף את האורגנואידים העצביים המתקבלים לאפיון. תערובות HPC ו-iPSC איכותיות יצרו EBs תוך 24 שעות והראו צמיחה מתמשכת ופסולת מינימלית.
לאחר המעבר לצלחת חדשה המשיך ה-EBS לגדול עד שהגיע למישור בתווך ההתבגרות.
