우리는 유도 만능 줄기 세포 유래 조혈 전구 세포를 뉴런 오가노이드 유도 및 발달 과정에 통합하여 상주 미세아교세포와 뉴런을 포함하는 인간 뇌 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 인간의 뇌 발달 중 미세아교세포와 뉴런 사이의 상호 작용을 연구하기 위한 모델을 제공합니다. 3D 뇌 오가노이드는 유도 만능 줄기 세포 또는 iPSC에서 생성된 미니 뇌입니다.
동물과 인간을 대상으로 한 대안으로, 뇌 발달 및 신경 질환 연구에서 인간의 뇌를 모방하는 데 널리 사용되었습니다. 그들은 인간 건강 연구를 발전시키기 위한 훌륭한 도구입니다. 3D 인간 뇌 오가노이드에 대한 기존 프로토콜은 인간 뇌의 상주 면역 세포인 미세아교세포가 뉴런과 다른 배아 계통에서 발생하기 때문에 이러한 세포를 거의 생성하지 않습니다.
미세아교세포는 분화의 후반 단계에서 뇌 오가노이드에 첨가될 수 있지만, 인간의 뇌 발달을 더 잘 모방할 수 있는 방법이 필요합니다. 대부분의 다른 프로토콜은 대뇌 오가노이드 생성이 끝날 때 HPC 또는 미세아교세포를 추가합니다. 우리는 신경 유도 전에 혼합된 iPSC와 HPC로부터 배아체를 생성합니다.
이것은 미세아교세포 전구체가 발달 초기에 뇌로 이동하기 때문에 인간의 뇌 발달을 더 잘 모방할 수 있습니다. 또한 HPC를 사용하면 미세아교세포 분화 프로토콜이 30일 이상 걸리는 경우가 많기 때문에 총 분화 시간을 절약할 수 있습니다. 따라서 당사의 프로토콜은 시간과 시약 비용을 절약할 수 있습니다.
먼저 1ml의 E8 Flex 배지가 포함된 12웰 플레이트에서 해리된 인간 유도 만능 줄기세포 또는 iPSC를 배양하고 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 현미경으로 군체를 확인하고 우물의 모든 밭을 스캔하여 군체의 수를 세십시오. 조혈 키트에서 매체를 1ml의 매체 A로 교체하십시오.
플레이트를 인큐베이터에 다시 48시간 동안 넣습니다. 3일차에는 사용한 배지 500마이크로리터를 새로운 배지 A 500마이크로리터로 교체하고 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 배양합니다. 다음 날, 세포 성장과 iPSC 콜로니로부터의 분화를 관찰합니다.
배지를 1ml의 Medium B로 교체합니다.현미경으로 세포 분화를 모니터링하고 6-7일 동안 격일로 500마이크로리터의 Medium B로 절반의 배지 변경을 수행합니다. 10일째에는 정상적인 조혈전구세포(HPC)의 형태를 가진 밝은 단일원형 세포가 일부 느슨한 응집체와 함께 편평층 세포에 떠다니거나 느슨하게 부착된 세포의 존재를 관찰합니다. 다음으로, 1ml 피펫 팁으로 위아래로 세 번 피펫팅하여 차별화된 모든 HPC를 수집합니다.
세포를 15ml 튜브로 옮깁니다. 300G에서 5분 동안 세포 현탁액을 원심분리하고 펠릿을 1밀리리터의 Medium B에 재현탁탁합니다.20마이크로리터의 세포 현탁액을 세포 계수 챔버에 추가하고 세포 측정기를 사용하여 세포를 계수합니다. Medium B를 사용하여 세포 농도를 밀리리터당 100만 개의 세포로 조정합니다.연속 희석 배양 기술은 Medium A에서 배양이 끝날 때까지 상당한 형태학적 변화를 보이는 콜로니와 함께 적절한 수와 크기의 iPSC 콜로니를 생성했습니다.Medium B에서 3일 후, 균질한 원형 세포의 출현으로 HPC 분화가 관찰되었습니다.
10일째에 HPC는 큰 파편 없이 주로 군체와 같은 클러스터를 형성했습니다. 인간 iPSC와 구별된 HPC를 수집한 후 iPSC의 배양이 80% confluency에 도달했는지 확인합니다. 500마이크로리터의 접착 방지 헹굼 용액을 마이크로 웰 플레이트의 한 웰에 추가하여 기포 형성을 최소화합니다.
플레이트 홀더가 장착된 스윙 버킷 로터에서 2, 000G에서 5분 동안 플레이트를 회전시킵니다. 헹굼 용액을 완전히 제거하고 기포 없이 1ml의 DPBS로 웰을 두 번 세척한 다음 1mL의 DMEM/F-12로 웰을 세척합니다. iPSC를 1ml의 ACCUTASE 용액으로 처리하여 세포 해리를 시작합니다.
현미경으로 세포를 관찰하고 세포가 바닥에 붙어 있는 동안 세포 분리의 징후를 관찰합니다. ACCUTASE 용액을 1ml의 DMEM/F-12 배지로 교체한 다음 위아래로 혼합하여 세포를 단일 세포로 해리합니다. 해리된 세포를 15ml 튜브로 옮기고 DMEM/F-12 배지를 추가하여 최종 부피가 5ml에 도달하도록 합니다.
300G에서 5분 동안 셀을 원심분리하고 펠릿을 1ml의 E8 Flex 배지에 재현탁합니다. 세포를 계수하여 E8 Flex 배지에서 세포 농도를 밀리리터당 100만 개의 세포로 조정합니다. 다음으로, iPSC와 HPC를 2:1의 비율로 마이크로 웰 배양 플레이트의 웰에 혼합합니다.
배지 1ml당 1마이크로리터의 ROCK Inhibitor Y-27632 원액을 상등액에 넣고 플레이트를 좌우로 흔듭니다. 300G에서 5분 동안 플레이트를 돌리고 현미경으로 관찰하여 세포가 마이크로 웰에 정착했는지 확인합니다. 섭씨 37도에서 세포를 5%의 이산화탄소로 배양합니다.
48시간 후, 현미경으로 세포를 관찰하여 배아체(EB)가 형성되는지 확인합니다. 다음으로, 24웰 세포 배양 플레이트에 500마이크로리터의 Anti-Adherence Linsing Buffer를 15분 동안 처리하여 부착력이 낮은 플레이트를 만듭니다. 1ml의 DPBS로 웰을 두 번 세척하고 각 웰에 1ml의 E8 Flex 매체를 추가합니다.
1ml 너비의 오리피스 피펫 팁을 사용하여 마이크로 웰 배양 플레이트에 EB를 다시 현탁시킵니다. 그런 다음 부착성이 낮은 24웰 플레이트의 각 웰에 EB를 포함하는 배지 100마이크로리터를 추가합니다. 섭씨 37도, 이산화탄소 5% 인큐베이터에서 플레이트를 48시간 동안 배양합니다.
먼저 기저막 매트릭스의 부분 표본을 얼음 위에서 30분 동안 해동합니다. EB 형성 후 2일차에 미리 냉각된 20마이크로리터 피펫 팁을 사용하여 15마이크로리터의 얼음처럼 차가운 기저막 매트릭스를 배지 위에 작은 방울로 추가하여 EB를 코팅합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 인큐베이터에 48시간 동안 놓습니다.
EB 형성 후 4일차에 EB를 방해하지 않고 500마이크로리터의 배지를 조심스럽게 제거하고 앞에서 설명한 대로 기저막 매트릭스 코팅을 반복합니다. 그런 다음 세포 위에 500마이크로리터의 만능 줄기세포 신경 유도 배지를 추가합니다. 플레이트를 섭씨 37도, 5% 이산화탄소 세포 인큐베이터에 놓습니다.
6일차와 8일차에 500마이크로리터의 배지를 500마이크로리터의 새로운 신경 유도 배지로 조심스럽게 교체하여 절반 중간 변화를 수행합니다. 10일, 12일, 14일째에 배양 후 신경줄기세포 배지로 반 중간 변화를 수행합니다. 15일째에 배지와 함께 웰 함유 구체를 Anti-Adherence Rinsing Solution으로 처리된 새로운 12웰 플레이트로 옮깁니다.
배양물 위에 500마이크로리터의 뉴런 성숙 배지를 추가합니다. 성숙 단계에서는 배지에 색상 변화와 같은 영양소 고갈 징후가 있는지 모니터링합니다. 영양분 고갈이 관찰되면 오가노이드를 6웰 플레이트로 옮깁니다.
17일째에는 미세아교세포의 성숙을 촉진하기 위해 6일 동안 성숙 배지에 사이토카인을 보충합니다. 마지막으로, 23일째에 특성 분석을 위해 생성된 신경 오가노이드를 수집합니다. 고품질 HPC 및 iPSC 혼합물은 24시간 이내에 EB를 형성하여 지속적인 성장과 최소한의 파편을 보여주었습니다.
새로운 플레이트로 옮긴 후, EBS는 성숙 배지에서 정체기에 도달할 때까지 계속 성장했습니다.
