Name: induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos
Uploaded: 2017-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי תמיכה מ Wellcome Trust SIA פרס 100329 / Z / 12 / Z ל WAH ואת מלגת DFG KH 376 / 1-1 הוענק HK

<ol>
	<li>Grocott, M., Montgomery, H., Vercueil, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-altitude+physiology+and+pathophysiology:+implications+and+relevance+for+intensive+care+medicine.">High-altitude physiology and pathophysiology: implications and relevance for intensive care medicine.</a> Crit Care. 11 (1), 203 (2007).</li><li>Grant, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sea+level+and+acute+responses+to+hypoxia:+do+they+predict+physiological+responses+and+acute+mountain+sickness+at+altitude?.">Sea level and acute responses to hypoxia: do they predict physiological responses and acute mountain sickness at altitude?.</a> Brit J Sport Med. 36 (2), 141-146 (2002).</li><li>Kajimura, S., Aida, K., Duan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin-like+growth+factor-binding+protein-1+(IGFBP-1)+mediates+hypoxia-induced+embryonic+growth+and+developmental+retardation.">Insulin-like growth factor-binding protein-1 (IGFBP-1) mediates hypoxia-induced embryonic growth and developmental retardation.</a> PNAS. 102 (4), 1240-1245 (2005).</li><li>Ong, K. K., Dunger, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perinatal+growth+failure:+the+road+to+obesity,+insulin+resistance+and+cardiovascular+disease+in+adults.">Perinatal growth failure: the road to obesity, insulin resistance and cardiovascular disease in adults.</a> Best Pact Res Clin Endocrinol Metab. 16, 191-207 (2002).</li><li>Maxwell, P., Salnikow, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIF-1:+an+oxygen+and+metal+responsive+transcription+factor.">HIF-1: an oxygen and metal responsive transcription factor.</a> Cancer Bio Ther. 3 (1), 29-35 (2004).</li><li>Semenza, G. L., Roth, P. H., Fang, H. M., Wang, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+regulation+of+genes+encoding+glycolytic+enzymes+by+hypoxia-inducible+factor+1.">Transcriptional regulation of genes encoding glycolytic enzymes by hypoxia-inducible factor 1.</a> J Biol Chem. 269 (38), 23757-23763 (1994).</li><li>Yuan, Y., Hilliard, G., Ferguson, T., Millhorn, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cobalt+inhibits+the+interaction+between+hypoxia-inducible+factor-alpha+and+von+Hippel-Lindau+protein+by+direct+binding+to+hypoxia-inducible+factor-alpha.">Cobalt inhibits the interaction between hypoxia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha.</a> J Biol Chem. 278 (18), 15911-15916 (2003).</li><li>Elks, P., Renshaw, S. A., Meijer, A. H., Walmsley, S. R., van Eeden, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+HIFs,+buts+and+maybes+of+hypoxia+signalling+in+disease:+lessons+from+zebrafish+models.">Exploring the HIFs, buts and maybes of hypoxia signalling in disease: lessons from zebrafish models.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 8, 1349-1360 (2015).</li><li>Guo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-mimetic+agents+desferrioxamine+and+cobalt+chloride+induce+leukemic+cell+apoptosis+through+different+hypoxia-inducible+factor-1alpha+independent+mechanisms.">Hypoxia-mimetic agents desferrioxamine and cobalt chloride induce leukemic cell apoptosis through different hypoxia-inducible factor-1alpha independent mechanisms.</a> Apoptosis. 11 (1), 67-77 (2006).</li><li>Woods, I. G., Imam, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+of+severe+hypoxic+stress+during+development+in+zebrafish.">Transcriptome analysis of severe hypoxic stress during development in zebrafish.</a> Genom Data. 6, 83-88 (2015).</li><li>Rouhi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia-induced+metastasis+model+in+embryonic+zebrafish.">Hypoxia-induced metastasis model in embryonic zebrafish.</a> Nat Protoc. 5 (12), 1911-1918 (2010).</li><li>Stevenson, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+disruption+of+vertebrate+CAN+pathfinding+through+EphrinB2+is+rescued+by+magnesium.">Hypoxia disruption of vertebrate CAN pathfinding through EphrinB2 is rescued by magnesium.</a> PLoS Genet. 8 (4), e1002638 (2012).</li><li>Khaliullina, H., Love, N. K., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nutrient-Deprived+Retinal+Progenitors+Proliferate+in+Response+to+Hypoxia:+Interaction+of+the+HIF-1+and+mTOR+Pathway.">Nutrient-Deprived Retinal Progenitors Proliferate in Response to Hypoxia: Interaction of the HIF-1 and mTOR Pathway.</a> J Dev Biol. 4 (2), (2016).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J., Nieuwkoop, D. P., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , (1994).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Kohn, D. F., Wixson, S. K., White, W. J., Benson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. , (1997).</li><li>McDonough, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissection,+Culture,+and+Analysis+of+Xenopus+laevis+Embryonic+Retinal+Tissue.">Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue.</a> JoVE. (70), (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

כאן הצגנו שיטה חדשה אך קלה וחדשה לגרום היפוקסיה המותאמת לשימוש עם עופות צפרדע דג הזברה אבל יכול גם להיות מתאים לאורגניזמים מימיים אחרים. היתרון העיקרי של שיטה זו טמון בפשטות שלה ואת עלות העלות. עם זאת, התוצאות שהושגו בשיטה זו הן חזקות מאוד. הראינו כי היפוקסיה ניתן המו?...

מחקר Hypoxia יש יישומים רבים. אלה כוללים לחקור את הפתוגנזה ולפתח טיפולים למצבים רפואיים המאופיינים בהיפוקסיה 1 ומחלת גבהים גבוהה 2 . מתח היפוקסי גורם לשינויים מטבוליים משמעותיים בכל האורגניזמים הדורשים חמצן. הלחץ ההיפוקסי משפיע גם על התפתחות העובר ועל התפתחות המחלה ועל מספר מחלות אנושיות, כולל הגבלת צמיחה תוך רחמית. מתח היפוסי אינו יכול רק לגרום לירידה במשקל הלידה, לתמותה בעובר ולילוד, אלא גם לגרום לסיבוכים רבים בחיים הבוגרים, כגון מחלות לב וכלי דם, סוכרת מסוג 2, השמנת יתר ויתר לחץ דם 4 . לחץ היפוקסי הוא גם נצפה לעתים קרובות במהלך התפתחות הגידול מוצק, כאשר רקמת הגידול מתגבר אספקת הדם שלה. לכן חיוני כדי להיות מסוגל ללמוד את ההשפעות של היפוקסיה in vivo ו ישירות במהלך embr<html> יונית פיתוח. בין השיטות הידועות ביותר אשר הועסקו במחקר ההשפעות של היפוקסיה במהלך הפיתוח הוא השימוש של כלור קובלט במדיום הצמיחה או הדגירה של האורגניזם בחדר היפוקסי. קובלט כלוריד גורם באופן מלאכותי תגובה היפוקסית תחת ריכוז החמצן הרגיל, בשל תפקידה בייצוב של גורם היפוקסיה גורם 1 אלפא (HIF-1α) על ידי מניעת השפלה פרוטאוזומלית שלה 5 , 6 , 7 . עם זאת, להיות שיטה נוחה 8 , את השימוש של כלוריד קובלט, כמו גם אחרים דומים היפוקסיה כימית mimetics יכול להיות השפעה מזיקה unspecific על תאים ורקמות, למשל , אפופטוזיס 9 . לכן, תאים hypoxic הם שיטה טובה יותר עבור אינדוקציה של &quot;היפוקסיה טבעית&quot; באורגניזמים חיים במהלך ההתפתחות הרגילה. &quot;אנחנו מתמקדים בפיתוח מערכת לאינדוקציה של היפוקסיה בעוברי בעלי חיים ימיים, הן צפרדעים והן דג הזברה הפכו כעת לאורגניזמים של מודל חוליות אינפורמטיבי למחקרים על תהליכים ביולוגיים רבים, כמו גם מודלים למחלות שונות של בני אדם.צפרדעים ועופות דג הזברה מתפתחת חיצונית ומבטלת את הסיבוך של הפיצוי האימהי.כמובן, מסלול מהיר של פיתוח מאפשר לתמרן גורמים סביבתיים ולבחון את השינויים פנוטיפי של היווצרות איברים בזמן אמת.בנוסף, מרכיבים רבים של מסלולי התמרת האות העיקריים נשמרים מאוד ב אלה אורגניזמים מודל מאופיינים בפירוט על ידי גוף גדול של הספרות.היתרון העיקרי באמצעות צפרדעים ועובדי דג הזברה ללמוד את ההשפעות של היפוקסיה על התפתחות החולייתנים היא שכל התהליכים ניתן לפקח ישירות, שכן החמצן חודר במהירות העוברים. לפיכך, צפרדעים דג הזברה, בניגוד אורגניזמים מודל אחרים כגוןעכברים העכבר, ההשפעה של ריכוז חמצן מסוים ניתן ללמוד רקמות של עניין, מבלי לקחת בחשבון את נוכחות או חוסר של כלי הדם תפקודית. רוב setups זמין מסחרית עבור הדגירה hypoxic יש את החיסרון להיות גדול יחסית ויש עלויות ריצה גבוהות בהתאמה. מלבד העלות הראשונית הגבוהה שלהם וצריכת הגז, שיווי משקל ותחזוקה של תאי היפוקסיה נפוצים מחייבת שמירה על אווירה היפוקסית מתמדת כנגד התדרדרות הגז המתרחשת באופן טבעי בתאי אלה בגלל הגודל הגדול יותר ו / או הנשימה של האורגניזם. זה דורש תעסוקה של מאווררי גז ומערכת קירור, אשר מגדיל את כמות הציוד הדרוש נוסף, מעכב את המיומנות של החוקר הכוללת מקטין את הפשטות של הליך ניסיוני. לעומת זאת, את ההתקנה אנו מציגים כאן הוא חזק יחסית, אבל מאוד חסכונית, קטן, קל להקים ומאפשר fאסט גזיזת גז, אווירה hypoxic יציב חילופי פשוט של חומרים ופתרונות בתוך החדר. המערכת שלנו יכול להיות מועסק לשימוש עם כל אורגניזם מודל ימיים של עניין. בנינו תא hypoxic כי הוא קטן בנוחות ולכן ניתן להציב בתוך חממה משותפת, אשר בקלות מאפשר הליכים ניסיוניים בכל טמפרטורה מסוימת. מתן שליטה נוחה בטמפרטורה כמו גם ריכוז החמצן במדיום, היתרון של המערכת שלנו נגד חממות היפוקסיה זמין מסחרית טמון בגודלו הקטן ויעילות העלות. לפיכך, ההתקנה שלנו ניתן להקים באמצעות ציוד מעבדה כללית זמין עבור רוב המעבדות מחקר אינו דורש שום חומרים יקרים. בנוסף, ההתקנה שלנו אינה מייצרת חום, בניגוד החסרונות זמינים מסחרית היפוקסיה, ומאפשר להשתמש בטמפרטורות נמוכות יותר בטמפרטורת החדר להיות ממוקם באינקובטור. להSt הוא קריטי במיוחד עבור העבודה עם אורגניזמים קר דם כגון צפרדעים ודגים שבו שיעורי התפתחותיים מטבוליים תלויים מאוד בטמפרטורה. להיות מאוד חסכונית ובנו בקלות, החדר הדגירה שלנו הוא עדיין תכליתי מאוד בהקמת שונים hypoxic או hyperoxic התנאים, כמו גם המאפשר מהיר וקל הממשל של מדיה שונים ופתרונות עבור מספר עצום של תנאי הניסוי. בנוסף, באמצעות צלחת 24-היטב במקום מנות נפוץ או טנקים מעבדה 10 , 11 , 12 , המערכת שלנו מאפשרת תצפית וטיפול ניסיוני של כמה תנאים מוטציה בבת אחת. כדי לשלוט על אינדוקציה נכונה של היפוקסיה, יש לנו פיקוח על רמות של חלבון HIF-1α על ידי זיהוי כתם המערבי. בנוסף, מספר תאים מתרבים לפני ואחרי incubatioN בחדר היפוקסי ניתן להשתמש כדי לקבוע אם היפוקסיה כבר המושרה ברקמה. שיטה זו מבוססת על התוצאות שפורסמו בעבר 13 שלנו , מראה כי התפשטות עובריים בגזע נישה בתאי ניוון פוחתת על אינדוקציה של היפוקסיה. לכן, יש לנו פיקוח על רמת התפשטות תא גזע הרשתית על ידי הוספת 5-ethynyl-2&#39;-deoxyuridine (EDU) למדיום העובר ומדידת שילובו לתוך ה- DNA של תאים חדשים התפשטות.

<table><tbody><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST</td></tr><tr><td>Potassium chloride</td><td>Sigma</td><td>P9333</td><td>KCl/0.1x MBS, Embryo mediu,</td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td>0.1x MBS</td></tr><tr><td>Magnesium sulfate</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Calcium nitrate</td><td>Sigma</td><td>202967</td><td>Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS</td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/0.1x MBS, Embryo medium</td></tr><tr><td>Methylene blue</td><td>Sigma</td><td>M9140</td><td>Embryo medium</td></tr><tr><td>Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)</td><td>Sigma</td><td>CG10</td><td>Frog fertilization</td></tr><tr><td>Zebrafish breeding tank</td><td>Carolina</td><td>161937</td><td>Gas chamber construction</td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td>Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction</td></tr><tr><td>Epoxy resin</td><td>RS Components UK</td><td>Kit 199-1468</td><td></td></tr><tr><td>Gas distributor valve</td><td>WPI Luer Valves</td><td>Kit 14011</td><td>Aquatic tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>High precision gas valve</td><td>BOC&amp;nbsp;</td><td>200 bar HiQ C106X/2B</td><td>Gas tank attachment (Schema 1, &lt;strong&gt;I&lt;/strong&gt;)</td></tr><tr><td>5% oxygen and 95% N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; gas tank</td><td>BOC</td><td>226686-L</td><td>Hypoxic gas mixture</td></tr><tr><td>ceramic disc diffuser</td><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Art&amp;nbsp;</td><td>Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;J&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>silicone grease</td><td>Scientific Laboratory Supplies</td><td>VAC1100</td><td>Schema 1, &lt;strong&gt;K&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>oxymeter</td><td>Oxford Optronix&amp;nbsp;</td><td>Oxylite, CP/022/001</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>fibre-optic dissolved oxygen sensor</td><td>Oxford Optronix</td><td>HL_BF/OT/E</td><td>Hypoxic chamber setup</td></tr><tr><td>plastic pasteur pipette</td><td>Sterilin</td><td>STS3855604D</td><td>For embryo transfer</td></tr><tr><td>MS222&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E10521-50G</td><td>Embryo anesthetic</td></tr><tr><td>RIPA buffer&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>R0278-50ML</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Protease inhibitor</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>4x Laemmli loading buffer, 10x TBST</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer</td></tr><tr><td>beta-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126</td><td>4x Laemmli loading buffer</td></tr><tr><td>Trizma base&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td>5x Running buffer, Transfer buffer</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P2287-500ML</td><td>10x TBST</td></tr><tr><td>skim milk powder</td><td>Sigma</td><td>70166</td><td>Blocking Solution</td></tr><tr><td>Eppendorf microcentrifuge tube</td><td>Sigma</td><td>T9661</td><td></td></tr><tr><td>tissue homogenizer</td><td>Pellet Pestle Motor Kontes</td><td>Z359971</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>pellet pestles</td><td>Sigma</td><td>Z359947-100EA</td><td>Tissue homogenization</td></tr><tr><td>precast 12% gel</td><td>Biorad</td><td>Mini-ProteinTGX, 456-1043</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>protein ladder</td><td>Amersham</td><td>Full-Range Rainbow ladder, RPN800E</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>nitrocellulose membrane (0.45 &amp;micro;m)</td><td>Biorad</td><td>162-0115</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-HIF-1&amp;alpha; antibody</td><td>Abcam</td><td>ab2185</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>anti-&amp;alpha;-tubulin antibody</td><td>Sigma</td><td>T6074</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-rabbit antibody</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>goat anti-mouse antibody</td><td>Abcam</td><td>ab97080</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Pierce ECL 2 reagent&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>80196</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>ECL films Hyperfilm</td><td>GE Healthcare Amersham</td><td>28906837</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>5-Ethynyl-2&amp;prime;-deoxyuridine &amp;nbsp;</td><td>santa cruz</td><td>CAS&amp;nbsp;61135-33-9</td><td>EdU, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Phosphate-buffered Saline (PBS)</td><td>Oxoid</td><td>BR0014G</td><td>1x</td></tr><tr><td>Formaldehyde</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td>Fixation solution</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fluka</td><td>S/8600/60</td><td>Solution solution</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284-500ML</td><td>PBST</td></tr><tr><td>Heat-inactivated Goat Serum (HiGS)</td><td>Sigma</td><td>G6767-100ml</td><td>Blocking solution (EdU incorporation)</td></tr><tr><td>4&#039;,6-diamidino-2-phenylindole&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI, EdU incorporation</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation</td></tr><tr><td>glass vial</td><td>VWR</td><td>98178853</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Tissue-Plus optimal cutting temperature compound&amp;nbsp;</td><td>Scigen</td><td>4563</td><td>Embedding medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>cryostat Jung Fridgocut 2800E</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3035S</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>microscope slides Super-Frost plus Menzel glass</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>EdU Click-iT chemistry kit</td><td>Molecular Probes</td><td>C10338</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>FluorSave</td><td>Calbiochem</td><td>D00170200</td><td>Mounting medium, EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>coverslips</td><td>VWR</td><td>ECN631-1575</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>fluorescent microscope</td><td>Nikon</td><td>Eclipse 80i</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>confocal scanning microscope</td><td>Olympus</td><td>Fluoview FV1000</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr><tr><td>Volocity software</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>EdU incorporation analysis</td></tr></tbody></table>

induction of hypoxia in living frog and zebrafish embryos

כאן, אנו מציגים מערכת חדשנית לאינדוקציה היפוקסיה, אשר פיתחנו כדי לחקור את ההשפעות של היפוקסיה באורגניזמים ימיים כגון צפרדע ועופות דג הזברה. המערכת שלנו כוללת חדר שמציעה התקנה פשוטה, כי הוא חזק בכל זאת כדי לשמר ולשמור על ריכוז חמצן מסוים הטמפרטורה בכל פתרון ניסיוני של בחירה. המערכת המוצגת היא מאוד חסכונית אבל פונקציונלי מאוד, זה מאפשר אינדוקציה וקיימות של היפוקסיה עבור ניסויים ישיר vivo ו לתקופות זמן שונות עד 48 שעות. כדי לבחון ולחקור את ההשפעות של היפוקסיה, השתמשנו בשתי שיטות - מדידת רמות של גורם היפוקסיה-גורם להופעת אלפא (HIF-1α) בעוברים שלמים או רקמות ספציפיות וקביעת התאמת תאי גזע ברשתית באמצעות 5-ethynyl-2&#39;- Deoxyuridine (Edu) שילוב לתוך ה- DNA. רמות HIF-1α יכולות לשמש סמן היפוקסיה כללי בכל העובר או הרקמותשל בחירה, כאן רשתית עובריים. שילוב EDU לתוך תאים מתרבים של הרשתית עובריים הוא פלט מסוים של אינדוקציה היפוקסיה. לכן, הראינו כי אבות הרשתית היפוקסי ירידה התפשטות תוך 1 שעה של הדגירה תחת 5% חמצן של עוברי הצפרדע וגם דג הזברה. לאחר השתלבותנו, ניתן להשתמש בהתקנה שלנו לשימוש עם אורגניזמים קטנים של מודלים ימיים, בניסויים ישירים של vivo , בכל תקופת זמן נתונה ובתת-חמצן נורמלי, היפוקסי או היפר-חמצני או תחת כל תערובת גז נתונה אחרת.

להעסיק את מערכת קאמרית hypoxic שאנו מציגים כאן מאפשר ללמוד את ההשפעות של היפוקסיה באופן אינדיבידואלי in vivo חיות חיים שלם. היפוקסיה יכול להיגרם על ידי הנחת צפרדע או עוברי דג הזברה כולו בתא היפוקסי ( איור 1 ), ולהיות מבוצע על שילובים שונ...

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos at JoVE.com

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

אנו מציגים מערכת קאמרית היפוקרטית חדש לשימוש עם אורגניזמים ימיים כגון צפרדע ועופות דג הזברה. המערכת שלנו היא פשוטה, חזקים, חסכונית ומאפשר אינדוקציה וקיימות של היפוקסיה in vivo ועד 48 שעות. אנו מציגים 2 שיטות לשחזור כדי לפקח על היעילות של היפוקסיה.

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

induction-of-hypoxia-in-living-frog-and-zebrafish-embryos

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K Views.  University of Cambridge.  אנו מציגים מערכת קאמרית היפוקרטית חדש לשימוש עם אורגניזמים ימיים כגון צפרדע ועופות דג הזברה. המערכת שלנו היא פשוטה, חזקים, חסכונית ומאפשר אינדוקציה וקיימות של היפוקסיה in vivo ועד 48 שעות. אנו מציגים 2 שיטות לשחזור כדי לפקח על היעילות של הי...

Video: Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Microbead Implantation in the Zebrafish Embryo

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic conservation, as well as similarities in cellular, molecular, and physiological processes, with other vertebrates including humans. During early ontogeny, zebrafish embryos are optically transparent, allowing researchers to visualize the dynamics of organogenesis using a simple stereomicroscope. Microbead implantation is a method that enables tissue manipulation through the alteration of factors in local environments. This allows researchers to assay the effects of any number of signaling molecules of interest, such as secreted peptides, at specific spatial and temporal points within the developing embryo. Here, we detail a protocol for how to manipulate and implant beads during early zebrafish development.

The zebrafish is an excellent model system for genetic and developmental studies. Bead implantation is a valuable tissue manipulation technique that can be used to interrogate developmental mechanisms by introducing alterations in local cellular environments. This protocol describes how to perform microbead implantation in the zebrafish embryo.

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

The zebrafish has emerged as a valuable genetic model system for the study of developmental biology and disease. Zebrafish share a high degree of genomic ...

Visualizing the Developing Brain in Living Zebrafish using Brainbow and Time-lapse Confocal Imaging

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in vivo imaging techniques can provide a clear window into these processes in the living organism. For example, dividing cells and their progeny can be followed in real time as the nervous system forms. In recent years, technical advances in multicolor techniques have expanded the types of questions that can be investigated. The multicolor Brainbow approach can be used to not only distinguish among like cells, but also to color-code multiple different clones of related cells that each derive from one progenitor cell. This allows for a multiplex lineage analysis of many different clones and their behaviors simultaneously during development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells over real time within the developing zebrafish nervous system. This is particularly useful for following cellular interactions among like cells, which are difficult to label differentially using traditional promoter-driven colors. Our approach can be used for tracking lineage relationships among multiple different clones simultaneously. The large datasets generated using this technique provide rich information that can be compared quantitatively across genetic or pharmacological manipulations. Ultimately the results generated can help to answer systematic questions about how the nervous system develops.

In vivo imaging is a powerful tool that can be used to investigate the cellular mechanisms underlying nervous system development. Here we describe a technique for using time-lapse confocal microscopy to visualize large numbers of multicolor Brainbow-labeled cells in real time within the developing zebrafish nervous system.

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

Development of the vertebrate nervous system requires a precise coordination of complex cellular behaviors and interactions. The use of high resolution in ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Biology

חקירת פיתוח באמצעות מניפולציה של איתות אופטוגנטי בדגי זברה

Optogenetic Signaling Activation in Zebrafish Embryos

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally manipulate signaling are required to understand how signaling is interpreted in these wide-ranging contexts. Molecular optogenetic&#160;tools can provide reversible, tunable manipulations of signaling pathway activity with a high degree of spatiotemporal control and have been applied in vitro, ex vivo, and in vivo. These tools couple light-responsive protein domains, such as the blue light homodimerizing light-oxygen-voltage sensing (LOV) domain, with signaling effectors to confer light-dependent experimental control over signaling. This protocol provides practical guidelines for using the LOV-based bone morphogenetic protein (BMP) and Nodal signaling activators bOpto-BMP and bOpto-Nodal in the optically accessible early zebrafish embryo. It describes two control experiments: A quick phenotype assay to determine appropriate experimental conditions, and an immunofluorescence assay to directly assess signaling. Together, these control experiments can help establish a pipeline for using optogenetic tools in early zebrafish embryos. These strategies provide a powerful platform to investigate the roles of signaling in development, health, and physiology.

מחבר זרקור: מניפולציה איתות בעוברים של דגי זברה כדי לפענח החלטות גורל התא 

Optogenetic manipulation of signaling pathways can be a powerful strategy to investigate how signaling is decoded in development, regeneration, homeostasis, and disease. This protocol provides practical guidelines for using light-oxygen-voltage sensing domain-based Nodal and bone morphogenic protein (BMP) signaling activators in the early zebrafish embryo.

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

Signaling pathways orchestrate fundamental biological processes, including development, regeneration, homeostasis, and disease. Methods to experimentally ...

Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function. Our studies have found that dying cells send signals to their live neighbors to form and contract a ring of actin and myosin that ejects it out from the epithelial sheet while closing any gaps that might have resulted from its exit, a process termed cell extrusion1. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe a method to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis. To visualize extrusion, we inject a red fluorescent protein labeled probe for F-actin into one-cell stage transgenic zebrafish embryos expressing green fluorescent protein in the epidermis and induce apoptosis by addition of G418 to larvae. We then use time-lapse imaging on a spinning disc confocal microscope to observe actin dynamics and epithelial cell behaviors during the process of apoptotic cell extrusion. This approach allows us to investigate the extrusion process in live epithelia and will provide an avenue to study disease states caused by the failure to eliminate apoptotic cells.

Dying cells are extruded from epithelial tissues by concerted contraction of neighboring cells without disrupting barrier function. The optical clarity of developing zebrafish provides an excellent system to visualize extrusion in living epithelia. Here we describe methods to induce and image extrusion in the larval zebrafish epidermis at cellular resolution.

הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

Homeostatic maintenance of epithelial tissues requires the continual removal of damaged cells without disrupting barrier function.  Our studies have found ...

Triggering Cell Stress and Death Using Conventional UV Laser Confocal Microscopy

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and cell-cell interactions in the CNS in real-time. Previously, studying these cell-specific responses after injury often required complicated setups or the transfer of cells or animals into different, non-physiological environments, confounding immediate and short-term analysis. For example, drug-mediated ablation approaches often lack the specificity that is required to study single-cell responses and immediate cell-cell interactions. Similarly, while high-power pulsed laser ablation approaches provide very good control and tissue penetration, they require specialized equipment that can complicate real-time visualization of cellular responses. The refined UV laser ablation approach described here allows researchers to stress or kill an individual cell in a dose- and time-dependent manner using a conventional confocal microscope equipped with a 405-nm laser. The method was applied to selectively ablate a single neuron within a dense network of surrounding cells in the zebrafish spinal cord. This approach revealed a dose-dependent response of the ablated neurons, causing the fragmentation of cellular bodies and anterograde degeneration along the axon within minutes to hours. This method allows researchers to study the fate of an individual dying cell and, importantly, the instant response of cells-such as microglia and astrocytes-surrounding the ablation site.

Targeted manipulations to cause directed stress or death in individual cells have been relatively difficult to accomplish. Here, a single-cell-resolution ablation approach to selectively stress and kill individual cells in cell culture and living animals is described based on a standard confocal UV laser.

מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר

Using a standard confocal setup, a UV ablation method can be utilized to selectively induce cellular injury and to visualize single-cell responses and ...

Neuroscience

Metabolic Profile Analysis of Zebrafish Embryos

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these relationships will help to understand the underlying etiology for a range of diseases linked with mitochondrial dysfunction, such as diabetes and obesity. Recent advances in instrumentation, has enabled the monitoring of distinct parameters of mitochondrial function in cell lines or tissue explants. Here we present a method for a rapid and sensitive analysis of mitochondrial function parameters in vivo during zebrafish embryonic development using the Seahorse bioscience XF 24 extracellular flux analyser. This protocol utilizes the Islet Capture microplates where a single embryo is placed in each well, allowing measurement of bioenergetics, including: (i) basal respiration; (ii) basal mitochondrial respiration (iii) mitochondrial respiration due to ATP turnover; (iv) mitochondrial uncoupled respiration or proton leak and (iv) maximum respiration. Using this approach embryonic zebrafish respiration parameters can be compared between wild type and genetically altered embryos (mutant, gene over-expression or gene knockdown) or those manipulated pharmacologically. It is anticipated that dissemination of this protocol will provide researchers with new tools to analyse the genetic basis of metabolic disorders in vivo in this relevant vertebrate animal model.

Zebrafish represent a powerful vertebrate model that has been under-utilised for metabolic studies. Here we describe a rapid way to measure the in vivo metabolic profile of developing zebrafish that allows the comparison of different mitochondrial function parameters between genetically or pharmacologically manipulated embryos, thereby increasing the applicability of this organism.

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

A growing goal in the field of metabolism is to determine the impact of genetics on different aspects of mitochondrial function. Understanding these ...

Imaging and 3D Reconstruction of Cerebrovascular Structures in Embryonic Zebrafish

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo. The small size and relative transparency of zebrafish embryos make them particularly useful for the visual examination of processes such as heart and vascular development. In several recent studies transgenic zebrafish that express EGFP in vascular endothelial cells were used to image and analyze complex vascular networks in the brain and retina, using confocal microscopy. Descriptions are provided to prepare, treat and image zebrafish embryos that express enhanced green fluorescent protein (EGFP), and then generate comprehensive 3D renderings of the cerebrovascular system. Protocols include the treatment of embryos, confocal imaging, and fixation protocols that preserve EGFP fluorescence. Further, useful tips on obtaining high-quality images of cerebrovascular structures, such as removal the eye without damaging nearby neural tissue are provided. Potential pitfalls with confocal imaging are discussed, along with the steps necessary to generate 3D reconstructions from confocal image stacks using freely available open source software.

Imaging of cerebrovascular development in larval zebrafish is described. Techniques to facilitate 3D imaging and modify cerebrovascular development using chemical treatments are also provided.

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה

Zebrafish are a powerful tool to study developmental biology and pathology in vivo.  The small size and relative transparency of zebrafish embryos make ...

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Microbead השרשה בעובר דג הזברה

מדמיין את המוח המתפתח בחיים דגים באמצעות הברקשת וזמן-הדמיה קונמיקוד

שני הפוטונים מבוסס Photoactivation עוברי דג הזברה לחיות

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

הפעלת איתות אופטוגנטי בעוברים של דגי זברה

הדמיה חיה של שחול Cell מן האפידרמיס של דג הזברה פיתוח

מתח ומות תא מפעיל באמצעות מיקרוסקופ Confocal הקונבנציונלי UV הליזר

ניתוח פרופיל המטבולי של עוברי דג זברה

הדמיה ו3D שחזור של מבני כלי דם במוח בעוברי דג הזברה