Presentiamo un protocollo per generare un organoide cerebrale umano contenente microglia e neuroni residenti incorporando cellule progeniche ematopoietiche derivate da cellule staminali pluripotenti indotte nel processo di induzione e sviluppo dell'organoide neuronale. Questo metodo fornisce un modello per studiare le interazioni tra microglia e neuroni durante lo sviluppo del cervello umano. Gli organoidi cerebrali 3D sono mini cervelli generati da cellule staminali pluripotenti indotte o iPSC.
Come alternativa agli animali e ai soggetti umani, sono stati ampiamente utilizzati nell'imitazione del cervello umano nella ricerca sullo sviluppo del cervello e sui disturbi neurologici. Sono ottimi strumenti per far progredire la ricerca sulla salute umana. I protocolli convenzionali per gli organoidi cerebrali umani 3D raramente generano microglia, la cellula immunitaria residente del cervello umano, poiché queste cellule derivano da un lignaggio embrionale diverso rispetto ai neuroni.
Mentre le microglia possono essere aggiunte agli organoidi cerebrali in una fase successiva della differenziazione, è necessario un metodo per imitare meglio lo sviluppo del cervello umano. La maggior parte degli altri protocolli aggiunge HPC o microglia alla fine della generazione di organoidi cerebrali. Generiamo corpi embrioidi da iPSC e HPC miste prima dell'induzione neurale.
Questo può imitare meglio lo sviluppo del cervello umano poiché i precursori della microglia migrano verso il cervello molto presto nello sviluppo. Inoltre, l'utilizzo delle HPC consente di risparmiare tempo totale di differenziazione poiché i protocolli di differenziazione della microglia spesso richiedono più di 30 giorni. Pertanto, il nostro protocollo può far risparmiare tempo e costi dei reagenti.
Per iniziare, la coltura ha dissociato le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo o iPSC in una piastra a 12 pozzetti contenente un millilitro di terreno E8 Flex, incubando le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 24 ore. Il giorno successivo, controlla le colonie al microscopio e conta il numero di colonie scansionando tutti i campi in un pozzo. Sostituire il terreno con un millilitro di terreno A del kit ematopoietico.
Rimettere la piastra nell'incubatrice per 48 ore. Il terzo giorno, sostituire 500 microlitri del terreno esaurito con 500 microlitri di terreno A fresco e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, osservare la crescita e la differenziazione cellulare dalle colonie di iPSC.
Sostituire il terreno con un millilitro di Medium B.Monitorare la differenziazione cellulare al microscopio ed eseguire un cambio di mezzo terreno con 500 microlitri di Medium B a giorni alterni per sei-sette giorni. Il giorno 10, osservare la presenza di singole cellule rotonde luminose con la morfologia delle normali cellule progenitrici ematopoietiche, o HPC, galleggianti o debolmente attaccate alla cellula dello strato piatto con alcuni aggregati sciolti. Successivamente, raccogliere tutti gli HPC differenziati pipettandoli su e giù tre volte con un puntale per pipetta da un millilitro.
Trasferire le cellule in una provetta da 15 millilitri. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 G per cinque minuti e risospendere il pellet in un millilitro di terreno B. Aggiungere 20 microlitri di sospensione cellulare in una camera di conteggio delle cellule e contare le cellule utilizzando un misuratore di cellule. Regolare la concentrazione cellulare a 1 milione di cellule per millilitro utilizzando il terreno B.La tecnica di coltura di diluizione seriale ha prodotto un numero e una dimensione appropriati di colonie di iPSC con colonie che mostravano cambiamenti morfologici significativi entro la fine della coltura nel terreno A.Dopo tre giorni nel terreno B, è stata osservata una differenziazione HPC con la comparsa di cellule rotonde omogenee.
Al decimo giorno, le HPC hanno prevalentemente formato ammassi simili a colonie senza detriti significativi. Dopo aver raccolto le HPC differenziate dalle iPSC umane, verificare che la coltura di una iPSC abbia raggiunto l'80% di confluenza. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di risciacquo antiaderente in un pozzetto della piastra a micropozzetti, riducendo al minimo la formazione di bolle.
Far girare la piastra a 2.000 G per cinque minuti in un rotore a secchiello oscillante dotato di portapiatti. Rimuovere completamente la soluzione di risciacquo e lavare i pozzetti due volte con un millilitro di DPBS e poi con un millilitro di DMEM/F-12 senza generare bolle. Trattare le iPSC con un millilitro di soluzione di ACCUTASE per avviare la dissociazione cellulare.
Osservare le cellule al microscopio, notando segni di separazione cellulare mentre le cellule rimangono attaccate al fondo. Sostituire la soluzione di ACCUTASI con un millilitro di terreno DMEM/F-12, quindi mescolare su e giù per dissociare le cellule in singole cellule. Trasferire le cellule dissociate in una provetta da 15 millilitri e aggiungere il terreno DMEM/F-12 per raggiungere un volume finale di cinque millilitri.
Centrifugare le celle a 300G per cinque minuti e risospendere il pellet in un millilitro di terreno E8 Flex. Contare le cellule per regolare la concentrazione delle cellule a 1 milione di cellule per millilitro nel terreno E8 Flex. Quindi, miscelare le iPSC con le HPC in un rapporto di due a uno nel pozzetto della piastra di coltura a micropozzetti.
Aggiungere un microlitro di soluzione madre di ROCK Inhibitor Y-27632 per un millilitro di terreno nel surnatante e agitare la piastra da un lato all'altro. Girare la piastra a 300 G per cinque minuti e osservare al microscopio per confermare che le cellule si sono depositate nei micro pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.
Dopo 48 ore, osservare le cellule al microscopio per la formazione di corpi embrioidi, o EB. Successivamente, trattare una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti con 500 microlitri di tampone di risciacquo antiaderente per 15 minuti per creare una piastra di fissaggio bassa. Lavare i pozzetti due volte con un millilitro di DPBS e aggiungere un millilitro di terreno E8 Flex a ciascun pozzetto.
Utilizzando un puntale per pipetta con orifizio largo un millilitro, risospendere gli EB nella piastra di coltura a micropozzetti. Quindi, per ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti a basso atteggiamento, aggiungere 100 microlitri di terreno contenente gli EB. Incubare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per 48 ore.
Per iniziare, scongelare le aliquote della matrice della membrana basale sul ghiaccio per 30 minuti. Il secondo giorno dopo la formazione dell'EB, utilizzando un puntale per pipetta da 20 microlitri pre-raffreddato, aggiungere 15 microlitri di matrice di membrana basale ghiacciata in piccole gocce sopra il terreno per rivestire gli EB. Metti la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 48 ore.
Il quarto giorno dopo la formazione dell'EB, rimuovere con cura 500 microlitri di terreno senza disturbare gli EB e ripetere il rivestimento della matrice della membrana basale come dimostrato in precedenza. Quindi, aggiungi 500 microlitri di terreno di induzione neurale di cellule staminali pluripotenti sopra le cellule. Posizionare la piastra in un incubatore cellulare a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica.
Il sesto e l'ottavo giorno, eseguire un cambio semi-terreno sostituendo con cura 500 microlitri di terreno con 500 microlitri di terreno di induzione neurale fresco. Dopo l'incubazione nei giorni 10, 12 e 14, eseguire un cambio semi-medio con il terreno delle cellule staminali neurali. Il giorno 15, trasferire le sfere ben contenute, insieme al terreno, in una nuova piastra a 12 pozzetti trattata con soluzione di risciacquo antiaderenza.
Aggiungere 500 microlitri di terreno di maturazione neuronale sopra la coltura. Durante la fase di maturazione, monitorare il terreno per segni di esaurimento dei nutrienti come un cambiamento di colore. Se si osserva un esaurimento dei nutrienti, trasferire l'organoide in una piastra a sei pozzetti.
Il giorno 17, integrare il terreno di maturazione con citochine per sei giorni per facilitare la maturazione microgliale. Infine, il giorno 23, raccogli gli organoidi neurali risultanti per la caratterizzazione. Le miscele HPC e iPSC di alta qualità hanno formato EB entro 24 ore, mostrando una crescita continua e detriti minimi.
Dopo il trasferimento in una nuova piastra, l'EBS ha continuato a crescere fino a raggiungere un plateau nel mezzo di maturazione.
