Nous présentons un protocole pour générer un organoïde cérébral humain contenant des microglies et des neurones résidents en incorporant des cellules progéniques hématopoïétiques dérivées de cellules souches pluripotentes induites dans le processus d’induction et de développement d’organoïdes neuronaux. Cette méthode fournit un modèle pour étudier les interactions entre la microglie et les neurones au cours du développement du cerveau humain. Les organoïdes cérébraux 3D sont des mini-cerveaux générés à partir de cellules souches pluripotentes induites ou iPSC.
En tant qu’alternative aux animaux et aux sujets humains, ils ont été largement utilisés pour imiter le cerveau humain dans la recherche sur le développement du cerveau et les troubles neurologiques. Ce sont d’excellents outils pour faire progresser la recherche en santé humaine. Les protocoles conventionnels pour les organoïdes cérébraux humains en 3D génèrent rarement des microglies, la cellule immunitaire résidente du cerveau humain, car ces cellules proviennent d’une lignée embryonnaire différente de celle des neurones.
Bien que la microglie puisse être ajoutée aux organoïdes cérébraux à un stade ultérieur de la différenciation, une méthode pour mieux imiter le développement du cerveau humain est nécessaire. La plupart des autres protocoles ajoutent des HPC ou des microglies à la fin de la génération d’organoïdes cérébraux. Nous générons des corps embryoïdes à partir d’iPSC et de HPC mixtes avant l’induction neurale.
Cela pourrait mieux imiter le développement du cerveau humain, car les précurseurs de la microglie migrent vers le cerveau très tôt dans le développement. De plus, l’utilisation du HPC permet d’économiser un temps de différenciation total, car les protocoles de différenciation des microglies prennent souvent plus de 30 jours. Par conséquent, notre protocole peut économiser du temps et des coûts de réactifs.
Pour commencer, la culture de cellules souches pluripotentes induites par l’homme ou iPSC dans une plaque de 12 puits contenant un millilitre de milieu E8 Flex, incube les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Le lendemain, vérifiez les colonies au microscope et comptez le nombre de colonies en balayant tous les champs dans un puits. Remplacez le milieu par un millilitre de milieu A du kit hématopoïétique.
Remettez la plaque dans l’incubateur pendant 48 heures. Le troisième jour, remplacez 500 microlitres de milieu épuisé par 500 microlitres de milieu A frais, et incubez pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, observez la croissance cellulaire et la différenciation des colonies d’iPSC.
Remplacez le milieu par un millilitre de Medium B.Surveillez la différenciation cellulaire au microscope et effectuez un demi-changement de medium avec 500 microlitres de Medium B tous les deux jours pendant six à sept jours. Le jour 10, observez la présence de cellules rondes uniques brillantes avec la morphologie de cellules progénitrices hématopoïétiques normales, ou HPC, flottant ou faiblement attachées à la cellule de la couche plate avec quelques agrégats lâches. Ensuite, collectez tous les HPC différenciés en pipetant trois fois vers le haut et vers le bas avec une pointe de pipette d’un millilitre.
Transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres. Centrifugez la suspension cellulaire à 300G pendant cinq minutes et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu B. Ajoutez 20 microlitres de suspension cellulaire dans une chambre de comptage cellulaire et comptez les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire. Ajustez la concentration cellulaire à 1 million de cellules par millilitre à l’aide du milieu B.La technique de culture par dilution en série a produit un nombre et une taille appropriés de colonies iPSC, les colonies présentant des changements morphologiques significatifs à la fin de la culture dans le milieu A.Après trois jours dans le milieu B, une différenciation HPC a été observée avec l’apparition de cellules rondes homogènes.
Au jour 10, les HPC ont principalement formé des grappes de type colonie sans débris significatifs. Après avoir collecté les HPC différenciés des iPSC humains, vérifiez que la culture d’une iPSC a atteint 80 % de confluence. Ajoutez 500 microlitres de solution de rinçage anti-adhérence dans un puits de la plaque de micro-puits, minimisant ainsi la formation de bulles.
Faites tourner la plaque à 2 000 G pendant cinq minutes dans un rotor à godets oscillant équipé de porte-plaques. Retirez complètement la solution de rinçage et lavez les puits deux fois avec un millilitre de DPBS, puis avec un millilitre de DMEM/F-12 sans générer de bulles. Traitez les iPSC avec un millilitre de solution d’ACCUTASE pour initier la dissociation cellulaire.
Observez les cellules au microscope, en notant les signes de séparation cellulaire pendant que les cellules restent attachées au fond. Remplacez la solution d’ACCUTASE par un millilitre de milieu DMEM/F-12, puis mélangez de haut en bas pour dissocier les cellules en cellules uniques. Transférez les cellules dissociées dans un tube de 15 millilitres et ajoutez du DMEM/F-12 pour atteindre un volume final de cinq millilitres.
Centrifugez les cellules à 300G pendant cinq minutes et remettez la pastille en suspension dans un millilitre de milieu E8 Flex. Comptez les cellules pour ajuster la concentration cellulaire à 1 million de cellules par millilitre dans le milieu E8 Flex. Ensuite, mélangez les iPSC avec les HPC dans un rapport de deux pour un dans le puits de la plaque de culture du micropuits.
Ajouter un microlitre de solution mère d’inhibiteur de ROCK Y-27632 par millilitre de milieu dans le surnageant et agiter la plaque d’un côté à l’autre. Faites tourner la plaque à 300G pendant cinq minutes et observez au microscope pour confirmer que les cellules se sont installées dans les micro-puits. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone.
Après 48 heures, observez les cellules au microscope pour la formation de corps embryoïdes, ou EB. Ensuite, traitez une plaque de culture cellulaire de 24 puits avec 500 microlitres de tampon de rinçage anti-adhérence pendant 15 minutes pour créer une plaque à faible attache. Lavez les puits deux fois avec un millilitre de DPBS et ajoutez un millilitre de milieu E8 Flex dans chaque puits.
À l’aide d’une pointe de pipette à orifice d’un millilitre de large, remettre en suspension les EB dans la plaque de culture à micropuits. Ensuite, pour chaque puits de la plaque à 24 puits à faible fixation, ajoutez 100 microlitres de milieu contenant les EB. Incuber la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures.
Pour commencer, décongelez les aliquotes de la matrice de la membrane basale sur de la glace pendant 30 minutes. Le deuxième jour après la formation de l’EB, à l’aide d’une pointe de pipette de 20 microlitres pré-refroidie, ajoutez 15 microlitres de matrice de membrane basale glacée en petites gouttes sur le dessus du milieu pour enrober les EB. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 48 heures.
Le quatrième jour après la formation de l’EB, retirez soigneusement 500 microlitres de milieu sans perturber les EB et répétez le revêtement de la matrice de la membrane basale comme démontré précédemment. Ensuite, ajoutez 500 microlitres de cellules souches pluripotentes de milieu d’induction neurale sur les cellules. Placez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius et à 5 % de dioxyde de carbone.
Les sixième et huitième jours, effectuez un changement de demi-milieu en remplaçant soigneusement 500 microlitres de milieu par 500 microlitres de milieu d’induction neurale frais. Après l’incubation aux jours 10, 12 et 14, effectuez un changement de demi-milieu avec un milieu de cellules souches neurales. Le 15e jour, transférez les sphères contenant le puits, ainsi que le fluide, dans une nouvelle plaque à 12 puits traitée avec une solution de rinçage anti-adhérence.
Ajoutez 500 microlitres de milieu de maturation neuronale sur la culture. Pendant la phase de maturation, surveillez le milieu pour détecter des signes d’épuisement des nutriments tels qu’un changement de couleur. Si l’épuisement des nutriments est observé, transférez l’organoïde dans une plaque à six puits.
Le 17e jour, complétez le milieu de maturation avec des cytokines pendant six jours pour faciliter la maturation microgliale. Enfin, le 23e jour, collectez les organoïdes neuronaux résultants pour la caractérisation. Des mélanges HPC et iPSC de haute qualité ont formé des EB en 24 heures, montrant une croissance continue et un minimum de débris.
Après le transfert dans une nouvelle plaque, EBS a continué à croître jusqu’à atteindre un plateau dans le milieu de maturation.
