نقدم بروتوكولا لتوليد عضية في الدماغ البشري تحتوي على الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية المقيمة من خلال دمج الخلايا السلبية المستحثة متعددة القدرات المشتقة من الخلايا الجذعية المكونة للدم في عملية الحث والتطور العضوي العصبي. توفر هذه الطريقة نموذجا لدراسة التفاعلات بين الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا العصبية أثناء نمو الدماغ البشري. عضيات الدماغ ثلاثية الأبعاد هي أدمغة صغيرة تم إنشاؤها من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات أو iPSCs.
كبديل للحيوانات والبشر ، فقد تم استخدامها على نطاق واسع في تقليد أدمغة الإنسان في أبحاث نمو الدماغ والاضطرابات العصبية. إنها أدوات رائعة للنهوض بأبحاث صحة الإنسان. نادرا ما تولد البروتوكولات التقليدية لحضيات الدماغ البشري ثلاثية الأبعاد الخلايا الدبقية الصغيرة ، وهي الخلية المناعية المقيمة في الدماغ البشري ، حيث تنشأ هذه الخلايا من سلالة جنينية مختلفة عن الخلايا العصبية.
بينما يمكن إضافة الخلايا الدبقية الصغيرة إلى عضيات الدماغ في مرحلة لاحقة من التمايز ، هناك حاجة إلى طريقة لتقليد نمو الدماغ البشري بشكل أفضل. تضيف معظم البروتوكولات الأخرى الحوسبة عالية الحمل أو الخلايا الدبقية الصغيرة في نهاية توليد العضيات الدماغية. نقوم بتوليد أجسام جنينية من iPSCs مختلطة و HPCs قبل الحث العصبي.
قد يحاكي هذا بشكل أفضل نمو الدماغ البشري حيث تهاجر السلائف الدبقية الصغيرة إلى الدماغ في وقت مبكر جدا من التطور. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الحوسبة عالية الأداء توفر وقت التمايز الكلي حيث تستغرق بروتوكولات التمايز الدبقية الصغيرة غالبا أكثر من 30 يوما. لذلك ، يمكن لبروتوكولنا توفير الوقت وتكاليف الكاشف.
للبدء, مزرعة فصلت الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان أو iPSCs في صفيحة 12 بئر تحتوي على ملليلتر واحد من E8 فليكس متوسط, احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. في اليوم التالي ، تحقق من المستعمرات تحت المجهر واحسب عدد المستعمرات عن طريق مسح جميع الحقول في البئر. استبدل الوسيط بملليلتر واحد من Medium A من مجموعة المكونة للدم.
ضع الطبق مرة أخرى في الحاضنة لمدة 48 ساعة. في اليوم الثالث ، استبدل 500 ميكرولتر من الوسط المستهلك ب 500 ميكرولتر من المتوسط الطازج ، واحتضانه لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي, مراقبة نمو الخلايا والتمايز من مستعمرات iPSC.
استبدل الوسيط بملليلتر واحد من تمايز الخلايا المتوسطة B.Monitor تحت المجهر وقم بإجراء تغيير نصف متوسط مع 500 ميكرولتر من Medium B كل يومين لمدة ستة إلى سبعة أيام. في اليوم 10 ، لاحظ وجود خلايا مستديرة واحدة ساطعة مع مورفولوجيا الخلايا السلفية المكونة للدم الطبيعية ، أو HPCs ، العائمة أو المرتبطة بشكل فضفاض بخلية الطبقة المسطحة مع بعض الركام السائب. بعد ذلك، اجمع كل الحوسبة عالية الأداء المتمايزة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل ثلاث مرات باستخدام طرف ماصة سعة مليلتر واحد.
انقل الخلايا إلى أنبوب سعة 15 ملليلترا. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية عند 300 جم لمدة خمس دقائق وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من متوسط ب ، أضف 20 ميكرولترا من تعليق الخلية في غرفة عد الخلايا وعد الخلايا باستخدام عداد الخلية. ضبط تركيز الخلية إلى 1 مليون خلية لكل مليلتر باستخدام متوسط B.أنتجت تقنية ثقافة التخفيف التسلسلي أعدادا وأحجام مناسبة من مستعمرات iPSC مع مستعمرات تظهر تغيرات مورفولوجية كبيرة بنهاية الثقافة في الوسط A.بعد ثلاثة أيام في الوسط B, لوحظ تمايز HPC مع ظهور خلايا مستديرة متجانسة.
في اليوم العاشر ، شكلت الحوسبة عالية الأداء في الغالب مجموعات شبيهة بالمستعمرة بدون حطام كبير. بعد جمع الحوسبة عالية الأداء المتمايزة عن iPSCs البشرية, تحقق من أن ثقافة iPSC قد وصلت إلى 80٪ التقاء. أضف 500 ميكرولتر من محلول الشطف المضاد للالتصاق في بئر واحد من لوحة البئر الصغيرة ، مما يقلل من تكوين الفقاعات.
قم بتدوير اللوحة عند 2 ، 000 جم لمدة خمس دقائق في دوار دلو متأرجح مزود بحاملات ألواح. قم بإزالة محلول الشطف تماما واغسل الآبار مرتين بمليلتر واحد من DPBS ثم باستخدام مليلتر واحد من DMEM / F-12 دون توليد فقاعات. علاج iPSCs مع مليلتر واحد من محلول ACCUTASE لبدء تفكك الخلية.
راقب الخلايا تحت المجهر ، مع ملاحظة علامات انفصال الخلايا بينما تظل الخلايا ملتصقة بالقاع. استبدل محلول ACCUTASE بمليلتر واحد من وسط DMEM / F-12 ، ثم امزج لأعلى ولأسفل لتفكيك الخلايا إلى خلايا مفردة. انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب سعة 15 مليلتر وأضف وسط DMEM / F-12 للوصول إلى الحجم النهائي البالغ خمسة ملليلتر.
الطرد المركزي للخلايا عند 300G لمدة خمس دقائق وأعد تعليق الحبيبات في مليلتر واحد من وسط E8 Flex. عد الخلايا لضبط تركيز الخلية على 1 مليون خلية لكل مليلتر في وسط E8 Flex. التالى, خلط iPSCs مع الحوسبة عالية الأداء بنسبة اثنين إلى واحد في بئر لوحة ثقافة الآبار الصغيرة.
أضف ميكرولتر واحدا من محلول مخزون ROCK Inhibitor Y-27632 لكل مليلتر واحد من الوسط في المادة الطافية وقم بهز اللوحة من جانب إلى آخر. قم بتدوير اللوحة عند 300 جم لمدة خمس دقائق وراقب تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا قد استقرت في الآبار الصغيرة. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد 48 ساعة ، راقب الخلايا تحت المجهر بحثا عن تكوين الأجسام الجنينية ، أو EBs. بعد ذلك ، عالج صفيحة زراعة الخلايا المكونة من 24 بئرا بسعة 500 ميكرولتر من عازلة الشطف المضادة للالتصاق لمدة 15 دقيقة لإنشاء لوحة تثبيت منخفضة. اغسل الآبار مرتين بمليلتر واحد من DPBS وأضف ملليلتر واحد من وسط E8 Flex إلى كل بئر.
باستخدام طرف ماصة بفتحة بعرض مليلتر واحد، أعد تعليق EBs في لوحة زراعة الآبار الدقيقة. ثم ، لكل بئر من اللوحة ذات 24 البئرة منخفضة التعلق ، أضف 100 ميكرولتر من الوسط الذي يحتوي على EBs. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.
للبدء ، قم بإذابة أجزاء مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد لمدة 30 دقيقة. في اليوم الثاني بعد تكوين EB ، باستخدام طرف ماصة مبرد مسبقا سعة 20 ميكرولتر ، أضف 15 ميكرولترا من مصفوفة الغشاء القاعدي المثلج في قطرات صغيرة أعلى الوسط لتغطية EBs. ضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.
في اليوم الرابع بعد تكوين EB ، قم بإزالة 500 ميكرولتر من الوسط بعناية دون إزعاج EBs وكرر طلاء مصفوفة الغشاء القاعدي كما هو موضح سابقا. ثم أضف 500 ميكرولتر من وسط الحث العصبي للخلايا الجذعية متعددة القدرات فوق الخلايا. ضع اللوحة في حاضنة خلايا 37 درجة مئوية و 5٪ من ثاني أكسيد الكربون.
في اليومين السادس والثامن ، قم بإجراء تغيير نصف متوسط عن طريق استبدال 500 ميكرولتر من الوسط بعناية ب 500 ميكرولتر من وسط الحث العصبي الجديد. بعد الحضانة في الأيام 10 و 12 و 14 ، قم بإجراء تغيير نصف متوسط باستخدام وسط الخلايا الجذعية العصبية. في اليوم 15 ، انقل الكرات المحتوية على جيدا ، جنبا إلى جنب مع الوسط ، إلى صفيحة جديدة مكونة من 12 بئرا معالجة بمحلول شطف مضاد للالتصاق.
أضف 500 ميكرولتر من وسط النضج العصبي فوق المزرعة. خلال مرحلة النضج ، راقب الوسط بحثا عن علامات استنفاد العناصر الغذائية مثل تغير اللون. إذا لوحظ استنفاد المغذيات ، انقل العضوي إلى طبق من ستة آبار.
في اليوم 17 ، استكمل وسط النضج بالسيتوكينات لمدة ستة أيام لتسهيل نضوج الخلايا الدبقية الصغيرة. أخيرا ، في اليوم 23 ، اجمع العضيات العصبية الناتجة للتوصيف. شكلت مخاليط الحوسبة عالية الجودة والخلطات عالية الجودة EBs في غضون 24 ساعة تظهر نموا مستمرا والحد الأدنى من الحطام.
بعد النقل إلى لوحة جديدة ، استمر EBS في النمو حتى وصل إلى هضبة في وسط النضج.
