פיתוח מודל עכברי להיצרות אנסטומטית בעורק הירך

כאן אנו מציגים מודל עכברי לאנסטומוזיס של עורק הירך, המציע לחוקרים מודל בעל ערך לבעלי חיים לחקר והדמיה של היצרות אנסטומוטית של כלי הדם. התפתחות זו חיונית לקידום הבנתנו את הפתופיזיולוגיה העומדת בבסיס מצב זה ולהקלה על מחקר מדויק ויעיל יותר במחלות כלי דם.

בניתוחי כלי דם, אנסטומוזה של כלי דם היא טכניקה משחזרת נפוצה המשמשת להחזרת זרימת הדם. עם זאת, רסטנוזיס אנסטומוטי הוא סיבוך שכיח לאחר הניתוח, הנגרם בעיקר על ידי פגיעה בכלי הדם הנגרמת על ידי ניתוח, היפרפלזיה אינטימית ותגובות דלקתיות. מודל האנסטומוזה של עורק הירך של העכבר נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים של רסטנוזיס אנטומוטי ותיקון כלי דם. אנסטומוזה של עורק הירך מקצה לקצה בהנחיית מיקרוסקופ מאפשרת סימולציה מדויקת של פגיעה בכלי הדם ותהליכי תיקון לאחר ניתוח, ומספקת כלי ניסיוני אמין לחקר המנגנונים הפתולוגיים הקשורים לרסטנוזיס. מחקר זה מתמקד בחידוד הטכניקה הכירורגית לאנסטומוזה של עורק הירך בעכברים. באמצעות חידודים בטכניקות כירורגיות ואופטימיזציה של פרטים טכניים, השגנו עלייה ניכרת בשיעור ההצלחה וביכולת השחזור של המודל. שיפורים ספציפיים כוללים טכניקות טיפול מעודנות בכלי הדם במהלך הניתוח, בחירת חומרי תפר ואופטימיזציה של שיטות תפירה כדי למזער דליפה אנסטומוטית וחסימה לאחר הניתוח. המחקר מדגיש גם את התצפית על היפרפלזיה אינטימית, שיפוץ כלי הדם באתר האנטומוטי וסבלנות כלי דם לטווח ארוך. באמצעות מחקר זה, אנו מספקים מדריך תפעולי תמציתי ויעיל לביצוע אנסטומוזיס של עורק הירך בעכבר, המציע תמיכה טכנית אמינה למחקרים ניסיוניים בניתוחי כלי דם. עבודה זו מניחה בסיס איתן לחקירות עוקבות של מנגנונים קשורים והערכות של התערבות טיפולית.

אנסטומוזה וסקולרית היא טכניקה בסיסית בהליכי רה-וסקולריזציה, הממלאת תפקיד מרכזי בשיקום זרימת הדם וקידום תיקון רקמות. עם זאת, התרחשות של היפרפלזיה אינטימית (IH) באתר האנטומוטי מובילה לעתים קרובות לרסטנוזיס, מה שפוגע באופן משמעותי בסבלנות כלי הדם לטווח הארוך ומשפיע לרעה על התוצאות הקליניות ועל הפרוגנוזה של המטופל ^1,2. IH קשור קשר הדוק לפגיעה בכלי הדם תוך ניתוחית, המאופיינת בשגשוג ונדידה חריגים של תאי שריר חלק (SMCs) ושקיעה מוגזמת של מטריצה חוץ-תאית¹. תהליכים פתולוגיים מורכבים וקשורים זה בזה מדגישים את הצורך הקריטי להבהיר את המנגנונים המדויקים של IH כדי ליידע אסטרטגיות מניעה והתערבות נגד רסטנוזיס.

בשל יכולת השחזור והשליטה המדויקת שלהם, מודלים עכבריים של אנסטומוזה של עורק הירך אומצו באופן נרחב במחקר על תיקון כלי דם ומנגנונים פתולוגיים נלווים ^3,4,5. אנסטומוזה מקצה לקצה בעכברים מאפשרת סימולציה מדויקת של פגיעה אנסטומוטית לאחר ניתוח, ומאפשרת תצפית דינמית על IH ושיפוץ כלי הדם. מודלים אלה מספקים פלטפורמה אידיאלית לחקר אינטראקציות בין תאי אנדותל ו-SMCs לאחר ניתוח ולהערכת תפקידן של תגובות דלקתיות בהתפתחות IH⁶. על ידי שילוב של ניתוח היסטולוגי וזיהוי סמנים ביולוגיים מולקולריים, חוקרים יכולים לזהות באופן מקיף את המניעים העיקריים של IH, ולהציע תובנות קריטיות לגבי המנגנונים הבסיסיים והמטרות הטיפוליות הפוטנציאליות.

התפתחות IH מונעת על ידי מספר גורמים, כאשר שינויים המודינמיים הם תורם קריטי ^1,7,8. באתר האנטומוטי, אזורים של מתח גזירה נמוך ומדד גזירה תנודתי חריג (OSI) הם גירויים עיקריים להתפשטות ונדידה של SMCs ^1,7. יתר על כן, אי התאמות תאימות וזרימת דם סוערת סביב האנסטומוזה מחמירים את הפגיעה באנדותל, ומאיצים את התקדמות IH⁸. ממצאים אלה מדגישים את הצורך באופטימיזציה של טכניקות כירורגיות ובחירת חומרים מתאימים להפחתת שינויים פתולוגיים באתר האנטומוטי.

בשנים האחרונות, בלונים מצופים תרופות (DCBs) הוכיחו יעילות בהפחתת IH. חומרים אנטי-פרוליפרטיביים, כגון פקליטקסל, מעכבים ביעילות את התפשטות ה-SMC והנדידה, ומפחיתים משמעותית את שכיחות הרסטנוזיס⁹. עם זאת, אתגרים נמשכים במערכות זרימה גבוהה כמו שתלים עורקיים, שבהם תנודות מהירות במתח הגזירה וקצבי זרימת דם גבוהים עלולים להפחית את היעילות של DCBs¹. מחקרים עתידיים צריכים להתמקד בשיפור הישימות של DCBs בסביבות המודינמיות מגוונות תוך מינוף ההתקדמות במדע הביו-חומרים כדי לפתח פתרונות מותאמים אישית ויעילים יותר לריסטנוזיס לאחר ניתוח. בנוסף להתערבויות מקומיות, גורמים מערכתיים כגון סוכרת, טרשת עורקים ותפקוד לקוי של האנדותל משפיעים באופן משמעותי על התפתחות IH¹⁰. לכן, אסטרטגיות קליניות צריכות לתת עדיפות לניהול מקיף של מצבים מערכתיים אלה כדי לשפר את בריאות כלי הדם הכללית. במקביל, זיהוי וניטור של סמנים ביולוגיים חדשים להתקדמות IH יכולים לספק הזדמנויות להתערבות מוקדמת. השילוב של בינה מלאכותית בתכנון כירורגי מציע אפיק מבטיח נוסף, המאפשר תכנון חישובי של תצורות אנטומוטיות אופטימליות, ובכך לשפר את שיעורי ההצלחה הניתוחיים ולהאריך את הסבלנות של כלי הדם.

בחקר IH לאחר ניתוח ומנגנונים פתולוגיים נלווים, מודל האנסטומוזה של עורק הירך בולט ברמת הדיוק והשחזור שלו¹¹. מודל זה, המשתמש בטכניקות מיקרוכירורגיות ליצירת אנסטומוזה מקצה לקצה של עורק הירך בעכברים, מחקה במדויק טראומה כירורגית מקומית באתר האנטומוטי. היתרונות של מודל זה בולטים במיוחד בהשוואה למודלים כגון פציעה הנגרמת על ידי חוט או חלופות אחרות. יתרון טכני מרכזי של מודל האנסטומוזה של עורק הירך הוא יכולתו לגרום לפגיעה בכלי הדם מקומית ומבוקרת^{מאוד 12}. הטראומה הכירורגית מאפשרת השפעה ממוקדת על האזור האנטומוטי, תוך חיקוי הדוק של דפוסי הפגיעה שנתקלים בהם בניתוחי כלי דם קליניים. לעומת זאת, מודלים של פציעות הנגרמות על ידי חוטים, למרות שהם פשוטים יותר בטכניקה, גורמים לעתים קרובות לדהודלציה נרחבת של האנדותל, מה שמקשה על שכפול טראומה מקומית שנצפתה בניתוחים אנטומוטיים בחיים האמיתיים¹³. יתר על כן, השונות בעומק ובהיקף הנזק הנגרם על ידי חוטים בניסויים שונים עשויה להפחית את יכולת השחזור של התוצאות. האופי הנרחב והמפוזר של הנזק במודלים של פגיעות חוטים הופך אותו לפחות רלוונטי לחקירת ה-IH המקומי הקשור ספציפית לאזורים אנסטומוטיים.

במחקר זה, תוך שימוש במודל עכברי של אנסטומוזיס של עורק הירך, חידדנו באופן שיטתי טכניקות כירורגיות כדי לשפר את שיעורי ההצלחה של המודל ולהבטיח סבלנות ארוכת טווח של האתר האנטומוטי. תוך מינוף הבסיס המבוסס הזה, המחקר שלנו התעמק במנגנונים המולקולריים והתאיים העומדים בבסיס IH, כולל מסלולים רגולטוריים השולטים בנדידה והתפשטות של SMCs, כמו גם תפקידם של מתווכים דלקתיים בהתקדמות IH. באמצעות מחקר זה, אנו שואפים לתרום תובנות תיאורטיות חדשות על המנגנונים של רסטנוזיס פוסט-אנסטומוטי ולבסס בסיס ניסיוני לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות המכוונות ספציפית ל-IH.

מחקר זה אושר, ובעלי החיים טופלו בהתאם להנחיות לניהול ושימוש בחיות מעבדה בסין. המחקר עמד בקפדנות בדרישות האתיות של ניסויים בבעלי חיים, באישור ועדת האתיקה של בעלי חיים (מספר אישור: SWMU20221109-019). כאן, עכברי C57BL/6 בריאים בני 8 שבועות משני המינים, במשקל שבין 20-22 גרם, שימשו למחקר הנוכחי. החיות שוכנו במרכז חיות המעבדה של האוניברסיטה הרפואית של דרום-מערב (SWMU).

1. הליכים טרום ניתוחיים

1. להרדים עכברים עם שאיפת איזופלורן 3% בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי המוסד. לאחר תחילת ההרדמה, ודא את אובדן הרפלקסים המוחלט, כגון חוסר תגובה לצביטה בבוהן, כדי להבטיח הרדמה עמוקה לפני שתמשיך בניתוח. לאחר השראת הרדמה, הפחיתו את ריכוז האיזופלורן ל-1%-1.5% כדי לשמור על מצב ההרדמה, ולהבטיח שבעלי החיים יישארו בהרדמה עמוקה לאורך כל ההליך הכירורגי.
2. מקם את העכבר על משטח כירורגי, והאריך את הגפיים האחוריות מבלי למתוח יתר על המידה.
3. יש למרוח קרם אפילציה על אזור הירכיים למשך כדקה אחת להסרת שיער, ולאחר מכן לנקות את האזור ביסודיות כדי להסיר שאריות קרם ושערות תועות.
4. יש לחטא את אתר הניתוח בתמיסת יוד פי 3 כדי להתכונן לשלבים הכירורגיים הבאים.

2. אנסטומוזה וסקולרית של עורק הירך

1. תחת סטריאומיקרוסקופ, בצע חתך באורך של כ -1.5 ס"מ לאורך ציר עצם הירך באזור אמצע הירך באמצעות מיקרואזמל. לאחר חיתוך העור, בצע דיסקציה קהה כדי להפריד את הרקמה התת עורית עד לחשיפת עורק הירך ווריד הירך. עורק הירך ממוקם לרוחב וריד הירך, והעצב ממוקם בצורה עליונה ורוחבית לעורק.
2. נתח בזהירות את הרקמה כדי לחשוף במלואו קטע של 1 ס"מ מעורק הירך. בעזרת מלקחיים המוסטטיים, הפרד בעדינות את השרירים והפאשיה העמוקה כדי לחשוף את העצבים, העורקים והווריד. במהלך תהליך זה, העצב ממוקם בשכבה החיצונית ביותר, העורק נמצא באמצע והווריד נמצא מבפנים.
3. הפרד בעדינות את עורק הירך ווריד הירך באמצעות דיסקציה קהה. היזהר להשתמש במלקחיים עדינים כדי להפריד את רקמת החיבור כדי לחשוף את עורק הירך במלואו. הנח כרית סטרילית מתחת לעורק הירך כדי למנוע פגיעה מקרית במחט במהלך ההליך. לאחר מכן, מהדקים בעדינות את עורק הירך בעזרת מלקחיים כדי לגרום להמטומה.
4. . בעזרת מלקחיים המוסטטיים קטנים, מהדקים את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של עורק הירך. השתמש במספריים עדינים כדי לחצות בצורה מסודרת וסימטרית את עורק הירך.
5. שאב 1% תמיסת מלח הפרין (1% הפרין במי מלח רגילים) במזרק של 1 מ"ל להזרקה באנסטומוזה של עורק הירך. הוסיפו מי מלח כ-3-4 טיפות בכל פעם, עם מספר שטיפות חוזרות ונשנות כדי להסיר קרישי דם מהעורק.
6. כדי לספק תמיכה לכלי במהלך התפירה הבאה ולדמות את הנזק הפוטנציאלי שנגרם כתוצאה מהתערבות חוט מנחה, הכנס תפר כירורגי באורך 1 ס"מ 6-0 לעורק הירך. הקפידו על יישור וחלקות נאותים של עורק הירך כדי להקל על תהליך התפירה.
7. השתמש בתפר כירורגי 12-0 לאנסטומוזה והתאם את זווית המחט מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח שהמחט תצא מהצד הפנימי לצד החיצוני של הכלי.
8. צור שמונה אתרי ניקוב, ארבעה בקצה הפרוקסימלי וארבעה בקצוות הדיסטליים של עורק הירך.
   1. ודא שאתרי הניקוב ממוקמים בנקודות הקדמיות, האחוריות, השמאליות והימניות של הכלי, עם אתרים מתאימים בקצוות הדיסטליים והפרוקסימליים. בעת בחירת הנקודות הללו, ודא שכלי הדם נגיש, הימנע ממבנים אנטומיים קריטיים ושמור על זרימת דם טובה במהלך אנסטומוזיס.
   2. הפוך את קוטר הפנצ'ר לקטן מספיק כדי למזער את הנזק לכלי אך גדול מספיק להליכים הדרושים. מחט תפר 12-0 משמשת בדרך כלל לניקוב.
9. חותכים ארבעה אורכים של תפר 12-0, כל אחד באורך 3-4 ס"מ, ומשחילים כל אחד דרך חור הניקוב המתאים. התחל בקשירת קשר רופף כדי למנוע הסתבכות של התפרים.
10. הסר את התפר 6-0 המשמש לתמיכה בכלי וקשר היטב את הקשרים. שחרר את המלקחיים ההמוסטטיים לאחר השלמת האנסטומוזיס.
11. מגרדים בעדינות את עורק הירך בעזרת מלקחיים מעוקלים מהקצה הפרוקסימלי לקצה הדיסטלי כדי לבדוק אם יש סבלנות, ומבטיחים שהדם זורם בחופשיות דרך הכלי. בנוסף, בדוק היטב את אתר האנסטומוזה לאיתור סימנים לדליפה ברורה.

3. תפר לאחר הניתוח

1. לתפור את עור הגפה התחתונה באמצעות תפר כירורגי 6-0, תוך שימוש בתפר קטוע כדי להבטיח יישור מדויק וקירוב מאובטח של הרקמה. לאחר תפירת הפצע, יש למרוח תמיסת יוד על האזור התפור כדי לחטא את הפצע ולהפחית עוד יותר את הסיכון לזיהום.
2. שמור על תנאים סטריליים לאחר הניתוח. אין להשאיר את בעל החיים ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה על החזה. אין להחזיר את בעלי החיים שעברו ניתוח לחברת בעלי חיים אחרים עד להחלמתם המלאה.

4. תצפית ודגימה לאחר הניתוח

1. בדוק באופן קבוע את אתר הניתוח לאיתור סימני דלקת, נפיחות מוגזמת או הפרשות. תעד את מצבו של בעל החיים והעניק טיפול מתאים לפי הצורך.
2. 4 שבועות לאחר הניתוח, יש להמית את העכברים באופן אנושי בהתאם להנחיות האתיות המאושרות. להמתת חסד, יש לתת מנת יתר של נתרן פנטוברביטל (150 מ"ג/ק"ג, הזרקה תוך צפקית), מה שמבטיח נקודת קצה אנושית ונטולת כאבים. לאחר אישור אובדן ההכרה והפסקת הרפלקסים, התחל איסוף רקמות.
   הערה: במחקרים הראשוניים, מצאנו כי קצירת הדגימות במהלך השבוע^השלישי או מוקדם יותר לא תרמה להיווצרות היפרפלזיה אינטימית. לעומת זאת, איסוף דגימות בשבוע^החמישי הוביל להיפרפלזיה אינטימית מוגזמת. צמיחה מוגזמת זו לא רק עיכבה את התצפית בניסויים הבאים אלא גם הציבה סיכונים בריאותיים פוטנציאליים לעכברים. אז השבוע^הרביעי נבחר כאן.
3. אסוף דגימות של עורק הירך, שבמרכזן אתר האנסטומוזיס, המשתרע כ -1 ס"מ לשני הכיוונים מהאנסטומוזיס. בעזרת מספריים עדינים, כרתו את עורק הירך יחד עם כל רקמת השריר שמסביב.
4. לאחר הכריתה, שטפו את הדגימה ב-PBS כדי להסיר שאריות דם, ולאחר מכן קבעו אותה בפורמלין ניטרלי של 10% למשך 1-2 ימים להמשך שימור וניתוח.
   הערה: פורמלין ניטרלי של 10% הוא בחירה קלאסית לקיבוע רקמות, הצלבה יעילה של חלבונים ושמירה על שלמות מבנה הרקמות, מה שהופך אותו למתאים במיוחד לאחסון רקמות לטווח ארוך. לעומת זאת, 4% פרפורמלדהיד (PFA) הוא קיבוע מתון יותר המתאים יותר לשימור עדין יותר של מבנים תוך-תאיים (כגון חומצות גרעין וחלבונים) ומשמש בדרך כלל לאימונוהיסטוכימיה או ניתוח אימונופלואורסצנטי. המטרה העיקרית של מחקר זה היא להתבונן בשינויים ההיסטולוגיים בכלי הדם (כגון היפרפלזיה אינטימית ושיפוץ כלי הדם) ולא בלוקליזציה המדויקת של מולקולות או חלבונים תוך-תאיים. לכן, אפקט הקיבוע של פורמלין מספיק כדי לענות על צרכי הניסוי. אם המחקר דורש נאמנות מולקולרית גבוהה יותר (כגון שימור RNA או חלבונים), PFA עשוי להיות בחירה טובה יותר.

5. התייבשות והטמעה של עורק הירך

1. לאחר הקיבוע, הניחו את הדגימות בקופסאות הטמעה. שטפו את דגימות עורק הירך במים זורמים למשך 6-8 שעות לפני העיבוד לייבוש רקמות באמצעות מעבד רקמות אוטומטי.
2. יוצקים פרפין מומס לתבניות הטבעה, מרימים בזהירות את עורק הירך בעזרת מלקחיים מחוממים, ומטמיעים אותו אנכית בתבנית המכילה את הפרפין המותך. הפרד את המכסה ואת החלק התחתון של קופסת ההטבעה, כאשר החלק התחתון מונח על גבי תבנית ההטבעה. הוסף כמות קטנה של פרפין מומס כדי לקבע אותו במקום, המשמש כבסיס לגוש הפרפין. יש להימנע בקפידה מבועות אוויר.
3. כאשר גוש השעווה התקרר עד לנקודה שבה נוצר סרט שעווה שקוף על פני השטח, הניחו אותו על שולחן הקפאה להתקררות מהירה.
4. הסר את גוש השעווה המוטבע מתבנית ההטבעה וחתוך את עודפי הפרפין המקיפים את גוש הרקמות בזהירות באמצעות להב חד.

6. הכנת קטעי פרפין בעורק הירך

1. התקן את הלהב על המיקרוטום, וודא שהסכין חדה לחתך.
2. קבע את בלוק הפרפין על המחזיק והתאם את הבלוק ביחס ללהב למיקום המתאים לחיתוך.
3. חתוך את הבלוק כדי להבטיח שניתן לחתוך את הרקמה המוטבעת לחלוטין. הגדר את עובי החלקים הראשוניים ל 15-20 מיקרומטר.
4. התאם את עובי החתך לכ-4 מיקרומטר והמשך בחיתוך.
5. הרם את החלקים בעדינות בעזרת מברשת והעביר אותם בעזרת פינצטה עדינה מיוחדת לקופסת שקופיות מלאה במים חמים (כ-45 מעלות צלזיוס) כדי להקל על הציפה.
6. העבירו את קטעי הפריסה לשקופיות מיקרוסקופ. מקם את המגלשות בזווית של 45 מעלות כדי לנקז עודפי מים. לאחר מכן, מכניסים את השקופיות לתנור לייבוש, בדרך כלל בחום של 37 מעלות למשך שעתיים, ולאחר מכן אפייה בחום של 60 מעלות למשך שעה.

7. צביעת המטוקסילין-אאוזין

1. הרטיבו את החלקים באמצעות סדרה של ריכוזי אתנול מדורגים, כולל אתנול מוחלט, 95%, 80% ו-70% אתנול, כאשר כל שלב לוקח כ-5 דקות. לאחר מכן, שטפו את החלקים במים מזוקקים כדי להסיר שאריות אתנול.
2. מכתימים את החלקים בהמטוקסילין למשך כ-8-10 דקות ושוטפים היטב 3 פעמים במים זורמים כדי להסיר כתמים עודפים.
3. כדי להבדיל בין החלקים המוכתמים, יש למרוח תמיסת אלכוהול של חומצה הידרוכלורית 1% לתקופה קצרה של 5-7 שניות.
4. כדי להעצים את הצבע הכחול, יש לטפל בקטעים בתמיסת אמוניה של 1:400 למשך דקה.
5. לאחר השריית אתנול של 75%, יש להכתים את החלקים באאוזין למשך 36 שניות. לאחר הצביעה, יש לייבש את החלקים ברצף עם סדרה עולה של ריכוזי אתנול (80%, 90%, 95% ו-100%), כאשר כל שלב נמשך 3-5 שניות.
6. לבסוף, אופים את החלקים בחום של 37 מעלות צלזיוס בתנור למשך 10 דקות, מורחים כמה טיפות של חומר איטום על שקופית זכוכית, מכסים את הדגימה בכיסוי כדי לאבטח אותם במקומם, ומניחים לה להתייבש באוויר באופן טבעי.

בניתוח אנסטומוזה של כלי הדם, פגיעה מכנית בדופן כלי הדם יכולה להפעיל תאים אינטימיים ולעורר התפשטות. שינויים במהירות ובכיוון זרימת הדם לאחר האנסטומוזה יכולים גם לעורר את התפשטותם של תאים אינטימיים. תהליך שיפוץ כלי הדם וחוסר היציבות ארוך הטווח של זרימת הדם יכולים גם לעורר בהתמדה תאים אינטימיים, מה שבסופו של דבר מוביל לעיבוי.

כדי לאשר את הצלחת מודל האנסטומוזה של עורק הירך, בוצעה צביעת המטוקסילין ואאוזין על קטעי עורק הירך שנקטפו. נצפתה נוכחות של היפרפלזיה אינטימית משמעותית, המעידה על שיפוץ כלי דם מוצלח ומאשרת את הצלחת הליך האנסטומוזה (איור 1A).

כדי להעריך היפרפלזיה אינטימית, סומנו^וזוהו הגבולות של מבני כלי דם מרכזיים, כולל הלומן, הלמינה האלסטית הפנימית (IEL) והלמינה האלסטית החיצונית (EEL). על סמך גבולות אלה, מדידות שטח בוצעו באמצעות תוכנת ניתוח תמונה. השטח האינטימי חושב על ידי מדידת השטח הכולל המוקף על ידי ה-IEL והפחתת שטח הלומן כדי לקבל את שטח האזור האינטימי בפועל. השטח המדיאלי נקבע על ידי מדידת השטח הכולל המוקף על ידי ה-EEL והחסרת שטח ה-IEL, והניב את שטח האזור המדיאלי בפועל. כדי להעריך את היקף ההיפרפלזיה האינטימית, חושב היחס בין האזור האינטימי לאזור המדיאלי (יחס אינטימי/מדיאלי), המספק ייצוג ברור וכמותי של מידת העיבוי האינטימי (איור 1B).

זיהוי ספציפי של סמן האנדותל של כלי הדם CD31 וסמן השריר החלק α-SMA בוצע בשיטת הצביעה האימונוהיסטוכימית הן בקבוצת הביקורת הרגילה והן בקבוצת הניסוי לאחר ניתוח אנסטומוזה של עורק הירך (איור 2).

איור 1: צביעת המטוקסילין ואאוזין בקטע הרקמה האנסטומוטית של עורק הירך. (A) לאחר 4 שבועות של ניתוח, נלקחו דגימות של עורק הירך מהגפה האחורית השמאלית של העכבר. רקמת העורק הוטבעה בפרפין ונחתכה לעובי של 4 מיקרומטר. צביעת המטוקסילין ואאוזין בוצעה על החלקים, וחשפו היפרפלזיה אינטימית משמעותית בעורק הירך. (B) ההיסטוגרמה הסטטיסטית הראתה שהיחס בין ניאואינטימה למדיה גדל באופן משמעותי בכלי הדם האנטומוטיים. הנתונים מוצגים כממוצע ± שגיאת תקן של הממוצע (SEM). המובהקות הסטטיסטית הוערכה באמצעות מבחן t בלתי תלוי. ציר ה-y מייצג את היחס בין השטח האינטימי לשטח המדיאלי, מבוטא באחוזים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: ניתוח אימונוהיסטוכימי של סמני אנדותל כלי דם ושרירים חלקים לאחר ניתוח אנסטומוזה של עורק הירך. ניתוח אימונוהיסטוכימי חשף שינויים במורפולוגיה ובהתפלגות של תאי אנדותל כלי דם המסומנים CD31, כמו גם התפשטות לאחר הניתוח של תאי שריר חלק המסומנים ב-α-SMA, הן בקבוצה הרגילה והן בקבוצה הכירורגית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

אנסטומוזה וסקולרית היא טכניקה חיונית בניתוחי שחזור כלי דם, כאשר המודל החייתי שלה ממלא תפקיד מפתח בחקר המנגנונים של רסטנוזיס לאחר הניתוח. מודל זה מציע גישה מבוקרת לחקירת שינויים פתולוגיים בכלי הדם, במיוחד בהבנת מקורם של תאים מתרבים יתר על המידה בניאואינטימה במהלך רסטנוזיס. המקור של תאי שריר חלק מתרבים (SMCs) הופך לנושא מכריע כאשר פגיעה עורקית חמורה מתרחשת לאחר אנסטומוזה של כלי הדם, וכתוצאה מכך אפופטוזיס של SMCs בתקשורת. SMCs שמקורם במדיה של כלי הדם אינם היחידים המעורבים; תאי גזע באדוונטיטיה עשויים גם להתמיין ל-SMCs חדשים, מה שעשוי לתרום להיפרפלזיה ניאו-אינטימית¹⁵. הועלו שאלות לגבי מקורם של תאים אלה, האם הם מגיעים מתאי SMC או תאי גזע קיימים, או אם תאים אדוונטיציאליים אחרים, כגון תאי גזע, ממלאים תפקיד באמצעות התפשטות, הגירה והתמיינות. מודל האנסטומוזה העורקית הניסיוני הוא כלי רב ערך לחקר הנדידה של תאים אדוונטיאליים לתוך הניאואינטימה והפיכתם ל-SMCs לאחר פגיעה עורקית. על ידי שיבוש כירורגי של כלי הדם, גם השכבה האלסטית מופרעת, ומאפשרת לתאים אדוונטיציאליים לנדוד לכיוון השכבה הפנימית. מודל זה מציע תובנות חשובות לגבי המנגנונים התאיים המעורבים בתגובה לפגיעה עורקית. כל תמרון מדויק במהלך הליך אנסטומוזה של כלי הדם משפיע באופן קריטי על שלמות כלי הדם ועל ההצלחה הכוללת של המודל הכירורגי. בעת הארכת הגפה האחורית של העכבר, הימנע מיישור יתר, מכיוון שמתח מוגזם עלול לפגוע בגמישות העורק, לסבך את התפירה שלאחר מכן ועלול להוביל למיקרו-קרעים בדופן כלי הדם, מה שעלול לפגוע בזרימת הדם ובשיעור ההצלחה של האנסטומוזיס. במהלך דיסקציה ובידוד, חיוני להבחין בזהירות בין העורק, הווריד והעצב, במיוחד הימנעות מכל נזק לווריד. פגיעה ורידית עלולה לגרום לדימום מוגזם, חסימת שדה הניתוח והגברת מורכבות ההליך. לאחר בידוד עורק הירך, מהדקים את הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים בעזרת מלקחיים המוסטטיים עדינים, תוך הקפדה להימנע ממתיחת הכלי. אמצעי זהירות זה ממזער את הנזק לדופן כלי הדם, ועם שחרור המהדקים, מאפשר לזרימת הדם להתחדש בהדרגה, ומפחית את הלחץ על תאי האנדותל ואת הנזק הפוטנציאלי.

בחירת התפר המתאים היא קריטית לשמירה על שלמות כלי הדם ולהבטחת אנסטומוזיס חלקה. גודל וסוג התפר צריכים להתאים לדרישות הספציפיות של כלי השיט המטופל. בחירת אורך מתאים של תפר 6-0 לתמיכה בעורק היא צעד קריטי. אורך מוגזם של התפר עלול להתחכך בקליפסים ההמוסטטיים הקטנים ולגרום לפגיעה באנדותל. יתר על כן, במהלך תפירת כלי הדם, ודא שהמחט עוברת מדופן כלי הדם הפנימית לחיצונית בתנועה אחת כדי למזער את הטראומה האנדותלית. שלב זה הוא קריטי, מכיוון שנזק לאנדותל מגביר את הסיכון לפקקת לאחר הניתוח ומשפיע על ההערכות התפקודיות הבאות של כלי^{הדם 16}. כל נקודת ניקוב צריכה להיות מיושרת במדויק, עם חורים סימטריים הן בקצה הפרוקסימלי והן בקצה הדיסטלי. התאם את מספר התפרים בהתאם לקוטר הכלי; לדוגמה, כלי דם קטנים יותר עשויים לדרוש פחות תפרים (למשל, שלושה במקום ארבעה) כדי להפחית את צפיפות התפרים, למנוע חסימת זרימת דם ולהבטיח סבלנות מודל לניתוחים נוספים. בחירת תפר 12-0 חיונית להפחתת טראומה לדופן כלי הדם, שכן הפרופיל הדק שלו ממזער את ההשפעה הפיזית על מבנה כלי הדם ושומר על שלמות תאי האנדותל, שהיא קריטית לריפוי לאחר הניתוח ולסבלנות זרימת הדם. שימוש בתפר דק יותר מסייע בשמירה על שלמות מבנית בתוך כלי המודל, התומך בזרימת דם מתמשכת ומספק בסיס אמין לניתוח שלאחר מכן. לאורך כל תהליך התפירה, שמור על מתח עקבי בתפר כדי למנוע התרופפות או הידוק יתר, מה שעלול להגביל את זרימת הדם המקומית.

לאחר הסרת המלקחיים ההמוסטטיים, עלולה להתרחש דליפת דם קלה, וזה צפוי; עם זאת, שמירה על זרימת דם רציפה היא חיונית ליציבות ארוכת הטווח של המודל. תצפית לאחר הניתוח חיונית להבטחת הצלחת המודל. במהלך 4 השבועות שלאחר הניתוח, יש לעקוב מקרוב אחר בריאותו הכללית של העכבר, כולל בדיקת דימום, זיהום או פקקת באתר הניתוח, כדי להבטיח הישרדות והיעדר סיבוכים משמעותיים. התבוננות עקבית בזרימת הדם באתר הניתוח לא רק מאמתת את סבלנות האנסטומוזיס אלא גם מספקת תמיכה איכותית לניתוח נוסף, ומבססת בסיס חזק ליישום המודל במחקרים ארוכי טווח.

במחקר זה, אנו שואפים להעריך היצרות אנסטומוטית הנגרמת על ידי פגיעה בכלי הדם והיפרפלזיה אינטימית לאחר רה-וסקולריזציה. בעוד שמודל העכבר מספק תובנות חשובות לגבי התגובה הביולוגית הראשונית לפגיעה בכלי הדם, ישנן מגבלות מובנות ליישומו בחיקוי מצבי כלי דם אנושיים. ראשית, התקדמות ההיפרפלזיה האינטימית בעכברים, הנצפית בדרך כלל במשך מספר שבועות, עשויה שלא לשחזר באופן מלא את ההתפתחות הכרונית שנצפתה בבני אדם לאורך חודשים או שנים, מה שמגביל את הערכת השינויים בכלי הדם לטווח ארוך¹⁷. יתר על כן, ההבדלים הפיזיולוגיים בין מערכות כלי הדם של עכברים ובני אדם, כולל שינויים בגודל כלי הדם, שיעורי הריפוי והתגובות התאיות, מציבים אתגרים ליישום תרגום ישיר של ממצאים. שליטה מדויקת בחומרת הפציעה בעורק הירך של העכבר היא גם מאתגרת, שכן סטיות קלות בטכניקה הניתוחית יכולות להשפיע באופן משמעותי על תגובת כלי הדם, ולהכניס שונות לתוצאות. לבסוף, הדרישות המיקרו-כירורגיות של עבודה על כלי דם קטנים מגבירות את המורכבות הטכנית ואת הסיכון לפציעות לא עקביות, מה שעלול להשפיע על יכולת השחזור של התוצאות. גורמים אלה מדגישים באופן קולקטיבי את הצורך בפרשנות זהירה של ממצאי מודל זה כאשר בוחנים את הרלוונטיות שלהם לפתופיזיולוגיה של כלי הדם האנושיים.

למחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף.

ברצוננו להביע את תודתנו הכנה לפרופ' צ'ינגבו שו ויאנהואה הו מאוניברסיטת ג'ה-ג'יאנג על הסיוע הטכני היקר שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי הקרנות הלאומיות למדעי הטבע של סין (מספרי מענקים 82070502 ו-32171099), תוכנית המדע והטכנולוגיה של סצ'ואן (מספרי מענק 2025HJRC0035, 2024NSFSC0709), והפרויקט המשותף של האוניברסיטה הרפואית לוז'ו-דרום-מערב (2024LZXNYDJ021, 2024LZXNYDJ014)