Method Article
在这里,我们提出了一种用于股动脉吻合术的小鼠模型,为研究人员提供了一个有价值的动物模型来研究和模拟血管吻合口狭窄。这一发展对于促进我们对这种疾病背后的病理生理学的理解以及促进对血管疾病的更准确和有效的研究至关重要。
在血管外科手术中,血管吻合术是一种用于恢复血流的常见重建技术。然而,吻合口再狭窄是一种常见的术后并发症,主要由手术诱导的血管损伤、内膜增生和炎症反应引起。小鼠股动脉吻合模型广泛用于研究吻合口再狭窄和血管修复的机制。显微镜引导的端到端股动脉吻合术可以精确模拟手术后的血管损伤和修复过程,为研究与再狭窄相关的病理机制提供了可靠的实验工具。本研究的重点是改进小鼠股动脉吻合术的手术技术。通过手术技术的改进和技术细节的优化,我们实现了模型成功率和可重复性的显着提高。具体的改进包括手术过程中改进的血管处理技术、缝合材料的选择以及缝合方法的优化,以最大限度地减少吻合口瘘和术后闭塞。该研究还强调观察内膜增生、吻合口部位的血管重塑和长期血管通畅。通过这项研究,我们为小鼠股动脉吻合术提供了简洁高效的作指南,为血管外科的实验研究提供了可靠的技术支持。这项工作为后续研究治疗干预的相关机制和评估奠定了坚实的基础。
血管吻合术是血运重建手术中的一项基本技术,在恢复血流和促进组织修复方面起着关键作用。然而,吻合口部位内膜增生 (IH) 的发生通常会导致再狭窄,这会严重损害长期血管通畅,并对临床结果和患者预后产生负面影响 1,2。IH 与术中血管损伤密切相关,其特征是平滑肌细胞 (SMC) 异常增殖和迁移以及细胞外基质过度沉积1。这些复杂且相互关联的病理过程强调了阐明 IH 的确切机制的迫切需要,以便为预防和干预再狭窄的策略提供信息。
由于其可重复性和精确控制性,股动脉吻合的小鼠模型已被广泛用于血管修复和相关病理机制的研究 3,4,5。小鼠的端到端吻合可以准确模拟术后吻合口损伤,从而能够动态观察 IH 和血管重塑。这些模型为研究术后内皮细胞和 SMC 之间的相互作用以及评估炎症反应在 IH 发展中的作用提供了一个理想的平台6。通过结合组织学分析和分子生物标志物检测,研究人员可以全面识别 IH 的关键驱动因素,从而为其潜在机制和潜在治疗靶点提供重要见解。
IH 的发展受多种因素驱动,其中血流动力学变化是关键因素 1,7,8。在吻合口部位,低剪切应力和异常振荡剪切指数 (OSI) 区域是 SMC 增殖和迁移的主要刺激因素 1,7。此外,顺应性错配和吻合口周围的湍流会加剧内皮损伤,加速 IH 进展8。这些发现强调了优化手术技术和选择合适的材料以减轻吻合口部位病理变化的必要性。
近年来,药物涂层球囊 (DCB) 已被证明可有效降低 IH。抗增殖剂,如紫杉醇,有效抑制 SMCs 增殖和迁移,显著降低再狭窄的发生率9。然而,在动静脉移植物等高流量系统中仍然存在挑战,其中剪切应力的快速波动和高血流速率可能会降低 DCB的疗效 1。未来的研究应侧重于提高 DCB 在不同血流动力学环境中的适用性,同时利用生物材料科学的进步为术后再狭窄开发更加个性化和有效的解决方案。除了局部干预外,糖尿病、动脉粥样硬化和内皮功能障碍等全身性因素也会显着影响 IH 的发展10。因此,临床策略应优先考虑对这些全身性疾病的全面管理,以增强整体血管健康。同时,识别和监测 IH 进展的新型生物标志物可以为早期干预提供机会。将人工智能整合到手术计划中提供了另一条有前途的途径,允许对优化的吻合口配置进行计算设计,从而提高手术成功率并延长血管通畅性。
在术后 IH 和相关病理机制的研究中,股动脉吻合模型以其精度和可重复性而著称11。该模型采用显微外科技术对小鼠股动脉进行端到端吻合,准确模拟吻合口部位的局部手术创伤。与线诱导损伤或其他替代方案等模型相比,该模型的优势尤为明显。股动脉吻合模型的一个主要技术优势是它能够诱导高度局部和受控的血管损伤12。手术创伤允许对吻合口区域产生集中影响,与临床血管手术中遇到的损伤模式非常相似。相比之下,钢导的损伤模型虽然技术简单,但通常会导致广泛的内皮剥脱,因此难以复制在现实生活中的吻合口手术中观察到的局部创伤13。此外,不同试验中线诱导损伤深度和程度的可变性可能会降低结果的可重复性。钢丝损伤模型中损伤的广泛性和弥漫性使其与研究与吻合口区域特别相关的局部 IH 相关性较低。
在这项研究中,利用股动脉吻合的小鼠模型,我们系统地改进了手术技术,以提高模型成功率并确保吻合口部位的长期通畅。利用这一已建立的基础,我们的研究深入研究了 IH 的分子和细胞机制,包括控制 SMCs 迁移和增殖的调节途径,以及炎症介质在 IH 进展中的作用。通过这项研究,我们旨在为吻合口后再狭窄的机制提供新的理论见解,并为开发专门针对 IH 的治疗策略奠定实验基础。
这项研究获得批准,动物按照《中国实验动物管理和使用指南》进行处理。该研究严格遵守动物实验的道德要求,并获得了动物伦理委员会的批准(批准号:SWMU20221109-019)。在这里,本研究使用了 8 周龄的任一性别的健康 C57BL/6 小鼠,体重在 20-22 克之间。这些动物被安置在西南医科大学 (SWMU) 的实验动物中心。
1. 术前程序
2. 股动脉血管吻合术
3. 术后缝合
4. 术后观察和取样
5. 股动脉脱水和嵌入
6. 股动脉石蜡切片的制备
7. 苏木精-曙红染色
在血管吻合手术中,血管壁的机械损伤可以激活内膜细胞并触发增殖。吻合后血流速度和方向的变化也会刺激内膜细胞的增殖。血管重塑过程和血流的长期不稳定也会持续刺激内膜细胞,最终导致增厚。
为了确认股动脉吻合模型的成功,对收集的股动脉切片进行了苏木精和伊红染色。观察到显着内膜增生的存在,表明血管重塑成功并证实吻合手术成功(图 1A)。
为了评估内膜增生,标记并确定了关键血管结构的边界,包括管腔、内弹性层 (IEL) 和外弹性层 (EEL)14。基于这些边界,使用图像分析软件进行面积测量。通过测量 IEL 包围的总面积并减去管腔面积来计算内膜面积,得到实际的内膜区面积。通过测量 EEL 包围的总面积并减去 IEL 的面积来确定内侧面积,得到实际的内侧区域面积。为了评估内膜增生的程度,计算了内膜面积与内侧面积的比率(内膜/内侧比),提供了内膜增厚程度的清晰和定量表示(图 1B)。
正常对照组和实验组在股动脉吻合手术后,均采用免疫组化染色法对血管内皮标志物 CD31 和平滑肌标志物 α-SMA 进行特异性检测(图2)。
图 1:股动脉吻合组织切片的苏木精和伊红染色。 (A) 手术 4 周后,从小鼠左后肢采集股动脉样本。将动脉组织包埋在石蜡中并切片至 4 μm 的厚度。对切片进行苏木精和伊红染色,显示股动脉内膜显著增生。(B) 统计直方图显示,吻合口血管中新内膜与中层的比率显著增加。数据表示为平均值±平均值的标准误差 (SEM)。使用独立 t 检验评估统计学意义。y 轴表示内膜面积与内侧面积的比率,以百分比表示。 请单击此处查看此图的较大版本。
图 2:股动脉吻合手术后血管内皮和平滑肌标志物的免疫组织化学分析。 免疫组织化学分析显示正常组和手术组CD31标记的血管内皮细胞的形态和分布发生变化,以及α-SMA标记的平滑肌细胞术后增殖。 请单击此处查看此图的较大版本。
血管吻合术是血管重建手术中的一项关键技术,其动物模型在研究术后再狭窄的机制中起着关键作用。该模型提供了一种受控方法来研究血管病理变化,特别是在了解再狭窄期间新内膜中过度增殖细胞的起源。当血管吻合后发生严重动脉损伤时,增殖平滑肌细胞 (SMC) 的来源成为一个关键问题,导致 SMC 在介质中凋亡。源自血管介质的 SMC 并不是唯一涉及的;外膜中的干细胞也可能分化成新的 SMC,可能导致新内膜增生15。人们一直对这些细胞的起源提出疑问,它们是否来自现有的 SMC 或干细胞,或者其他外源细胞(如干细胞)是否通过增殖、迁移和分化发挥作用。实验性动脉吻合模型是研究外膜细胞迁移到新内膜以及动脉损伤后它们转化为 SMC 的宝贵工具。通过手术破坏血管,弹性层也被破坏,使外膜细胞向内层迁移。该模型为动脉损伤反应所涉及的细胞机制提供了重要的见解。血管吻合术过程中的每一次精确作都会严重影响血管完整性和手术模型的整体成功。伸展小鼠后肢时,避免过度伸直,因为过度紧张可能会损害动脉的弹性,使后续缝合复杂化,并可能导致血管壁出现微撕裂,从而可能影响血流和吻合成功率。在解剖和隔离过程中,必须仔细区分动脉、静脉和神经,特别是避免对静脉造成任何损伤。静脉损伤可能导致出血过多,阻塞手术区域并增加手术的复杂性。隔离股动脉后,用细止血钳夹住近端和远端,注意避免拉伸血管。这种预防措施可最大限度地减少血管壁损伤,并在松开夹子后,允许血流逐渐恢复,从而减少内皮细胞应激和潜在损伤。
选择合适的缝合线对于保持血管完整性和确保顺利吻合至关重要。缝合线的尺寸和类型应与所处理的血管的具体要求保持一致。选择合适的 6-0 缝合线来支撑动脉是一个关键步骤。缝合线过长可能会摩擦小止血夹并导致内皮损伤。此外,在血管缝合过程中,确保针头以单一动作从内血管壁穿过外侧,以尽量减少内皮损伤。这一步至关重要,因为内皮损伤会增加术后血栓形成的风险并影响血管的后续功能评估16。每个穿刺点应精确对齐,近端和远端都有对称的孔。根据容器直径调整针数;例如,较小的血管可能需要更少的缝合(例如,3 针而不是 4 针)以降低缝合密度,防止血流阻塞,并确保模型通畅以进行进一步分析。选择 12-0 缝合线对于减少血管壁的创伤至关重要,因为它的薄型最大限度地减少了对血管结构的物理影响并保持了内皮细胞的完整性,这对于术后愈合和血流通畅至关重要。使用较薄的缝合线有助于维持模型血管内的结构完整性,从而支持持续的血流并为后续分析提供可靠的基础。在整个缝合过程中,保持缝合线的张力一致,以避免松动或过度收紧,这可能会限制局部血液流动。
取下止血钳后,可能会出现轻微的血液泄漏,这是意料之中的;然而,保持连续的血流对于模型的长期稳定性至关重要。术后观察对于确保模型成功至关重要。在手术后的 4 周内,应密切监测小鼠的整体健康状况,包括检查手术部位是否有出血、感染或血栓形成,以确保存活和无重大并发症。持续观察手术部位的血流不仅可以验证吻合口通畅性,还可以为进一步分析提供高质量的支持,为该模型在长期研究中的应用奠定了坚实的基础。
在这项研究中,我们旨在评估血运重建后血管损伤和内膜增生引起的吻合口狭窄。虽然小鼠模型为对血管损伤的初始生物反应提供了有价值的见解,但其在模拟人类血管状况方面的适用性存在固有的局限性。首先,通常在几周内观察到的小鼠内膜增生的进展可能无法完全复制在人类中观察到的数月或数年的慢性发展,这限制了对长期血管变化的评估17。此外,小鼠和人类血管系统之间的生理差异,包括血管大小、愈合速率和细胞反应的变化,为研究结果的直接转化应用带来了挑战。精确控制小鼠股动脉损伤的严重程度也具有挑战性,因为手术技术的微小偏差会显着影响血管的反应,从而给结果带来可变性。最后,在小血管上工作的显微外科需求增加了技术复杂性和不一致损伤的风险,这可能会影响结果的可重复性。这些因素共同强调了在考虑该模型与人类血管病理生理学的相关性时需要仔细解释该模型的研究结果。
作者没有需要披露的利益冲突。
我们衷心感谢浙江大学的徐庆波教授和胡艳华教授提供的宝贵技术帮助。这项工作得到了中国国家自然科学基金(批准号 82070502 和 32171099)、四川省科技计划(批准号 2025HJRC0035、2024NSFSC0709)和泸州-西南医科大学联合项目(2024LZXNYDJ021、2024LZXNYDJ014)的支持
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6-0 Nylon Suture with Needle | Ningbo Chenghe | 240102 | |
12-0 Nylon Suture with Needle | Ningbo Lingqiao | 22064 | |
Electro-heating standing-temperature incubator | Shanghai Boxun | HPX-9272MBE | |
Eosin Staining Solution | Servicebio | G1005-2 | |
Formaldehyde Solution | KESHI | 50-00-0 | |
Hematoxylin Staining Solution | Servicebio | G1005-1 | |
Heparin Sodium | Solarbio | H8060 | |
MAGSCANNER KF-PRO-002 | KFBIO | KFPBL00200107003 | |
Mounting medium | Wuxi Jiangyuan | 220810 | |
OLYMPUS SZ2-ILST | OLYMPUS CORPORATION | SN 9B40828 | |
Paraffin embedding machine | YAGUANG | YB-7LF | |
Phosphate-Buffered Saline | Solarbio | P1010 |
请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形
请求许可This article has been published
Video Coming Soon
版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有,本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。