הדמיית רקמות מרובבת מאוד עם צבעי ראמאן

הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) של פיזור קדם-תהודה אלקטרונית של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן היא פלטפורמה חדשה להדמיית חלבונים מבוססת אפיטופים מרובבים מאוד. כאן אנו מציגים מדריך מעשי הכולל הכנת נוגדנים, צביעת דגימת רקמות, הרכבת מיקרוסקופ SRS והדמיית רקמות epr-SRS.

הדמיה של היקף עצום של סמנים ביולוגיים ספציפיים ברקמות ממלאת תפקיד חיוני בחקר הארגונים המורכבים של מערכות ביולוגיות מורכבות. לפיכך, טכנולוגיות הדמיה מרובות מאוד זכו להערכה הולכת וגוברת. כאן, אנו מתארים פלטפורמה מתפתחת של הדמיה ויברציונית מרובבת מאוד של חלבונים ספציפיים עם רגישות דומה לאימונופלואורסצנציה סטנדרטית באמצעות הדמיית פיזור ראמאן (epr-SRS) אלקטרונית המעוררת בתהודה מוקדמת של צבעי ראמאן דמויי קשת בענן. שיטה זו עוקפת את הגבול של תעלות הניתנות לפתרון ספקטרלי באימונופלואורסצנציה קונבנציונלית ומספקת גישה אופטית של ירייה אחת כדי לחקור סמנים מרובים ברקמות עם רזולוציה תת-תאית. הוא תואם בדרך כלל לתכשירי רקמות סטנדרטיים, כולל רקמות קבועות פרפורמלדהיד, רקמות קפואות ורקמות אנושיות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE). אנו צופים שפלטפורמה זו תספק תמונה מקיפה יותר של אינטראקציות חלבונים של דגימות ביולוגיות, במיוחד עבור רקמות שלמות ועבות. פרוטוקול זה מספק את זרימת העבודה מהכנת נוגדנים להכתמת דגימת רקמות, להרכבת מיקרוסקופ SRS, להדמיית רקמות epr-SRS.

מערכות רקמות מורכבות מורכבות מתת-אוכלוסיות תאיות נפרדות שמיקומיהן המרחביים ורשתות האינטראקציה שלהן שזורים עמוק בתפקודים ובתפקוד לקוי שלהן ^1,2. כדי לחשוף את ארכיטקטורת הרקמה ולחקור את המורכבות שלה, ידע על המיקומים המרחביים של חלבונים ברזולוציה של תא יחיד הוא חיוני. לפיכך, טכנולוגיות הדמיית חלבונים מרובות מאוד זכו להערכה הולכת וגוברת ויכולות להפוך לאבן פינה לחקר הביולוגיה של הרקמות ^3,4,5. ניתן לסווג את שיטות ההדמיה הנפוצות הנוכחיות של חלבונים מרובבים לשתי קטגוריות עיקריות. האחת היא הדמיה אימונופלואורסצנטית סדרתית המסתמכת על סבבים מרובים של צביעת רקמות והדמיה, והשנייה היא הדמיית ציטומטריה המונית בשילוב עם נוגדנים מתויגים במתכת כבדה 6,7,8,9,10,11,12.

כאן מוצגת אסטרטגיה חלופית להדמיית חלבונים מבוססי נוגדנים מרובבים. בניגוד לשיטת ההדמיה הפלואורסצנטית הנפוצה, שיכולה לדמיין רק 4-5 ערוצים בו זמנית בשל ספקטרום העירור והפליטה הרחב (רוחב מלא בחצי מקסימום (FWHM) ~ 500 ס"^מ-1), מיקרוסקופיית ראמאן מציגה קו ספקטרלי צר בהרבה (FWHM ~ 10 ^cm-1) ולכן מספקת ריבוי מדרגי. לאחרונה, על ידי רתימת הספקטרום הצר, פותחה תוכנית חדשנית של מיקרוסקופיית ראמאן בשם מיקרוסקופיית קדם-תהודה אלקטרונית מגורה פיזור ראמאן (epr-SRS), המספקת אסטרטגיה רבת עוצמה להדמיה מרובבת¹³. על-ידי חקירת מצבי הרטט המצומדים אלקטרונית של צבעי ראמאן, epr-SRS משיג אפקט שיפור דרסטי של פי 10¹³ על חתכי ראמאן ומתגבר על צוואר הבקבוק הרגיש של מיקרוסקופיית ראמאן קונבנציונלית (איור 1A)13,14,15. כתוצאה מכך, גבול הגילוי של epr-SRS נדחף לתת-μM, מה שמאפשר זיהוי ראמאן של סמנים מולקולריים מעניינים כגון חלבונים ואברונים ספציפיים בתוך תאים^13,16. בפרט, תוך שימוש בנוגדנים מצומדים לצבעי ראמאן, הדמיית epr-SRS של חלבונים ספציפיים בתאים וברקמות (הנקראת immuno-eprSRS) הודגמה ברגישות דומה לאימונופלואורסצנציה סטנדרטית (איור 1B)^13,17. על-ידי כוונון אורך הגל של המשאבה ב-2 ננומטר בלבד, אות ה-epr-SRS יהיה כבוי לחלוטין (איור 1B), המציג ניגודיות רטט גבוהה.

בצד הגשושית, פותחה קבוצה של גשושיות ראמאן דמויות קשת בשם צבעי פיזור מנהטן ראמאן (MARS) להצמדת נוגדנים 13,18,19,20. פלטת ראמאן ייחודית זו מורכבת מצבעים חדשניים הנושאים קשרים משולשים מצומדים π (חומר משלים), שכל אחד מהם מציג שיא epr-SRS יחיד וצר בטווח הספקטרלי הביו-אורתוגונלי של ראמאן (איור 1C). על ידי שינוי המבנה של כרומופור הליבה ועריכה איזוטופית של שני האטומים של הקשר המשולש (חומר משלים), פותחו גשושיות ראמאן מופרדות ספקטרלית. תוך מינוף המולטיפלקסיות הניתנות להרחבה, מיקרוסקופיית epr-SRS בשילוב עם פלטת הצבעים MARS מציעים אסטרטגיה אופטית להדמיית חלבונים מולטיפלקס בצילום אחד בתאים וברקמות.

Immuno-eprSRS מספק אסטרטגיה חלופית לשיטות הדמיית חלבוני המולטיפלקס הנוכחיות עם חוזקות ייחודיות. בהשוואה לגישות פלואורסצנטיות עם צביעה מחזורית, הדמיה והסרת אותות, פלטפורמה מבוססת ראמאן זו מבטיחה צביעה והדמיה של סיבוב יחיד. לכן, הוא עוקף את המורכבות המעשית בהליכים מחזוריים ובמידה רבה מפשט את הפרוטוקול, ומכאן פותח טריטוריות חדשות של הדמיית חלבונים מרובבים. לדוגמה, רתימת פרוטוקול ניקוי רקמות המותאם לצבע ראמן, immuno-eprSRS הורחב לשלושה ממדים למיפוי חלבונים מרובב מאוד ברקמות עבות שלמות¹⁷. יותר מ-10 מטרות חלבונים צולמו לאורך רקמות מוח של עכברים בעובי מילימטר¹⁷. לאחרונה,^הודגם גם צימוד אימונו-eprSRS עם פרוטוקול מיקרוסקופיית הרחבה אופטימלית לשימור ביו-מולקולות (ExM)²¹, הדמיה בקנה מידה ננומטרי של ירייה אחת של מטרות מרובות. בהשוואה לספקטרוסקופיית מסות הדמיה ^4,9, epr-SRS הוא לא-דיסטרוקטיבי ובעל יכולת חתך אופטית פנימית. יתר על כן, epr-SRS יעיל יותר בזמן בסריקת רקמות. בדרך כלל, אזור רקמה של 0.25 מ"מ² עם גודל פיקסל של 0.5 מיקרומטר לוקח רק כמה דקות כדי לצלם עבור ערוץ epr-SRS יחיד. לדוגמה, זמן ההדמיה הכולל של ארבעה ערוצי SRS ועוד ארבעה ערוצים פלואורסצנטיים באיור 4 הוא בערך 10 דקות.

הפרוטוקול נערך בהתאם לפרוטוקול הניסוי בבעלי חיים (AC-AABD1552) שאושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת קולומביה.

1. הכנת נוגדנים מצומדים בצבע רמאן

1. הכן את מאגר ההצמדה כ~ 0.1 M NaHCO₃ במאגר PBS, pH = 8.3, אחסן ב- 4 °C (74 °F).
2. הכן תמיסת גשושית MARS (חומר משלים) N-hydroxysuccinimidy (NHS) המתפקדת על-ידי אסטר-מתפקדת כ-3 mM ב-DMSO נטול מים. ניתן להפנות סינתזה של בדיקות MARS לדיווחים קודמים 13,17,18.
   הערה: למטרות אחסון, יש להגן על פתרון האסטר של NHS בצבע NHS מפני אור ולשמור עליו בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
3. ממיסים את מוצקי הנוגדנים במאגר ההצמדה לריכוז של 2 מ"ג/מ"ל. עבור נוגדנים המומסים במאגרים אחרים, החליפו אותם למאגר ההצמדה לריכוז של 1-2 מ"ג/מ"ל עם מסננים צנטריפוגליים.
   הערה: נוגדנים משניים בעלי ספיחה צולבת מאוד עדיפים על צביעת מולטיפלקס כדי למזער את תגובתיותם של מינים שונים. הנוגדנים המשניים שבהם נעשה שימוש מפורטים בטבלה 1 ובטבלת החומרים.
4. בצע את תגובת ההצמדה.
   1. עבור נוגדנים משניים, הוסיפו עודף טוחן פי 15 של תמיסת צבע לתמיסת הנוגדן בבקבוקון זכוכית באיטיות עם ערבוב. לדוגמה, בתמיסת נוגדנים של 0.5 מ"ל 2 מ"ג/מ"ל, יש להוסיף תמיסת צבע של 35 μL 3 mM.
   2. דגירה של תערובת התגובה בטמפרטורת החדר (RT) עם ערבוב במשך שעה אחת. הגן על התגובה מפני אור.
5. טיהור.
   1. הכן את שרף סינון הג'ל (טבלת החומרים) במאגר PBS, לאחר שלבים 1.5.2-1.5.4.
   2. הוסיפו 10 מ"ל של אבקת שרף סינון ג'ל לתוך 40 מ"ל של מאגר PBS בתוך צינור של 50 מ"ל.
   3. שמור את הפתרון באמבט מים של 90 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.
   4. דקאנט את הסופרנטנט והוסף מחדש PBS ל-40 מ"ל. אחסן את הסלורי בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
   5. ארזו את עמודת אי-הכללת הגודל (קוטר 1 ס"מ, עמודי זרימת כבידה) עם תמיסת ההחלקה לגובה של 10-15 ס"מ.
   6. שטפו ושטפו את העמודה בכ-10 מ"ל של מאגר PBS כדי לארוז עוד יותר את השרף.
   7. הצמידו את תערובת תגובת ההצמדה (כ-0.5 מ"ל) לטור. הוסף מיד 1 מ"ל של מאגר PBS כמאגר elution כאשר כל תערובת התגובה נטענת. כל הזמן מלאו מחדש את מאגר האלוטיון (PBS) לעמודה.
   8. אספו את ההתרוממות של תמיסת ההצמדה על ידי התבוננות בצבע העמוד (לצבעי MARS יש צבעים ירוקים בהירים עד כחולים) או למדוד את הספיגה ב-280 ננומטר (A280).
6. ריכז את התמיסה שנאספה ל-1-2 מ"ג/מ"ל באמצעות מסנן צנטריפוגלי.
7. קבע את הריכוז ואת מידת הסימון הממוצעת (DOL, יחס צבע לחלבון) על-ידי מדידת הספקטרום האולטרה-סגול-גלוי (UV-Vis) של התמיסה המצומדת באמצעות קורא לוחות ננו.
   הערה: חומר משלים מספק תכונות של NHS-esters בצבע MARS לצורך חישוב. ה- DOL הרגיל עבור הנוגדן המשני הוא בסביבות 3.

2. הכנת דגימת רקמות

1. Paraformaldehyde קבוע רקמות המוח של העכבר.
   1. להרדים את העכברים (C57BL/6J, נקבה, 25 d לאחר הלידה) עם איזופלורן. הערך את ההרדמה הנכונה באמצעות בדיקת צביטה בבוהן.
   2. להרוג את העכברים על ידי תזוזה צוואר הרחם. יש להחדיר לעכברים מיד 4% פרפורמלדהיד (PFA) ב-PBS באופן טרנסקרדיאלי.
   3. אסוף את מוח העכבר, בהתאם לשלבים 2.1.4-2.1.5
   4. חותכים כלפי מעלה מגזע המוח לאורך התפר הסגיטלי. מקלפים את שני חצאי הגולגולת הצידה ומוציאים את המוח עם פינצטה.
   5. תקן את המוח שנאסף ב-4% PFA ב-PBS ב-4 °C למשך 24 שעות. לאחר מכן, שטפו את המוח במאגר PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כדי להסיר עודפי PFA.
   6. מכניסים אגרוז מוצק למים לריכוז סופי של 7% (w/v) בכוס, עם מכסה רופף. מערבבים את התמיסה עם מוט ערבוב מזכוכית. מחממים את ההברקה במיקרוגל עד שהתמיסה ברורה.
   7. אפשרו לאגרוז להתקרר ל-45-55 מעלות צלזיוס.
   8. יוצקים את האגרוז הנוזלי לתוך תא קטן, ואז מעבירים את המוח מ-PBS לאגרוז נוזלי ומכוונים אותו עם מרית כדי להטמיע את המוח. המתן עד שגוש הרקמות-אגרוז יתקשה.
   9. חתכו את הרקמה-אגרוז לפרוסות קורונליות בעובי 40 מיקרומטר באמצעות ויברטום.
   10. מעבירים את הרקמה לצלחת של 4 בארות לצורך ההכתמה הבאה. הסר את האגרוס עם פינצטה. לשטוף את הרקמה עם 1 מ"ל של PBS, שלוש פעמים.
2. קבוע רקמות לבלב עכבר קפוא.
   1. תקן את הלבלב של העכבר ב-4% PFA ב-PBS ב-4 מעלות צלזיוס עם נדנדה במשך 16-20 שעות.
   2. שטפו את הדגימה ב-1 מ"ל של PBS (4 °C) שלוש פעמים כדי להסיר PFA.
   3. הטבע את הדגימה (בגודל של כ-0.3-0.5 ס"מ) בבלוקים מורכבים אופטימליים של טמפרטורת חיתוך (OCT). שים 2 טיפות של OCT לתוך cryomold פלסטיק. מניחים את הרקמה בכיוון הנכון ושופכים OCT על גבי הרקמות עד שאף אחת מהרקמה לא נשארת חשופה.
   4. חתכו את הלבלב לפרוסות בעובי 8 מיקרומטר ושיתקו אותן לשקופית זכוכית קושרת רקמות, אחסנו אותן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
   5. לפני ההכתמה, שיזבו את הדגימה ל-RT. שטפו את הרקמה עם PBS כדי להסיר בלוקי OCT.
3. דגימות FFPE.
   1. יש לאפות את שקופית רקמת ה-FFPE בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   2. דפראפיניזציה והתייבשות: מקם דגימות ברצף בתמיסות הבאות בצינור 50 מ"ל ב- RT למשך 3 דקות בכל פעם עם רעידות קלות:
      קסילן פעמיים,
      אתנול פעמיים,
      95% (נפח/נפח) אתנול במים שעברו דה-יוניזציה פעמיים,
      70% (נפח/נפח) אתנול במים שעברו דה-יוניזציה פעמיים,
      50% (נפח/נפח) אתנול במים שעברו דה-יוניזציה פעם אחת,
      מים שעברו דה-יוניזציה פעם אחת.
   3. העבירו את הדגימה ל-20 mM נתרן ציטראט (pH 8.0) ב-100 מעלות צלזיוס בצנצנת זכוכית. ודא שהרקמות שקועות בתמיסה.
   4. שים את הצנצנת באמבט מים של 60 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
   5. שטפו את הדגימה עם מים שעברו דה-יוניזציה ב-RT למשך 5 דקות.

3. צביעת רקמות אימונו-eprSRS

1. השתמש בעט הידרופובי כדי לשרטט גבול סביב חלקי הרקמה במגלשה.
   הערה: צנצנת צביעת שקופיות משמשת לביצוע שלבי הדגירה של הרקמה בשקופית. רקמות צפות (מקטעי מוח עכברים בעובי 40 מיקרומטר) מוכתמות בלוחות באר.
2. דגירה של הרקמות עם 0.3-0.5% PBST (טריטון X-100 ב- PBS) למשך 10 דקות.
3. דגירה של הרקמות עם חיץ חוסם (5% סרום חמור, 0.5% טריטון X-100 ב-PBS) למשך 30 דקות.
4. הכינו את תמיסת ההכתמה העיקרית: הוסיפו את כל הנוגדנים הראשוניים ל-200-500 μL של מאגר צביעה (2% סרום חמורים, 0.5% Triton X-100 ב-PBS) בריכוזים הרצויים. צנטריפוגה היא תמיסת הכתם העיקרית ב-13,000 x גרם למשך 5 דקות. השתמש בסופרנאטנט רק אם נוצרים משקעים.
5. דגירה של הרקמה בתמיסת הנוגדן העיקרית בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 1-2 ימים.
   הערה: להכתמת מקטעי רקמות על המגלשה, שים את הדגימה בקופסת צביעה עם מגבון לח כדי לשמור על לחות.
6. שטפו את המגלשות שלוש פעמים עם 0.3-0.5% PBST ב-RT למשך 5 דקות כל אחת. השתמש ב- 1 mL PBST עבור רקמות צפות. עבור רקמות על המגלשה, לשטוף את השקופיות בצנצנת צביעה החלקה ולוודא שהרקמות כולן שקועות בתמיסה.
7. דגירה של הרקמה ב 200-500 μL של חיץ חוסם במשך 30 דקות.
8. הכינו את תמיסת הכתם המשנית: הוסיפו את כל הנוגדנים המשניים (והלקטינים במידת הצורך) ל-200-500 μL של מאגר צביעה עם ריכוזים רצויים (בדרך כלל 10 מיקרוגרם/מ"ל). צנטריפוגה תמיסת הכתם המשנית ב 13,000 x g למשך 5 דקות. השתמש בסופרנאטנט רק אם נוצרים משקעים.
9. דגירה של הרקמות ב 200-500 μL של תמיסת נוגדנים משנית ב 4 °C (4 °F) למשך 1-2 ימים.
10. שטפו את המגלשות פעמיים עם 0.3-0.5% PBST ב-RT למשך 5 דקות כל אחת.
11. אינקובציה עם 200-500 μL של פתרון DAPI למשך 30 דקות.
12. שטפו את השקופיות שלוש פעמים עם PBS ב-RT למשך 5 דקות כל אחת.
13. עבור קטעי רקמות צפות, העבר אותם למגלשות זכוכית עם פיפטה מפילת זכוכית. מורחים את הרקמה עם מברשת טישו ומנקים את הסביבה במגבונים במידת הצורך.
14. הרכיבו את הרקמה בטיפה של ריאגנטים נגדיים עם כיסוי זכוכית והצמידו אותה לציפורניים.

4. הרכבה של מיקרוסקופ SRS

הערה: מערכת פלואורסצנציה קונפוקלית מסחרית משמשת בהדמיית SRS-פלואורסצנציה טנדם. תיאורים נוספים ניתן למצוא בדו"ח קודם¹⁷. פרוטוקול זה יתמקד בצד ההדמיה של SRS באמצעות עירור בפס צר.

1. הכינו שולחן אופטי מבודד רטט בחדר עם בקרת טמפרטורה.
2. הניחו מערכת לייזר כפול מסונכרנת (משאבה וסטוקס) על השולחן האופטי (איור 2A) עם צ'ילר מחובר.
   הערה: הלייזר הבסיסי במערכת הלייזר הכפול מספק רכבת פולס יציאה ב-1064 ננומטר עם רוחב פולס של 6 ps וקצב חזרה של 80 מגה-הרץ. קרן סטוקס היא מהלייזר הבסיסי. עוצמתה של קרן סטוקס הופנתה באופן סינוסואידי על ידי אפנן משרעת אלקטרו-אופטית מובנה (EOM) ב-8 מגה-הרץ עם עומק אפנון של יותר מ-90%. החלק השני של הלייזר היסודי מוכפל תדרים ל-532 ננומטר, המשמש גם לזריעה סינכרונית של מתנד פרמטרי אופטי פיקוס-שניות (OPO) כדי לייצר רכבת פולסים נעולה במצב עם רוחב פולסים של 5-6 ps (קרן האידלר של ה-OPO חסומה באמצעות מסנן אינטרפרומטרי). אורך הגל של הפלט של ה- OPO ניתן לכוונון בין 720-950 ננומטר, המשמש כקרן המשאבה.
3. הרכיבו את המראות (טווח אורכי גל: 750-1100 ננומטר), מפצלי אלומות דיכרואיים (DBS, מסנן מעבר ארוך של 980 ננומטר, מלבני), ועדשה (achromatic, ציפוי AR עבור 650-1050 ננומטר) לתושבות המתאימות שלהם. השתמש בתושבות מראה יציבות מאוד עבור המראות ומפצלי הקרן הדיכרואיים.
4. מדוד את גובה פלט הלייזר ואת גדלי הקרן של המשאבה ואת קרני סטוקס. התאם את גובה המראות והעדשות כדי להבטיח שהאור יפגע במרכז כל האלמנטים האופטיים.
5. הניחו את מראה M1 על הטבלה האופטית והכינו אותה כ-45° ליציאת הלייזר (איור 2B). השתמש בידיות שעל התושבת הקינמטית כדי לבצע התאמות קצה והטיה. ודא שהאור נע באותו גובה לאורך השולחן וקו ישר ביחס לשולחן.
6. מקם ויישר את מפצלי הקרן הדיכרואיים (מסנני מעבר ארוך של 980 ננומטר) ואת המראות כדי לפצל את המשאבה ואת אלומות סטוקס (איור 2A-B).
7. מקם ויישור זוגות עדשות (L1, L2 ו-L3, L4) בכל אחד מנתיבי הקרן כדי לרכז את הקורות ולהרחיב את קוטרי הקרן כך שיתאימו לאישון האחורי של המטרה (איור 2A-B).
8. השתמשו במראות M7 ו-M8 כדי ליישר קרני לייזר משולבות לתוך המיקרוסקופ (איור 2C). יישמו תחילה קרן אחת למיקרוסקופ והשתמשו בזוגות המראה על הקרן השנייה כדי להבטיח את החפיפה המרחבית של שתי האלומות.
9. הגדר את חלק הזיהוי.
   1. הרכיבו מעבה שמן מצופה אינפרא-אדום (1.4-NA) כדי לאסוף את המשאבה ההולכת קדימה ואת קורות סטוקס לאחר שעברו דרך הדגימות (איור 2C).
   2. הרכיבו פוטודיודה Si בעלת שטח גדול על קופסה מסוככת עם מחברי BNC (איור 2E). הוסף ספק כוח DC 64-V לפוטודיודה המותקנת כדי להגדיל את סף הרוויה ואת רוחב הפס של התגובה.
   3. שחזרו את האור ההולך קדימה באמצעות מראה בגודל 2 אינץ'. מקד מחדש את האור על הפוטודיודה לאחר מסנן אופטי כדי לחסום את קרן סטוקס המווסתת (איור 2D).
   4. שלח את זרם הפלט של הפוטודיודה למגבר נעילה מהיר המסתיים עם 50 להדגמת אותות. שלח הדק של 8 מגה-הרץ למגבר הנעילה כאות הייחוס.
   5. שלח את רכיב ה- X הפאזה של מגבר הנעילה לתוך תיבת הממשק האנלוגית של המיקרוסקופ.
10. מטב את החפיפה הטמפורלית עם שלב ההשהיה הממונע המובנה על ידי מדידת אות ה-SRS של נוזל D₂O טהור במיקרוסקופ.

5. רכישה וניתוח של תמונות

1. בצע הדמיית epr-SRS רב-ערוצית עם כוונון אורך גל רציף של משאבה.
   1. הגדר את כוח הלייזר _למשאבת P = 10-40 mW ו- P_Stokes = 40-80 mW בלוח הבקרה של הלייזר.
   2. הגדר את זמן השהייה של הפיקסלים ל- 2-4 μs והשתמש במסגרות מרובות בממוצע של 10-20 פריימים בתוכנת המיקרוסקופיה.
      הערה: הימנע משימוש קומבינטורי בהספק לייזר גבוה (_משאבת P> 40 mW, P_Stokes> 80 mW) וגודל פיקסלים קטן (<0.2 מיקרומטר), אשר ככל הנראה גורמים ל'אפקט הלבנה' של צבעי ראמאן עקב עירור מרובה-פוטון.
   3. הגדר את קבועי הזמן של מגבר הנעילה למחצית מזמן השהייה של הפיקסל.
2. אי-התערבבות ספקטרלית ליניארית.
   הערה: epr-SRS עוקב אחר תלות ליניארית קפדנית באות לריכוז על פני כל טווח הריכוזים; לפיכך, אי-ערבוב ספקטרלי ליניארי יעיל להסרת כל שיחות צולבות פוטנציאליות בין ערוצים. עבור מדידת epr-SRS של ערוץ N עם N גשושיות MARS, אותות מדודים (S) יכולים לבוא לידי ביטוי כ- S = MC, כאשר C הוא ריכוזי הגשושית MARS, ו- M היא מטריצת N x N הנקבעת על ידי חתכי ראמאן של גשושיות MARS.
   1. מדוד מטריצה M על דגימות אימונו-eprSRS בצבע יחיד המסומנות בבדיקות MARS שונות.
   2. השתמש במשוואה C = M−1· S כדי לקבוע את מטריצת הריכוז של גשושית MARS באמצעות מדידת אותות מדגם מולטיפלקס S.

איור 3 מציג תמונות לדוגמה של epr-SRS בדגימות שונות, כולל תאים קבועים (איור 3A), רקמות עכבר קבועות של פרפורמלדהיד (PFA) (איור 3B) ודגימות אנושיות משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) (איור 3C). הרזולוציה המרחבית של מיקרוסקופיית SRS מוגבלת עקיפה, הרזולוציה הצידית האופיינית היא ~ 300 ננומטר, והרזולוציה הצירית היא 1-2 מיקרומטר באמצעות אור אינפרה-אדום קרוב לעירור. כתוצאה מכך, מבנים תת-תאיים עדינים כמו מיקרוטובולים בתאי HeLa התגלו בנאמנות באמצעות הדמיה אימונו-eprSRS של α-טובולין (איור 3A). יתר על כן, epr-SRS תואם בדרך כלל לרקמות FFPE (איור 3C), שהיא צורה נפוצה של דגימות ביופסיה לאבחון קליני ולמחקר פתולוגי. בדומה למיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שני פוטונים, כתהליך לא ליניארי, ל-epr-SRS יש יכולת חתך אופטית להדמיית תבניות תלת-ממדיות ברזולוציה תת-תאית (איור 3D-E).

הצגנו לראשונה את התועלת להדמיית חלבונים מולטיפלקס של epr-SRS על דגימות רקמה קפואות קבועות של איי עכברים של לנגרהנים בלבלב. מספר מטרות מתעניינות נבחרות, כולל ביטוי הורמונים (למשל, אינסולין, אגוניסט גלוקוז (גלוקגון), פוליפפטיד לבלב (PP) וסומטוסטטין) לסיווג סוג התא (תאים β ותאים שאינם β (תאים α, δ)) וגורמי שעתוק הידועים כקשורים להטרוגניות של β תאים²³. יש לציין כי מאחר שזיהוי פלואורסצנציה הוא אורתוגונלי לזיהוי SRS, epr-SRS תואם באופן מלא לפלואורסצנציה קונפוקלית ולפלואורסצנציה של שני פוטונים. כהוכחת היתכנות, הדמיית טנדם SRS-פלואורסצנטית בת 7 צבעים על איון יחיד הושגה בקלות (איור 4) עם ניגודיות טובה ותבניות נכונות. יעדים בעלי ביטוי נמוך כגון גורם השעתוק Pdx1 צולמו עם ניגודיות מספקת.

הדגמנו גם הדמיית טנדם SRS-פלואורסצנטית בת שמונה צבעים ברקמות המוח הקטן של העכברים הקבועות ב-PFA (איור 5). באמצעות סמנים ביולוגיים מבוססים, ניתן לזהות סוגי תאים שונים, כגון נוירונים של גרגירי המוח הקטן (NeuN), נוירוני פורקיניה (קלבינדין), אסטרוציטים (GFAP), אוליגודנדרוציטים (MBP) ונוירונים GABAergic (קולטן GABA B₂ ).

איור 1: מיקרוסקופיית Epr-SRS להדמיית חלבונים מרובבים מאוד. (A) דיאגרמת אנרגיה עבור ראמאן ספונטני, SRS שאינו מהדהד ו-SRS קדם-תהודה אלקטרונית (epr-SRS). קצב המעבר הרטטי של הכרומופורים ישופר ב-epr-SRS עד פי^10. (B) הדמיה חיסונית מבוססת אפיטופ של α-טובולין הודגמה בתאי COS-7 המוכתמים על ידי ATTO740 עם ניגודיות רטט גבוהה על ידי epr-SRS. אות ה-epr-SRS נעלם לחלוטין כאשר אורך הגל של לייזר המשאבה מחוץ לתהודה ב-2 ננומטר בלבד (מימין). סרגלי קנה מידה, 20 מיקרומטר( C) ספקטרום Epr-SRS של גשושיות MARS מצומדות באסטר NHS כמפורט בחומר משלים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: תכנון מערך המיקרוסקופים SRS. (A) דיאגרמה סכמטית של מערך ה-SRS. EOM = אפנן אלקטרו-אופטי, M = מראה, L = עדשה, DBS = מפצל קרן דיכרואי, DM = מראה דיכרונית, OB = עדשה אובייקטיבית, CO = מעבה, F = מסנן, PD = פוטודיודה. (B) לוח זה מציג את חלק עירור הלייזר. קרן דו-צבעית מיציאת לייזר מופרדת תחילה כאשר כל קרן מתנגשת ומורחבת ובהמשך משולבת ומכוונת לגוף המיקרוסקופ. (C) לוח זה מציג את האוסף המועבר באמצעות מעבה. (D) לוח זה מציג את החלק של זיהוי SRS. פוטודיודה ומסנן מותקנים על תיבה מסוככת עם שני מחברים נקבות BNC. מחבר BNC נמוך יותר מיועד למתח הטיה הפוך, ומחבר ה- BNC הגבוה יותר מיועד ליציאת אות זרם למגבר נעילה המסתיים ב- 50 Ω. (E) פאנל זה מראה כיצד פוטודיודה Si מותקן בתוך התיבה המסוככת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: הדמיית צבע ראמאן של סמני חלבון מובחנים באמצעות אימונו-לייב. (A) הדמיית Immuno-eprSRS של α-טובולין בתאי HeLa. (B) הדמיית אימונו-eprSRS של NeuN בקליפת המוח של עכבר קבוע PFA. (C) הדמיית אימונו-eprSRS של וימנטין ברקמת FFPE של הכליה האנושית. (D) תמונה מעובדת נפח של MARS2145 מוכתמת GFAP ברקמת מוח עכבר בעובי 100 מיקרומטר. גודל הצעד ב-z היה 2 μm. (E) תמונה מעובדת נפח שלMARS2228 מוכתמת NeuN ברקמת מוח עכברית בעובי 40 מיקרומטר. גודל המדרגה ב-z היה 1 מיקרומטר. סרגלי קנה מידה, 20 מיקרומטר אינץ' (A), 50 מיקרומטר אינץ' (B-C), 30 מיקרומטר אינץ' (D-E). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 4: תוצאות מייצגות של הדמיית טנדם טנדם בת 7 צבעים של הורמונים וגורמי שעתוק על רקמת איון עכבר קפואה. Epr-SRS: אינסולין (זוהה על ידי Cy5, סמן תא β, ירוק), Pdx1 (זוהה על ידי MARS2228, גורם שעתוק, אדום), גלוקגון (זוהה על ידי MARS2216, סמן תא α, צהוב), PP (זוהה על ידי MARS2147, סמן תאי PP, כחול). פלואורסצנציה: סומטוסטאטין (Alexa488, סמן תאים δ, כתום), Nkx2.2 (Cy3, גורם שעתוק, מג'נטה), DAPI (גרעין, כחול כהה). סרגל קנה מידה, 20 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 5: תוצאות מייצגות של הדמיית טנדם של 8 צבעים של סמנים מסוג תאים על מקטע מוח עכבר קבוע PFA. פלואורסצנציה: דנ"א (DAPI), GABA (γ-חומצה אמינו-בוטירית) קולטן B 2 (נוירונים GABAergic, Alexa Fluor 488), גרעיני עצב (NeuN; נוירונים, Alexa Fluor 568) וקלבינדין (נוירוני פורקיניה, Alexa Fluor 647); epr-SRS: נבט חיטה אגלוטינין (WGA; MARS2228), וימנטין (MARS2200), חלבון בסיסי של מיאלין (MBP; אוליגודנדרוציטים, MARS2176) ו-GFAP (אסטרוציטים ותאי גזע עצביים, MARS2145). סרגל קנה מידה, 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

טבלה 1: נוגדנים מאומתים עבור אימונו-eprSRS. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.

חומר משלים: תכונות של 8 בדיקות MARS מתפקדות NHS-אסטר מנוצלות. λ_abs ומקדמי עירור של צבעי MARS נמדדו בתמיסת DMSO בספקטרומטר UV-Vis באמצעות cuvette זכוכית של 1 ס"מ כמיכל. חתכי הרמאן המוחלטים של צבעי MARS נקבעו ב-DMSO על ידי השוואת אות epr-SRS של צבעי MARS עם מצב המתיחה הסטנדרטי C−O (1030 ^cm-1) של מתנול. חתך הראמן המוחלט עבור מצב המתיחה הסטנדרטי C−O (1030 ס"^מ-1) של מתנול דווח כ-2.1 x ^10-30 ס"מ² ב-785 ננומטר. חתך רוחב של 0.9 x ^10-30 ס"מ² הוערך תחת אורך גל של משאבת 860 ננומטר על ידי אקסטרפולציה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

כאן אנו מציגים את פרוטוקול immuno-eprSRS אשר ישים באופן נרחב לסוגי רקמות נפוצים, כולל רקמות עכברים שזה עתה השתמרו, רקמות אנושיות FFPE ורקמות עכבר קפואות. Immuno-eprSRS אומת עבור פאנל של אפיטופים בתאים וברקמות, כמפורט בטבלה 1. פלטפורמה זו של ירייה אחת מתאימה במיוחד ליישומים שבהם אסטרטגיות מחזוריות אינן מתפקדות היטב. לדוגמה, פלואורסצנציה מחזורית דורשת רקמות עבות מכיוון שסבבים מרובים של סימון חיסוני תלת-ממדי הם ארוכים לא מעשיים¹⁷. כמו כן, סביר מאוד להניח שהוא יציג שגיאות רישום עקב שינויים היסטולוגיים תלת-ממדיים לא ליניאריים^11,17. Immuno-eprSRS מתגבר על מחסומים מעשיים של פלואורסצנציה מחזורית בתרחיש כזה ומביא הזדמנויות לחשוף רשתות אינטראקציה של חלבונים על פני נפח גדול¹⁷.

המולטיפלקסיות הנוכחית מוגבלת בעיקר על ידי זמינותם של נוגדנים משניים. בעוד שבפרוטוקול זה, התמקדנו בסימון חיסוני עקיף, שבו בדיקות MARS מצומדות לנוגדנים משניים, סימון חיסוני ישיר וכתם לקטין אפשריים¹⁷. לאחר אימות נוגדנים ראשוני יותר עם צבעי ראמאן, צפויים 20 ערוצים עם צבעי ראמאן המפותחים כעת 13,18,24. יתר על כן, הדמיה של מטרות בעלות שפע נמוך מאוד עלולה להיות מאתגרת עבור epr-SRS בשל רגישותה הפגועה מעט בהשוואה למערכת הפלואורסצנטית הקונפוקלית. בהקשר זה, אנו ממליצים להקצות מטרות בעלות שפע נמוך יחסית לצבעי MARS בהירים יותר ויעדים בעלי ביטוי נמוך לערוצי פלואורסצנציה.

היבט קריטי של הפרוטוקול הוא הנגישות של מכשירים ובדיקות. מבחינת מכשור, מיקרוסקופ SRS מורכב בדרך כלל ממקור לייזר דו-צבעי עם אפנן אופטי, מיקרוסקופ, גלאי פוטודיודה ומגבר נעילה לדמודולציה²⁵. כל רכיב זמין באופן מסחרי עם עלות כוללת מעט גבוהה יותר מאשר מיקרוסקופ פלואורסצנטי לסריקת לייזר של שני פוטונים. מיקרוסקופ מחקר רב-מודאלי משולב באופן מלא של SRS/פלואורסצנציה עבר מסחור²⁶ באמצעות לייזר פיקו-שניות דומה לזה של עירור SRS וערכות לייזר של גלים רציפים (CW) לפלואורסצנציה. מערכת זו ישימה בקלות להדמיה רטטית מרובה במחקר ביולוגי יומיומי. מבחינת גשושיות MARS עדיין לא מסחור ודורשות יכולות סינתזה מסוימות. לחלופין, ניתן להשתמש בפלואורופורים מסחריים רבים באדום רחוק (עיין בטבלת נתונים מורחבת 1 ב- L. Wei et al. Nature 2017¹³) עבור epr-SRS. עם זאת, המולטיפלקסיות עלולה להיפגע. יתר על כן, מכיוון שבדיקות MARS מטבען הן מולקולות אורגניות קטנות, אימונו-eprSRS דומה לאימונופלואורסצנציה במונחים של צביעת רקמות. לכן, ניתן להעביר בקלות את הארכיון של ריאגנטים מאומתים של זיקה כגון נוגדנים באימונופלואורסצנציה ליישומי אימונו-eprSRS.

למחברים אין מה לחשוף.

אנו מודים לרות א. סינגר ולריצ'רד ק.פ. באנינגר על אספקת רקמות הלבלב של העכבר. W.M. מכיר בתמיכה של NIH R01 (GM128214), R01 (GM132860), R01 (EB029523) וצבא ארה"ב (W911NF-19-1-0214).