פרופיל של רפרטואר קולטני תאי הרג טבעיים אנושיים-ליגנד

Elena Vendrame; Julia L. McKechnie; Thanmayi Ranganath; Nancy Q. Zhao; Arjun Rustagi; Rosemary Vergara; Geoffrey T. Ivison; Lisa M. Kronstad; Laura J. Simpson; Catherine A. Blish

doi:10.3791/61912

Summary

כאן אנו מתכננים שני פאנלים משלימים של ציטומטריית מסה (CyTOF) ומייעלים פרוטוקול צביעה של CyTOF במטרה ליצור פרופיל של קולטן תאי ההרג הטבעי ורפרטואר הליגנד בהקשר של זיהומים ויראליים.

Abstract

תאי הרג טבעיים (NK) הם בין המגיבים הראשונים לזיהומים נגיפיים. היכולת של תאי NK לזהות ולהרוג במהירות תאים נגועים בנגיף מווסתת על ידי ביטוים של קולטנים מעכבים ומפעילים מקודדים בקו הנבט. המעורבות של קולטנים אלה על ידי הליגנדים הקוגנטיים שלהם על תאי המטרה קובעת אם האינטראקציה הבין-תאית תביא להרג תאי NK. פרוטוקול זה מפרט את התכנון והאופטימיזציה של שני לוחות ציטומטריית מסה משלימה (CyTOF). פאנל אחד תוכנן לפנוטיפ של תאי NK על סמך ביטוי הקולטן. הפאנל השני תוכנן לחקור ביטוי של ליגנדים ידועים לקולטני תאי NK במספר תת-קבוצות של תאים חיסוניים. יחד, שני הפאנלים הללו מאפשרים פרופיל של רפרטואר הקולטן-ליגנד של תאי NK אנושיים. יתר על כן, פרוטוקול זה מפרט גם את התהליך שבו אנו מכתימים דגימות עבור CyTOF. תהליך זה עבר אופטימיזציה לשיפור יכולת השחזור והסטנדרטיזציה. היתרון של CyTOF הוא היכולת שלו למדוד למעלה מ-40 סמנים בכל פאנל, עם חפיפה מינימלית של אותות, מה שמאפשר לחוקרים ללכוד את רוחב הרפרטואר של קולטן-ליגנד של תאי NK. ברקוד פלדיום גם מפחית את השונות בין הדגימות, כמו גם את צריכת הריאגנטים, מה שמקל על צביעת דגימות עם כל פאנל במקביל. המגבלות של פרוטוקול זה כוללות את התפוקה הנמוכה יחסית של CyTOF וחוסר היכולת לשחזר תאים לאחר הניתוח. לוחות אלה תוכננו לניתוח דגימות קליניות מחולים הסובלים מזיהומים נגיפיים חריפים וכרוניים, כולל נגיף דנגי, נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV) ושפעת. עם זאת, ניתן להשתמש בהם בכל מסגרת כדי לחקור את רפרטואר הקולטן-ליגנד של תאי NK אנושיים. חשוב לציין, ניתן ליישם שיטות אלה באופן נרחב לתכנון וביצוע של לוחות CyTOF עתידיים.

Introduction

תאי הרג טבעיים (NK) הם תאי חיסון מולדים שתפקידם העיקרי הוא למקד ולהרוג תאים ממאירים, נגועים או סטרס אחר. באמצעות הפרשת ציטוקינים כגון IFNγ ו-TNFα, כמו גם פעילותם הציטוטוקסית, תאי NK יכולים גם לעצב את התגובה החיסונית הנרכשת לפתוגנים וממאירות. תגובת ה-NK מתווכת בחלקה על ידי איתות קומבינטורי של קולטנים מעכבים ומפעילים מקודדים בקו הנבט, הקושרים מספר עצום של ליגנדים המתבטאים בתאי מטרה פוטנציאליים. למספר קולטנים של תאי NK יש יותר מליגנד אחד עם זוגות קולטנים-ליגנדים חדשים המזוהים באופן קבוע.

יש עניין מיוחד בחקר תאי NK בהקשר של זיהומים ויראליים, כאשר יכולתם להגיב במהירות לתאי לחץ עשויה להגביל את התפשטות הנגיף או לקדם פיתוח אסטרטגיות התחמקות מתאי NK. עניין זה בביולוגיה של תאי NK משתרע על תחום האימונותרפיה של סרטן, שם חוקרים חוקרים את תפקידם של תאי NK במעקב חיסוני של גידול ובמיקרו-סביבת הגידול¹. עם זאת, היכולת ליצור פרופיל של אינטראקציות בין תאי NK לתאי מטרה מסובכת בשל העובדה שתאי NK אנושיים יכולים לבטא למעלה מ-30 קולטנים אשר בתורם יכולים לקיים אינטראקציה עם למעלה מ-30 ליגנדים ידועים². זיהוי בו-זמני של קולטני תאי NK מרובים והליגנדים הקוגנטיים שלהם הוא, אם כן, הכרחי כדי ללכוד את המורכבות של אינטראקציות הקולטן-ליגנד השולטות בתפקוד NK. כתוצאה מכך, פנינו לציטומטריית מסה (CyTOF), המאפשרת זיהוי בו זמנית של למעלה מ-40 סמנים ברמת התא הבודד. המטרה שלנו הייתה ליצור שני לוחות CyTOF כדי ליצור פרופיל של רפרטואר קולטן-ליגנד של תאי NK. רצינו גם לעצב פרוטוקול לעיבוד וצביעה יעילים של דגימות קליניות. דגימות אנושיות קליניות מספקות שפע של מידע על האופן שבו הגוף מגיב לזיהום ויראלי. לכן, פיתחנו פרוטוקול זה כדי לחקור את הביטוי של קולטני תאי NK והליגנדים הקוגנטיים שלהם במקביל לסטנדרטיזציה טובה יותר, התאוששות משופרת, צריכת ריאגנטים מופחתת והשפעות אצווה מוגבלות.

מספר לוחות ציטומטריית זרימה שנועדו לאפיין את הפנוטיפ של תאי NK אנושיים פורסמו בעבר 3,4,5,6,7,8. רוב הפאנלים הללו מוגבלים ביכולתם ללכוד את רוחב רפרטואר הקולטן-ליגנד, מה שמאפשר רק זיהוי של מבחר מוגבל של סמנים. יתר על כן, לוחות אלה מוגבלים על ידי חפיפת אותות בין פלואורוכרומים. CyTOF משתמש בנוגדנים מצומדים לאיזוטופים מתכתיים, הנקראים על ידי ספקטרומטריית מסה של זמן טיסה, ובכך מפחיתים באופן דרמטי את הזליגה בין הערוצים.

כמונו, חוקרים אחרים פנו ל-CyTOF כדי לחקור תאי NK 9,10,11,12,13,14, אם כי בדרך כלל עם פחות סמנים של תאי NK, מה שמפחית את עומק הפנוטיפ. בעוד שפרוטוקולי הצביעה הכלליים המשמשים את הקבוצות הללו דומים לשלנו, ישנם כמה הבדלים עיקריים. פרוטוקולים אחרים אינם כוללים בידוד תאי NK לפני הצביעה, למרות שהחוקרים מתעניינים רק בתת-קבוצה זו^13,14. בהתחשב בכך שתאי NK מהווים רק 5-20% מהתאים החד-גרעיניים בדם ההיקפי (PBMCs), צביעת PBMCs שלמים במקום תאי NK מבודדים פירושה שרוב האירועים שנאספו לא יהיו תאי NK. זה מפחית את כמות הנתונים שנוצרים בתת-קבוצת העניין וגורם לניצול לא יעיל של זמן המכונה. בנוסף, בעוד שרבים מהפאנלים הללו חוקרים ביטוי של קולטני תאי NK כגון קולטנים דמויי Ig קטלניים (KIRs), NKG2A/C/D וקולטני הציטוטוקסיות הטבעיים (NKp30, NKp44 ו-NKp46), ביטוי סמנים אלה אינו מובא בהקשר רחב יותר בשל היעדר נתונים על ביטוי הליגנדים שלהם. כתוצאה מכך, בעוד ששיטות אלה שפורסמו בעבר לחקירת תאי NK באמצעות CyTOF מספיקות לפנוטיפ רחב של תאי NK, המשמשים בבידוד, הן אינן יכולות לספק תמונה מקיפה של פעילות תאי NK. זה מביא אותנו ליתרון העיקרי של השיטות המתוארות כאן, והוא שעד לנקודה זו לא פורסמו ציטומטריית זרימה או פאנלים של CyTOF המתמקדים בחקר הביטוי של ליגנדים לקולטני תאי NK. חשוב לציין, ללוח הליגנד שלנו יש מספר ערוצים פתוחים המאפשרים הוספת סמנים שיתאימו לצרכים הייחודיים של כל ניסוי.

בהתחשב בכך שאחת המגבלות העיקריות של CyTOF היא חוסר היכולת לשחזר את הדגימה לאחר הניתוח, ייתכן ששיטה זו לא תתאים לחוקרים שיש להם דגימות מוגבלות איתן הם מעוניינים לבצע ניסויים נוספים. בנוסף, אופי התפוקה הנמוך של CyTOF פירושו שהנתונים שנוצרו יהיו באיכות ירודה אם מספר התאים ההתחלתי נמוך. למעט שתי המגבלות הללו, שיטה זו תפעל היטב בכל סביבה כדי לחקור אינטראקציות קולטן-ליגנד בין תאי NK לתאי מטרה.

Protocol

PBMCs אנונימיים למבוגרים בריאים הושגו מתאי מערכת הפחתת לויקוגרפיה שנרכשו ממרכז הדם של סטנפורד. PBMCs מתורמי ילדים בריאים וחולי דנגי חריפה בילדים התקבלו ממכון גורגס ללימודי בריאות בפנמה סיטי, פנמה ובתי חולים השייכים למשרד הבריאות, מערכת הביטוח הלאומי בפנמה סיטי ואזורים פרבריים. פרוטוקול מחקר הדנגי אושר על ידי ה-IRB של בית החולים דל ניניו (CBIHN-M-0634), ולאחר מכן אושר על ידי הוועדות של ICGES, CSS, בית החולים סנטו תומאס ואוניברסיטת סטנפורד. PBMCs מחולים נגועים ב-HIV בטיפול אנטי-רטרו-ויראלי התקבלו ממחקר ACTG A5321.

1. תיוג נוגדנים, הכנת פאנל ואחסון

תיוג נוגדנים עם איזוטופים מתכתיים
הערה: כדי להגביר את הסטנדרטיזציה הבין-ניסויית של צביעה, מומלץ לבצע צימודים מרובים עבור כל נוגדן ולאחר מכן לשלב את המוצרים לתערובת מאסטר אחת לאחסון לטווח ארוך כמתואר להלן.
1. קבע את הריכוז של כל נוגדן על ידי מדידת הספיגה ב-280 ננומטר לפני ההצמדה. נוגדנים המשמשים לפרוטוקול זה זמינים מסחרית ונרכשו מהספקים המפורטים בטבלת החומרים.
2. סמן נוגדנים עם איזוטופים מתכתיים באמצעות ערכות תיוג נוגדנים זמינות מסחרית בהתאם להוראות היצרן. השתמש ב-100 מיקרוגרם נוגדן לכל תגובה.
3. קבע את הריכוז הסופי של הנוגדן המוחזר על ידי מדידת הספיגה ב-280 ננומטר. אחסן נוגדנים לטווח קצר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
טיטרציות נוגדנים
הערה: טכנולוגיית CyTOF רגישה מאוד לאותות מזהמים פוטנציאליים ממתכות סביבתיות. לכן, יש להכין את כל המאגרים/ריאגנטים המשמשים עם מים טהורים במיוחד ולאחסן במיכלי פלסטיק או זכוכית שמעולם לא נשטפו בסבון.
1. הכן צינורות צנטריפוגות לכל תורם המכילים 9 מ"ל RPMI חם ושלם (RPMI 1640, 10% FBS, 1% L-גלוטמין, 1% פניצילין/סטרפטומיצין) ו-20 מיקרוליטר בנזונאז לכל בקבוקון של PBMCs להפשרה. מפשירים את ה-PBMCs באמבט מים ומוסיפים לצינורות.
  הערה: בנזונאז מפחית את הצמיגות והרקע מ-DNA חופשי מתאים ליזים.
2. צנטריפוגה בטמפרטורה של 300 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות. השעו מחדש את ה-PBMCs ב-5 מ"ל של מדיית RPMI מלאה וספירה.
3. עבור כל טיטרציה של פאנל, צלח 2-4 מיליון PBMCs / באר ב -6 בארות של צלחת תחתונה עגולה של 96 בארות (באר אחת לכל טיטר ואחת ללא מוכתמים). צנטריפוגה את הצלחת בחום של 600 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. יש להזיז את הצלחת כדי להסיר את הסופרנטנט. השעו מחדש כל באר ב-200 מיקרוליטר של CyPBS.
4. בצע צביעת כדאיות ציספלטין כמתואר להלן.
  הערה: ציספלטין משמש להבחנה בין תאים חיים לתאים מתים בציטומטריה המונית.
  1. השעו מחדש תאים ב-100 מיקרוליטר של מלאי ציספלטין של 25 מיקרומטר. דוגרים בטמפרטורת החדר למשך דקה.
  2. להרוות את תגובת הציספלטין על ידי הוספת 100 מיקרוליטר FBS לכל באר וערבוב. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
    הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגה הבאים ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. שטפו תאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של CyFACS (1x PBS ללא מזהמי מתכות כבדות במים טהורים במיוחד עם 0.1% BSA, 0.05% נתרן אזיד). צנטריפוגה והעיף את הצלחת בכל פעם.
5. יש לטטר את לוח הנוגדנים על פני השטח כמתואר להלן.
  הערה: יש לבצע תערובות מאסטר נפרדות עבור לוח המשטח של NK ולוח הליגנד.
  1. צור תערובת מאסטר של כל הנוגדנים על פני השטח בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות CyFACS. כוון לנפח סופי של 150 מיקרוליטר. בצע דילולים סדרתיים של 1:2 באמצעות CyFACS, כדי להשיג את הריכוזים הבאים: 10, 5, 2.5, 1.25 ו-0.625 מיקרוגרם/מ"ל.
  2. סנן קוקטיילים של נוגדנים דרך יחידת סינון צנטריפוגלית (גודל נקבוביות של 0.1 מיקרומטר) ב-10,600 x גרם למשך 3 דקות לפני הצביעה.
  3. השעו מחדש את התאים המצופים ב-50 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים על פני השטח בטיטר המתאים. השעו מחדש את הבאר הלא מוכתמת ב-CyFACS. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
  4. שטפו תאים עם 150 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
  5. שטפו תאים עם 200 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
6. בצע קיבוע של תאים על ידי השעיה מחדש של כל באר ב-100 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד (PFA) ב-CyPBS. דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר בחושך למשך 20 דקות. שטפו תאים עם 100 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה ב 700 x גרם למשך 5 דקות.
  זהירות: PFA חשוד כגורם לפגמים גנטיים כמו גם לסרטן. בנוסף, הוא מזיק אם הוא בא במגע עם העיניים, העור או נשאפ. טפל כראוי על ידי הקפדה על אוורור טוב, פתיחת השקע בזהירות ומניעת היווצרות אירוסולים.
  הערה: כל סיבובי הצנטריפוגות הבאים מבוצעים ב-700 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
7. לחדור תאים על ידי השעיה מחדש ב-200 מיקרוליטר של 1x מאגר פרמביליזציה (מאגר סלסול) מדולל במים טהורים במיוחד. צנטריפוגה והעיף את הצלחת. שטפו תאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר פרם. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
  הערה: אין צורך בדגירה במאגר Perm.
8. טיטרציה של פאנל נוגדנים תוך-תאיים
  1. הכינו תערובת מאסטר של כל הנוגדנים התוך-תאיים בריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל באמצעות Perm Buffer. כוון לנפח סופי של 150 מיקרוליטר. בצע דילולים סדרתיים של 1:2 באמצעות Perm Buffer כדי להשיג את הריכוזים הבאים: 10, 5, 2.5, 1.25 ו-0.625 מיקרוגרם/מ"ל.
  2. סנן קוקטיילים של נוגדנים דרך יחידת סינון צנטריפוגלית (גודל נקבוביות של 0.1 מיקרומטר) ב-10,600 x גרם למשך 3 דקות לפני הצביעה.
  3. השעו מחדש את התאים המצופים ב-50 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים התוך תאי בטיטר המתאים. השעו מחדש את הבאר הלא מוכתמת במאגר פרם. יש לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
    הערה: אם פאנל תוך-תאי לא הולך לעבור טיטרציה, השהה מחדש בארות ב-50 מיקרוליטר של מאגר פרם.
  4. שטפו תאים עם 150 מיקרוליטר של מאגר פרם. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
  5. שטפו תאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר פרם. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
  6. שטפו תאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
9. צביעת אינטרקלטור DNA
  הערה: אינטרקלטור נקשר לחומצת גרעין תאית ומשמש לזיהוי תאים גרעיניים בציטומטריית מסה.
  1. השעיה מחדש של תאים ב-200 מיקרוליטר של אינטרקלטור מדולל 1:10,000 ב-CyPBS ו-2% PFA. דוגרים את הצלחת למשך הלילה בחום של 4 מעלות צלזיוס.
  2. יש לאחסן צלחות, במידת הצורך, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס מכוסות בניילון פרפין עד שבוע.
    הערה: בצע את כל שלבי הצנטריפוגה הבאים ב-700 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
  3. לפני הפעלת הדגימות ב-CyTOF, הסר את סרט הפרפין מהצלחת והצנטריפוגה ב-700 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. החלק את הצלחת. שטפו תאים פעם אחת עם 200 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
  4. שטפו תאים שלוש פעמים עם 200 מיקרוליטר מים טהורים במיוחד. צנטריפוגה והעיף את הצלחת. השעו מחדש תאים ב-200 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד. מיד לפני הפעלת הדגימה, התאם את הריכוז לכ-6 x 10⁵ תאים/מ"ל בחרוזי נורמליזציה מדוללים לריכוז פי 1 במים טהורים במיוחד.
10. הפעל את הדוגמאות ב-CyTOF.
11. נתח נתונים ובחר טיטרים מתאימים לכל נוגדן על ידי בחירת טיטר הנוגדנים הנמוך ביותר שמביא לעוצמת האות הגבוהה ביותר ולהפרדה הטובה ביותר בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות על סמך הערכה חזותית.
  הערה: טיטרציות עבור לוחות NK וליגנד מוצגות באיור 1 ובאיור 2 בהתאמה. אם לא מזוהה הבחנה ברורה בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות, ניתן להעריך טיטרים על סוגי תאים מרובים או על קווי תאים, כדי לאפשר זיהוי של אוכלוסיות תאים חיוביות ושליליות כאחד.
12. אחסון פאנל נוגדנים
  1. שלב נוגדנים עם טיטרציה לתערובת מאסטר וסנן דרך יחידת מסנן מזרק סטרילית של 0.1 מיקרומטר. יש לבצע תערובות מאסטר נפרדות עבור לוח המשטח של NK, הפאנל התוך-תאי של NK ולוח הליגנד.
  2. לאחסון לוחות לטווח הארוך, עקוב אחר אחת משתי האפשרויות המקובלות:
  3. שלח מיקס מאסטר לחברת צד שלישי לליופיליזציה. שיטה זו משמשת עבור החלונית NK. נוגדנים שאינם מצומדים בתוך הבית אינם ניתנים לליופיליזציה, בשל נוכחותו של מייצב נוגדנים, המפריע לתהליך הליופיליזציה. נוגדנים אלה מתווספים לפאנל ביום הצביעה.
  4. השתמש בפיפטה משחזרת כדי להכין 50 מיקרוליטר מכל תערובת מאסטר ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

2. פרוטוקול מכתים

להפשיר תאים חד-גרעיניים בדם היקפי (PBMCs) כמתואר בשלבים 1.2.1 ו-1.2.2. הקצו לפחות מיליון PBMCs לצביעה של פאנל ליגנד בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל. שמור את ה-PBMCs הללו על קרח במהלך בידוד תאי ה-NK.
בידוד תאי NK
הערה: השלבים הבאים של בידוד תאי NK הם גרסה שונה של פרוטוקול של ספק ספציפי. עם זאת, כל ערכה או פרוטוקול המבצעים ברירה שלילית מבוססת מגנטית של תאי NK יהיו חלופה מתאימה. בנוסף, שלב זה הוא אופציונלי מכיוון שפרוטוקול זה מתאים גם לפנוטיפ של תאי NK מ-PBMCs שלמים.
1. סובב את ה-PBMCs הנותרים ב-450 x גרם למשך 5 דקות. השעו מחדש את כדור התא ב-40 מיקרוליטר של מאגר MACS (PBS, 0.5% BSA, 2 מ"מ EDTA) לכל 10⁷ תאים בסך הכל.
2. הוסף 10 מיקרוליטר של קוקטייל נוגדנים ביוטין של תאי NK לכל 10⁷ תאים בסך הכל. מערבבים היטב ומדגרים 5 דקות על קרח.
3. הוסף 30 מיקרוליטר של מאגר MACS לכל 10⁷ תאים בסך הכל ו-20 מיקרוליטר של קוקטייל MicroBead של תא NK לכל 10⁷ תאים בסך הכל. מערבבים היטב ומדגרים 10 דקות על קרח.
4. הכן עמודות פליטה על ידי שטיפה עם 500 מיקרוליטר של מאגר MACS. הוסף 2 מ"ל של RPMI שלם קר לצינורות איסוף של 15 מ"ל.
5. הוסף מאגר MACS לצינורות המכילים תאים כדי להביא את הנפח עד 500 מיקרוליטר. שוטפים את הצינור עם עוד 500 מיקרוליטר של מאגר MACS ומעבירים לעמודה.
6. לאחר הפסקת הזרימה, שטפו את עמוד הפליטה עם מאגר MACS של 500 מיקרוליטר פעמיים. לאחר הפסקת הזרימה, ספור תאי NK.
צלחת ושטיפה של תאים.
1. צנטריפוגה בודדה תאי NK ו-PBMCs ב-300 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. השעיית תאים בריכוז של 5 מיליון תאים/מ"ל ב-CyPBS (1x PBS ללא מזהמי מתכות כבדות במים טהורים במיוחד). תאי צלחת בצלחת U תחתונה, 96 בארות.
  הערה: כל ציטוט של לוח התאים NK יכול לצבוע עד 3 מיליון תאים. אם שש דגימות תאי NK בודדות עוברות ברקוד ומאוגדות לפני הצביעה, המספר הכולל הכולל של תאי NK לא יעלה על 3 מיליון. לוח הליגנד יכול להכתים עד 6 מיליון PBMCs לכל דגימה. אם שש דגימות בודדות מקודדות ומאוגדות לפני הצביעה, המספר הכולל הכולל של PBMCs לא יעלה על 6 מיליון.
2. צלחת צנטריפוגה ב 600 x גרם בטמפרטורת החדר למשך 3 דקות. יש להזיז את הצלחת כדי להסיר את הנוזל העל.
  הערה: בצע את כל סיבובי הצנטריפוגה הבאים ב-600 x גרם למשך 3 דקות עד לשלב 2.7.
3. השעו מחדש תאים ב-200 מיקרוליטר של CyPBS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
בצע צביעת כדאיות ציספלטין כמתואר בשלב 1.2.4.
צביעת ברקוד
הערה: לוחות אלה משמשים בשילוב עם שיטת ברקוד מבוססת פלדיום ששתיים מתוך ארבע על תאים חיים לא קבועים כדי למזער את השפעות האצווה ולמקסם את התאוששות התאים¹⁵. עם זאת, שלב זה הוא אופציונלי מכיוון שברקוד אינו הכרחי כדי להשיג נתונים איכותיים.
1. השעו מחדש כל באר ב-50 מיקרוליטר של ברקוד מעורבב מראש בהתאמה ודגרו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטפו תאים עם 150 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
2. שטפו תאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת. השעו מחדש את כל הבארות ב-30 מיקרוליטר של CyFACS. שלבו עד שש בארות של תאים מוכתמים בברקודים ייחודיים לבאר אחת ובצעו צנטריפוגה והחלקה של הצלחת.
מכתים על פני השטח
1. ממיסים את הליוספירה של פאנל NK ב-50 מיקרוליטר של CyFACS עם נוגדנים נוספים על פני השטח (anti-CD16, anti-HLA-DR, anti-LILRB1). הפשירו פאנל ליגנד המאוחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס וסובבו את הצינור באמצעות מיני צנטריפוגה. ספייק בסמני משטח נוספים של לוח ליגנד (anti-CD16, anti-CD19).
  הערה: יש לסנן כל קוקטייל נוגדנים שלא סונן בעבר (כלומר, לפני ליופיליזציה או הקפאה) דרך יחידת סינון צנטריפוגלית (גודל נקבוביות של 0.1 מיקרומטר) ב-10,600 x גרם למשך 3 דקות לפני הצביעה.
2. השעו מחדש כל באר ב -50 מיקרוליטר של הפאנל המתאים. דגירה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. שטפו תאים עם 150 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת. שטפו שוב תאים עם 200 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
תקן תאים כמתואר בשלב 1.2.6.
הערה: בצע את כל סיבובי הצנטריפוגות הבאים ב-700 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
לחדור תאים כמתואר בשלב 1.2.7.
צביעה תוך-תאית
1. ממיסים את הליוספירה התוך-תאית של פאנל NK ב-50 מיקרוליטר של מאגר פרם. הכן קוקטייל נוגדנים תוך תאי לדגימות PBMC אם תרצה.
  הערה: יש לסנן כל קוקטייל נוגדנים שלא סונן בעבר (כלומר, לפני ליופיליזציה או הקפאה) דרך יחידת סינון צנטריפוגלית (גודל נקבוביות של 0.1 מיקרומטר) ב-10,600 x גרם למשך 3 דקות לפני הצביעה.
2. השעו בארות ב -50 מיקרוליטר מהפאנלים התוך-תאיים המתאימים. אם לא נעשה שימוש בפאנל תוך-תאי בשילוב עם לוח פני השטח של הליגנד, השהה מחדש בארות PBMC ב-50 מיקרוליטר של מאגר פרם. יש לדגור בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
3. שטפו תאים עם 150 מיקרוליטר של מאגר פרם. צנטריפוגה וצלחת פליק. שטפו תאים עם 200 מיקרוליטר של מאגר פרם. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
4. שטפו תאים פעמיים עם 200 מיקרוליטר של CyFACS. צנטריפוגה והעיף את הצלחת.
צביעת אינטרקלטור DNA. בצע צביעת אינטרקלטור DNA כמתואר בשלב 1.2.9.1. דגרו את הצלחת למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
הערה: אינטרקלטור נקשר לחומצת גרעין תאית ומשמש לזיהוי תאים גרעיניים בציטומטריית מסה. ניתן לאחסן צלחות מכוסות בניילון פרפין עד שבוע בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
לפני הפעלת הדגימות ב-CyTOF, שטפו תאים כמתואר בשלבים 1.2.9.3 ו-1.2.9.4.
הפעל דוגמאות ב-CyTOF.

תוצאות

נוגדנים הוצמדו לאיזוטופים מתכתיים באמצעות ערכות תיוג זמינות מסחרית, על פי הוראות היצרן. שיבוטי נוגדנים אומתו על ידי ציטומטריית זרימה וציטומטריית מסה לפני השימוש בפאנל זה. רשימה ראשונית של שיבוטים נבחרה על סמך סקירת הספרות וזמינות הנוגדנים. רמות הביטוי של ליגנדים מסוימים עבור קולטני תאי NK נמוכות או בלתי ניתנות לזיהוי ב-PBMCs בריאים. לכן, צביעה חיובית עבור נוגדנים מסוימים אומתה על ידי צביעת PBMCs בריאים, תאי לוקמיה מיאלואידית כרונית K562, תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה NALM6, או לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי B 697 (איור משלים 1). שיבוטים שנבחרו עבור לוח התאים NK שלא ייצרו כתם הולם או שהיו יקרים מדי הוחלפו בשיבוטים שונים, כמפורט בטבלה משלימה 1 ומוצג באיור משלים 2.

זיווג איזוטופים מתכתיים עם נוגדנים עבור לוחות אלה בוצע תוך שימוש בעקרונות שהותוו על ידי Takahashi et ^al.16. סמני השושלת היו בעוצמה בינונית עד גבוהה. כתוצאה מכך, הם היו מצומדים בעיקר למסות בעלות רגישות נמוכה ובינונית, מה שהשאיר מסות רגישות גבוהות זמינות להצמדה לנוגדנים כנגד סמנים בעלי ביטוי עמום יותר. תוכנת מעצב פאנל זמינה לציבור שימשה לאיתור בעיות רגישות לשפע (M ± 1 bleed) או חמצון (M + 16 bleed) וזוגות נוגדנים-מתכת הוקצו מחדש בהתאם. בנוסף, מספר סמנים הוצמדו על מתכות שונות עם הבדלים מינימליים שצוינו בעוצמות האות (טבלה משלימה 2 ואיור משלים 3). זיווגי נוגדנים-מתכת ומידע על שיבוטים עבור לוחות NK וליגנד מפורטים בטבלה 1 ובטבלה 2 בהתאמה.

נוגדנים מצומדים פנימיים נבדקו על PBMCs בחמישה טיטרים שונים: 0.625, 1.25, 2.5, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל. טיטר הנוגדנים הנמוך ביותר שהביא לעוצמת האות הגבוהה ביותר ולהפרדה הטובה ביותר בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות נבחר על סמך הערכה חזותית. טיטרציות עבור לוחות NK וליגנד מוצגות באיור 1 ובאיור 2 בהתאמה. עבור סמנים מסוימים, לא זוהתה הבחנה ברורה בין אוכלוסיות חיוביות ושליליות, מכיוון שהסמן היה מבוטא במעומעם או חיובי באופן אוניברסלי. כדי לקבוע את דילול העבודה המדויק ביותר עבור נוגדנים אלה, טיטרים הוערכו על סוגי תאים מרובים (PBMCs, תאי T, תאי B או תאי NK), או על קווי תאים, כדי לאפשר זיהוי של אוכלוסיות תאים חיוביים ושליליים כאחד (איור משלים 4). מדד הצביעה (SI) עבור כל סמן לא חושב מכיוון שמדד זה אינו ישים לנתוני CyTOF^17,18.

הפאנלים המתוארים כאן תוכננו להיות תואמים לברקוד לדוגמה. ישנן מספר שיטות ברקוד זמינות עבור CyTOF. הנפוצים ביותר הם ערכה מבוססת פלדיום זמינה מסחרית, הדורשת קיבוע לפני קידוד, ושיטת הברקוד מבוססת CD45 שתוארה על ידי Mei et ^al.15, המאפשרת ברקוד של תאים חיים. כדי להעריך איזו שיטת ברקוד מתאימה ביותר לצרכים שלנו, בדקנו את היציבות של צביעת סמן תאי NK לאחר קיבוע בגרסה מוקדמת של פאנל תאי NK (איור משלים 5). מצאנו כי הביטוי של רוב סמני תאי NK הושפע מקיבוע. כתוצאה מכך, החלטנו להשתמש בשיטת ברקוד מותאמת של שניים מתוך ארבעה, מבוססת CD45 על תאים חיים¹⁵. שיטת ברקוד זו משתמשת ^ב-102Pd, ¹⁰⁴Pd, ¹⁰⁶Pd ^ו-108Pd, ושונה משיטת שלוש מתוך שש שתוארה במקור על ידי Mei et al., שהשתמשה ^ב-104Pd, ¹⁰⁶Pd, ¹⁰⁸Pd, ¹¹⁰Pd, ¹¹³אינץ' ^ו-115אינץ'. ערוצי אינדיום לא נכללו בסכימת הברקוד שלנו, מכיוון שהם הפריעו לאות ^מ-115In-CD3. ¹¹⁰Pd לא נכלל מכיוון שהוא הפריע לאות מה-HLA-DR Qdot וה-CD19 Qdot בתא NK ובלוחות הליגנד, בהתאמה.

למרות שאנו ממליצים על טיהור תאי NK לפני הצביעה, לוח תאי NK נועד לאפשר פנוטיפ של תאי NK מ-PBMCs שלמים. דוגמה לאסטרטגיית שער תאי NK שלנו מוצגת באיור 3A באמצעות PBMCs מתורם בריא. צביעה ושערים עבור כל אחד מסמני ה-NK מוצגים על תאי NK בריאים ומבודדים באיור 3B. פאנל הליגנד נועד לזהות את הביטוי של ליגנדים של תאי NK על PBMCs שלמים. איור 4A ממחיש את אסטרטגיית השער המשמשת לזיהוי תאי CD4⁺ T, תאי CD8⁺ T, תאי NK, מונוציטים ותאי CD19⁺ B ב-PBMCs מתורם בריא. דוגמאות צביעה מייצגות עבור כל ליגנד מוצגות באיור 4B באמצעות PBMCs מחולי דנגי חריפים ואנשים נגועים ב-HIV שדוכאו וירולוגית.

כדי להבטיח יציבות פאנל לאורך זמן, הפרוטוקול שלנו כולל שתי אפשרויות אפשריות: ליופיליזציה באמצעות חברת צד שלישי לחרוזים חד פעמיים או הקפאת אליקוטים מוכנים מראש ב-80 מעלות צלזיוס. עבור פרוטוקול זה, פאנל ה-NK עבר ליופיליזציה, ופאנל הליגנד הוקפא. שתי השיטות אומתו לפני השימוש בכל פאנל בדגימות קליניות.

הפקנו למעלה מ-700 תגובות של פאנל NK מתערובת מאסטר אחת על ידי ביצוע צימודים מרובים של כל נוגדן בפאנל. לאחר אימות וטיטרציה של כל נוגדן מצומד, הנוגדנים שולבו לתערובת מאסטר, סוננו דרך יחידת מסנן מזרק סטרילית של 0.1 מיקרומטר, ונשלחו לחברת צד שלישי לליופיליזציה. נוצרו שתי קבוצות של ליוספירות עם כתמים בודדים, אחת לצביעה על פני השטח ואחת לצביעה תוך-תאית. לא ניתן היה להוסיף נוגדנים שאינם מצומדים בתוך הבית (HLA-DR ו-CD16) לליאוספירה, בשל נוכחותו של מייצב נוגדנים, המפריע לתהליך הליופיליזציה. נוגדנים אלה מתווספים לפאנל ביום הצביעה. השוואה בין כתמים שהתקבלו לפני ואחרי הליופיליזציה מוצגת באיור משלים 6. השיבוט של נוגדן LILRB1 ששימש בתחילה בליוספרות לא יצר כתם חזק מספיק (טבלה משלימה 1 ואיור משלים 2). לאחר מכן זוהה שיבוט טוב יותר, צורף ונוסף ללוח ביום הצביעה (טבלה 1). הנוגדן הפוליקלונלי KIR2DS2 המשמש בליופשרים צוין כמייצר כתם לא ספציפי לאחר ליופיליזציה ואיננו ממליצים להשתמש בו לניתוחים הבאים (טבלה משלימה 1 ואיור משלים 2). רוב הכתמים התוך-תאיים עלו מעט בעוצמתם בעקבות ליופיליזציה (איור משלים 6).

לפני האחסון של תערובת מאסטר פאנל הליגנד ב-80 מעלות צלזיוס, בדקנו שני תנאי אחסון שונים. הכנו תערובת מאסטר קטנה יותר של פאנל זה ואחסנו כמויות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ובחנקן נוזלי למשך כחודשיים. לאחר חודשיים הכתמנו PBMCs שלמים עם האליקוטים הקפואים. השווינו את הצביעה לזו של PBMCs מאותו תורם שהוכתם בפאנל הטרי שהוכן (איור משלים 7). מצאנו אחסון ב-80 מעלות צלזיוס ובחנקן נוזלי אינו משנה את עוצמת האות עבור רוב הסמנים. למעשה, עוצמת האות של אנטי-פאן HLA Class I, anti-CD7, anti-CD4, anti-HLA-BW4, anti-CD14, anti-CD11b ו-anti-LFA-3 גבוהה יותר בהקפאה, במיוחד במקרה של דגימות המאוחסנות ב-80 מעלות צלזיוס. לא יכולנו לקבוע אם עוצמות האותות של anti-LLT-1, anti-Nectin-1, anti-MICA/B, anti-DR4/5, anti-ULBP-1,2,5,6, anti-Nectin-2, anti-CD155 ו-anti-B7-H6 הושפעו מההקפאה, בשל העובדה ש-PBMCs בריאים אינם מבטאים רמות גבוהות של סמנים אלה. עם זאת, אימות סמנים אלה על קווי תאים (איור משלים 1) בוצע באמצעות נוגדנים מצומדים המאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס. כתוצאה מכך, היינו בטוחים שהקפאה לא גרמה לאובדן משמעותי של האות. עוצמת האות אכן ירדה עם ההקפאה עבור חמישה סמנים: anti-CD8, anti-ICAM-1, anti-CCR2, anti-CD33 ו-anti-CD56. עם זאת, בכל המקרים הללו נותרה ההפרדה הברורה בין האוכלוסייה החיובית לאוכלוסייה השלילית. בהתחשב בכך שנוגדנים מצומדים מתכת אינם יציבים ב-4 מעלות צלזיוס לפרקי זמן ארוכים, הקפאה הייתה הכרחית כדי לשמור על יציבות הפאנל לטווח ארוך, ולמרות ירידה בעוצמת הצביעה בתת-קבוצה של סמנים, הצלחנו לשמור על הפרדת צביעה מספקת. חשוב לציין, אובדן עוצמת האות של anti-CD8, anti-CCR2 ו-anti-CD56 היה גדול יותר בדגימות המאוחסנות בחנקן נוזלי בהשוואה לאלו המאוחסנות ב-80 מעלות צלזיוס. על סמך נתונים אלה, החלטנו לאחסן את הפאנל בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.

figure-results-7770
איור 1: טיטרציה של צימודי נוגדנים-מתכת מצומדים פנימיים עבור פאנל NK. טיטרציות של נוגדנים מצומדים פנימיים בוצעו על PBMCs מתורם בריא תוך שימוש בחמישה ריכוזים שונים: 0.625, 1.25, 2.5, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל. טיטרים לאנטי-CD3, אנטי-CD14, אנטי-CD33, אנטי-CD19, אנטי-PD-1 ואנטי-CD56 נקבעו על ידי שער על תאים חיים. טיטרים לאנטי-CD4 ואנטי-CD8 נקבעו על ידי שער על תאי T. טיטרים לנוגדנים הנותרים נקבעו על ידי שער על תאי NK. מכיוון ש-NKp44 אינו מתבטא בתאי NK במנוחה, נקבעו טיטרים על PBMCs מגורים עם IL-2 והוצגו בתאי NK. החצים האדומים מציינים את הטיטר שנבחר עבור כל נוגדן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-8689
איור 2: טיטרציה של נוגדנים בפאנל ליגנד מצומד פנימי. טיטרציות של נוגדנים מצומדים פנימיים בוצעו על PBMCs מתורם בריא תוך שימוש בחמישה ריכוזים שונים: 0.625, 1.25, 2.5, 5 ו-10 מיקרוגרם/מ"ל. טיטרים לאנטי-HLA-DR, אנטי-ICAM-1, אנטי-CCR2, אנטי-CD14, אנטי-CD11b ואנטי-LFA-3 נקבעו על ידי שער ^{על תאי} CD3-CD7. טיטרים לאנטי-CD3, אנטי-HLA Class I, אנטי-CD7, אנטי-CD48, אנטי-LLT-1, אנטי-HLA-C,E, אנטי-HLA-E, אנטי-FasR, anti-Nectin-1, anti-MICA/MICB, anti-DR4/DR5, anti-ULBP-1,2,5,6, anti-Nectin-2, anti-CD155, anti-HLA-BW4, anti-HLA-BW6, anti-CD33, anti-CD56 ו-Anti-B7-H6 נקבעו על ידי שער על תאים חיים. טיטרים לאנטי-CD4 ואנטי-CD8 נקבעו על ידי שער על תאי CD3⁺. החצים האדומים מציינים את הטיטר שנבחר עבור כל נוגדן. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-9754
איור 3: אסטרטגיית שער פאנל NK וביצועים. (A) שער שלילי סדרתי מ-PBMCs שלמים לתאי NK מוצג בתורם בריא. שערים שלמים, חרוזים ואורך אירוע מבטיחים שער מוצלח לתאים בודדים. צביעת ציספלטין בוצעה ככתם חי/מת. תאי T ותאי B לא נכללו באמצעות CD3 ו-CD19. מונוציטים לא נכללו על ידי שער שלילי על CD4 ו-CD14/CD33 ועל ידי שער שלילי נוסף של תאים^בהירים CD56-/HLA-DR. CD56 ו-CD16 שימשו לזיהוי תת-קבוצות שונות של תאי NK (CD56^בהיר, CD56^עמום ^ו-CD56-). (B) דוגמאות לביטוי של קולטני תאי NK על תאי NK מתורם בריא אחד שמטוהר על ידי בידוד חרוזים מגנטיים. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-10690
איור 4: שער פאנל ליגנד וביצועים. (A) שער של תת-קבוצות תאי חיסון עיקריים מ-PBMCs שמקורם בתורם בריא לאחר נורמליזציה, הסרת חרוזי כיול והסרת קידוד. (B) ביטוי של ליגנדים לקולטני תאי NK כמו גם מספר סמנים מיאלואידים על PBMCs חיים. צביעה עבור כל הליגנדים למעט Nectin-1 ו-B7-H6 מוצגת ב-PBMCs מחולי דנגי חריפה. צביעה עבור Nectin-1 ו-B7-H6 מוצגת על PBMCs מאנשים נגועים ב-HIV שדוכאו וירולוגית. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: אימות שיבוטי נוגדנים עבור פאנל ליגנד על קווי תאים. נוגדנים נגד ליגנדים לקולטני תאי NK המתבטאים ברמות נמוכות ב-PBMCs בריאים אומתו על ידי צביעת קווי תאים. תאי לוקמיה מיאלואידית כרונית K562 נצבעו באנטי-ICAM-1, אנטי-MICA/MICB, אנטי-DR4/DR5, אנטי-ULBP-1,2,5,6, אנטי-נקטין-2, אנטי-CD155 ואנטי-B7-H6. תאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה NALM6 נצבעו באנטי-LLT-1 ותאי לוקמיה לימפובלסטית חריפה של תאי B 697 נצבעו באנטי-נקטין-1. עלילות נקודות והיסטוגרמות המציגות כתמים על PBMCs בריאים הם בכחול. תרשימי נקודות והיסטוגרמות המראים צביעה על קו התא המתאים הם באדום. אחוז התאים של קו התאים המתאים החיוביים לסמן נתון מסופקים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 2: אימות של שיבוטי נוגדנים. (A) שיבוטי נוגדנים שונים נבדקו בתורמים בריאים כדי לזהות את השיבוט עם הספציפיות הטובה ביותר. 2B4, CXCR6, KIR2DS4, NKG2A ו-TIGIT מוצגים בתאי NK. CD56 ו-LILRB1 מוצגים על תאים חיים. (B) שיבוט הנוגדנים KIR2DS2 הראה כתם לא ספציפי אחרי ליופיליזציה. דוגמה לצביעה על אותו תורם ניתנת לפני ואחרי הליופיליזציה. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 3: אופטימיזציה של זוגות נוגדנים/מתכות. מוצגים כתמים של PBMCs מתורמים בריאים. (א) זוגות נוגדנים/מתכת שנבדקו עבור הפאנל. (ב) זוגות נוגדנים/מתכת המשמשים בפאנל. LILRB1 ו-PD1 מוצגים על תאים חיים. כל שאר הסמנים מוצגים בתאי NK. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 4: טיטרציה של סמני תאי NK בעלי ביטוי עמום וחיובי ברובם. טיטרים לנוגדנים כנגד סמני תאי NK שלא הראו אוכלוסייה חיובית ושלילית ברורה הוערכו הן על תאי NK (אדום) והן על תאי B (כחול) או PBMCs (אפור) מתורמים בריאים. החצים מציינים את הטיטר שנבחר עבור כל נוגדן. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 5: אופטימיזציה של פרוטוקול ברקוד. יציבות האפיטופ נבדקה לפני ואחרי קיבוע עם 2% פרפורמלדהיד על PBMCs מתורם בריא. (A) צביעת CD3, CD14 ו-CD56 הייתה דומה לפני הקיבוע (האדום) ואחרי הקיבוע (הכחול), צביעת CD4 ו-CD16 הושפעה באופן משמעותי מהקיבוע. (B) סמנים רבים של תאי NK הושפעו מקיבוע, כולל CD2, CD38, KIR3DL2, CD62L, KIR2DS4, NKp46, NKG2C, NKp30, NKG2D, KIR3DL1, TIGIT, KIR2DL1, KIR2DL3 ו-NTB-A. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 6: אישור יציבות הפאנל לאחר ליופיליזציה. היציבות של צימודי נוגדנים פנימיים אושרה על ידי צביעת PBMCs מאותו תורם בנק דם לפני ליופיליזציה (כחול) ופוסט-ליופיליזציה (אדום). כתמים נגד CD3, אנטי-CD14, אנטי-CD33, אנטי-CD19, אנטי-PD-1, אנטי-CD56 מוצגים על תאים חיים. אנטי-CD4 ואנטי-CD8 מוצגים על תאי CD3⁺ . טיטרים עבור הנוגדנים הנותרים מוצגים על תאי NK, מגודרים בהתאם לסכימת השערים המוצגת באיור 1. יש לציין כי אנטי-KIR2DS2 מוכתם באופן לא ספציפי לאחר ליופיליזציה ולכן לא שימש לניתוחים הבאים. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

איור משלים 7: אישור יציבות לוח הליגנד ב-80 מעלות צלזיוס. היציבות של צימודי נוגדנים פנימיים אושרה על ידי צביעת PBMCs בריאים מאותו תורם בתערובת מאסטר טרייה שהוכנה וכן אותה תערובת לאחר אחסון ב-80 מעלות צלזיוס או בחנקן נוזלי. צביעה נגד HLA-DR, אנטי-ICAM-1 ואנטי-LFA-3 מוצגת ^{על תאי} CD3-CD7-. אנטי-CD3, אנטי-פאן HLA Class I, אנטי-CD7, אנטי-CD48, אנטי-LLT-1 אנטי-HLA-E, אנטי-FasR, אנטי-Nectin-1, אנטי-MICA/B, אנטי-DR4/5, אנטי-ULBP-1,2,5,6, אנטי-Nectin-2, אנטי-CD155, אנטי-HLA-BW4, אנטי-HLA-BW6 ואנטי-B7-H6 צביעה מוצגת על תאים חיים. צביעה נגד CD8 ואנטי CD4 מוצגת על תאי CD3⁺. צביעה נגד HLA-C,E, ANTI-CCR2, anti-CD11b ואנטי-CD33 מוצגת על תאי CD3-CD7-CD14⁺. צביעה נגד CD14 מוצגת בתאי CD3-CD7-CD33⁺ וצביעה נגד CD56 מוצגת ^בתאי CD3-CD7⁺CD14-HLA-DR. היסטוגרמות המציגות כתמים עם הפאנל הטרי שהוכן באדום. היסטוגרמות המציגות כתמים עם הפאנל לאחר אחסון ב-80 מעלות צלזיוס למשך כחודשיים הן בכחול. היסטוגרמות המציגות צביעה עם הפאנל לאחר אחסון בחנקן נוזלי (LN₂) במשך כחודשיים הן בצבע ירוק. הדגימות היו מוכתמות והופעלו בימים שונים. הקבצים נורמלו וחרוזים הוסרו באמצעות חבילת premessa. אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.

ספציפיות	שיבוט	איזוטופ	תכלית	משטח/תוך-תאי
CD57	HCD57	⁸⁹Y	בשלות/זיכרון	משטח
CD45	היי30	¹⁰²Pd, ¹⁰⁴Pd, ¹⁰⁶Pd, ¹⁰⁸Pd	ברקוד	משטח
HLA-DR	Tü36	Qdot 655 (¹¹²תקליטורים-114 תקליטורים)	הפעלה/שושלת	משטח
תקליטור 3	UCHT	¹¹⁵ב	שושלת תאי T	משטח
תקליטור 38	היט 2	¹⁴¹יחסי ציבור	סמן הפעלה	משטח
תקליטור 69	FN50	¹⁴²Nd	סמן הפעלה	משטח
תקליטור 33	WM53	¹⁴³Nd	שושלת מונוציטים	משטח
תקליטור 14	M5E5	¹⁴³Nd	שושלת מיאלואידית	משטח
תקליטור 2	RPA-2.10	¹⁴⁴Nd	הפעלה/בשלות	משטח
LILRB1	MAB20172	¹⁴⁵Nd	קולטן מעכב	משטח
תקליטור 19	HIB19	¹⁴⁶Nd	שושלת תאי B	משטח
תקליטור 8	SK1	¹⁴⁷ס.מ.	שושלת תאי T והפעלה/בשלות של תאי NK	משטח
פ.ק.ר.ג	פוליקלונלי	¹⁴⁸Nd	בגרות/הסתגלות	תאיים
תקליטור 4	SK3	¹⁴⁹ס.מ.	שושלת תאי T	משטח
סיק	4ד10.2	¹⁵⁰Nd	איתות	תאיים
CD62L	DREG-56	¹⁵¹האיחוד האירופי	ההפעלה	משטח
קי-67	קי-67	¹⁵²ס.מ.	התפשטות	תאיים
KIR2DS4	179315	¹⁵³האיחוד האירופי	הפעלת קולטן	משטח
NKp46	9.00ה+02	¹⁵⁵אלוהים	הפעלת קולטן	משטח
NKG2D	1D11	¹⁵⁶אלוהים	הפעלת קולטן	משטח
טיגיט	741182	¹⁵⁷אלוהים	קולטן מעכב	משטח
2ב4	ג1.7	¹⁵⁸אלוהים	הפעלת קולטן	משטח
דנאם-1	DX11	¹⁵⁹שחפת	הפעלת קולטן	משטח
FAS-L	NOK-1	¹⁶⁰אלוהים	אפופטוזיס	משטח
NKp30	עמ' 30-15	¹⁶¹די	הפעלת קולטן	משטח
סיגלק-7	עונה 7.7	¹⁶²די	קולטן מעכב	משטח
NKG2C	134522	¹⁶³די	בשלות/זיכרון	משטח
NKp44	עמ' 44-8	¹⁶⁴די	הפעלת קולטן	משטח
תקליטור 96	NK92.39	¹⁶⁵הו	קולטן NKG2	משטח
KIR2DL1/KIR2DS5	143211	¹⁶⁶Er	קולטן מעכב	משטח
תקליטור 94	DX22	¹⁶⁷Er	הפעלת קולטן	משטח
CXCR6	K041E5	¹⁶⁸Er	זכרון	משטח
PD1	EH12.2H7	¹⁶⁹תמ	קולטן מעכב	משטח
KIR2DL5	UP-R1	¹⁷⁰Er	קולטן מעכב	משטח
NKG2A	131411	¹⁷¹יב	קולטן מעכב	משטח
NTB-A	NT-7	¹⁷²שחפת	הפעלת קולטן	משטח
KIR3DL1	DX-9	¹⁷³יב	קולטן מעכב	משטח
CD56	NCAM16.2	¹⁷⁴יב	שושלת תאי NK	משטח
KIR2DL3	180701	¹⁷⁵לו	קולטן מעכב	משטח
פרפורין	B-D48	¹⁷⁶יב	חלבון ציטוליטי	תאיים
DNA-1/DNA-2	נה	¹⁹¹איר/¹⁹³איר	תאים גרעיניים	משטח
ציספלטין	נה	¹⁹⁴נק/¹⁹⁵נק'	כדאיות	משטח
תקליטור 16	3G8	²⁰⁹Bi	קולטן FcgRIII	משטח

טבלה 1: פאנל NK. סמנים מסודרים על פי המסה האיזוטופית של המתכת שאליה הם היו מצומדים. ¹⁹¹Ir/¹⁹³Ir הוא השפע הטבעי של אינטרקלטור חומצת הגרעין. ¹⁹⁴Pt/¹⁹⁵Pt הוא השפע הטבעי של ציספלטין.

ספציפיות	שיבוט	איזוטופ	תכלית	משטח/תוך-תאי
HLA-DR	L243	⁸⁹Y	תאים מציגים אנטיגן, סמן הפעלה	משטח
CD45	היי30	¹⁰²Pd, ¹⁰⁴Pd, ¹⁰⁶Pd, ¹⁰⁸Pd	ברקוד	משטח
תקליטור 19	SJ25-C1	Qdot 655 (¹¹²תקליטורים-114 תקליטורים)	השושלת	משטח
תקליטור 3	UCHT1	¹¹⁵ב	השושלת	משטח
פאן HLA מחלקה I	מ6/32	¹⁴³Nd	ליגנדים של KIR	משטח
תקליטור 7	CD7-6B7	¹⁴⁴Nd	השושלת	משטח
תקליטור 8	SK1	¹⁴⁵Nd	השושלת	משטח
CD48	BJ40	¹⁴⁶Nd	ליגנד 2B4	משטח
ICAM-1	HA58	¹⁴⁸Nd	ליגנד LFA-1	משטח
LLT-1	402659	¹⁴⁹ס.מ.	ליגנד CD161	משטח
תקליטור 4	אישור4	¹⁵¹האיחוד האירופי	השושלת	משטח
HLA-C,E	DT9	¹⁵³האיחוד האירופי	ליגנדים של KIR	משטח
CCR2	K036C2	¹⁵⁴ס.מ.	סמן פונקציונלי מונוציטים	משטח
HLA-E	תלת מימד12	¹⁵⁵אלוהים	ליגנד NKG2A/CD94 ו-NKG2C/CD94	משטח
פאס (CD95)	DX2	¹⁵⁶אלוהים	קולטן FasL	משטח
נקטין-1	₪302	¹⁵⁷אלוהים	ליגנד CD96	משטח
מיקה/ב	159227/236511	¹⁵⁸אלוהים	ליגנדים NKG2D	משטח
DR4/5	DJR1/DJR2-2	¹⁵⁹שחפת	קולטני TRAIL	משטח
ULBP-1/2,5,6	170818/165903	¹⁶¹די	ליגנדים NKG2D	משטח
נקטין-2	TX31	¹⁶⁴די	ליגנד DNAM-1, TIGIT ו-CD96	משטח
תקליטור 155	סקי.4	¹⁶⁵הו	ליגנד DNAM-1, TIGIT ו-CD96	משטח
HLA-BW4	REA274	¹⁶⁶Er	KIR3DL1 ligand	משטח
HLA-BW6	REA143	¹⁶⁸Er	אלל אפס KIR	משטח
תקליטור 14	M5E2	¹⁶⁹תמ	השושלת	משטח
CD11b	ICRF44	¹⁷⁰Er	השושלת	משטח
LFA-3	TS2/9	¹⁷¹יב	ליגנד CD2	משטח
תקליטור 33	WM53	¹⁷²יב	השושלת	משטח
CD56	NCAM16.2	¹⁷⁴יב	השושלת	משטח
B7-H6	875001	¹⁷⁶יב	ליגנד NKp30	משטח
DNA-1/DNA-2	נה	¹⁹¹איר/¹⁹³איר	תאים גרעיניים	משטח
ציספלטין	נה	¹⁹⁴נק/¹⁹⁵נק'	כדאיות	משטח
תקליטור 16	3G8	²⁰⁹Bi	השושלת	משטח

טבלה 2: לוח ליגנד. סמנים מסודרים על פי המסה האיזוטופית של המתכת שאליה הם היו מצומדים. ¹⁹¹Ir/¹⁹³Ir הוא השפע הטבעי של אינטרקלטור חומצת הגרעין. ¹⁹⁴Pt/¹⁹⁵Pt הוא השפע הטבעי של ציספלטין.

ספציפיות	שיבוט	ספק	מספר קטלוגי	משטח/ תוך-תאי	הערות
2ב4	2-69	BD Biosciences	550814	משטח	שיבוט חדש מאומת עם צביעה משופרת
CD56	N901	בקמן קולטר	6602705	משטח	שיבוט חדש מאומת עם צביעה משופרת
CXCR6	56811	מערכות מו"פ	מב699	משטח	שיבוט חדש מאומת בעלות נמוכה יותר
KIR2DS2	פוליקלונלי	אבקם	ab175486	משטח	צביעה לא ספציפית שצוינה לאחר ליופיליזציה - לא משמשת לאנליזות
KIR2DS4	FES172	בקמן קולטר	א60796	משטח	שיבוט חדש מאומת עם צביעה משופרת/עלות נמוכה יותר
LILRB1	ג'י/75	ביולג'נד	333702	משטח	שיבוט חדש מאומת עם צביעה משופרת
NKG2A	Z199	בקמן קולטר	IM2750	משטח	שיבוט חדש מאומת בעלות נמוכה יותר
טיגיט	MBSA43	תרמו פישר סיינטיפיק	16-9500-82	משטח	שיבוט חדש מאומת

טבלה משלימה 1: נוגדנים לפאנל תאי NK שנבדקו, אך לא נעשה בהם שימוש.

איזוטופ	ספציפיות	שיבוט	ספק	מספר קטלוגי	משטח/ תוך-תאי
¹⁴³Nd	NKG2C	134522	מערכות מו"פ	MAB1381	משטח
¹⁴⁵Nd	תקליטור 38	היט 2	ביולג'נד	303502	משטח
¹⁴⁶Nd	תקליטור 8	SK1	ביולג'נד	344702	משטח
¹⁴⁹ס.מ.	תקליטור 2	RPA-2.10	ביולג'נד	300202	משטח
¹⁵¹האיחוד האירופי	סיגלק-7	עונה 7.7	ביולג'נד	347702	משטח
¹⁵⁴ס.מ.	LILRB1	292319	מערכות מו"פ	MAB20172	משטח
¹⁶³די	KIR3DL1	DX-9	BD מדעי הביולוגיה	555964	משטח
¹⁶⁸Er	CD62L	DREG-56	ביולג'נד	304802	משטח
¹⁷¹יב	PD1	EH12.2H7	ביולג'נד	329902	משטח
¹⁷⁶יב	תקליטור 69	EH12.2H7	ביולג'נד	329902	משטח

טבלה משלימה 2: נוגדנים לפאנל תאי NK שנבדקו עם זיווג נוגדן/מתכת שונה.

Discussion

כאן אנו מתארים את התכנון והיישום של שני לוחות CyTOF משלימים שמטרתם לאפיין את רפרטואר הקולטן-ליגנד של תאי NK. פרוטוקול זה כולל מספר שלבים שהם קריטיים להשגת נתונים איכותיים. CyTOF משתמש ביוני מתכות כבדות, ולא בפלואורוכרום, כבדיקות תווית לנוגדנים¹⁹. לכן טכנולוגיה זו נתונה לאותות מזהמים פוטנציאליים ממתכות סביבתיות²⁰. מקורות פוטנציאליים לזיהומי מתכות כוללים סבון כלים במעבדה (בריום) ומאגרי מעבדה (כספית, עופרת, פח). מסיבה זו, מומלץ להכין את כל המאגרים עם מים טהורים במיוחד, ולאחסן את כל הריאגנטים במיכלי פלסטיק או זכוכית שמעולם לא נשטפו בסבון. שלב קריטי נוסף בפרוטוקול זה הוא כתם הכדאיות, המשתמש בשיטה מבוססת ציספלטין כפי שתוארה על ידי Fienberg et ^al.21. שיטה זו כוללת שלב דגירה של דקה, שבמהלכו ציספלטין מסמן באופן מועדף תאים שאינם ברי קיימא. יש לבצע צביעת ציספלטין בהיעדר FBS. כתוצאה מכך, יש לשטוף היטב את התאים עם CyPBS לפני הצביעה. בנוסף, כדי למנוע צביעה מחוץ למטרה של תאים ברי קיימא, יש להרוות את כתם הציספלטין עם FBS לאחר דקה אחת בדיוק. פרוטוקול זה עבר אופטימיזציה לשחזור תאים מקסימלי וביצועי צביעה. לכן, גם שלבי הקיבוע והחדירות הם משמעותיים. מספר ריאגנטים לקיבוע וחדירות תואמים ל-CyTOF. עם זאת, מצאנו כי קיבוע עם 2% PFA, ואחריו חדירות עם מאגר חדירות ספציפי המפורט בטבלת החומרים, הביא להתאוששות תאים מקסימלית. מכיוון שמדובר בשיטת חדירות חולפת, יש לבצע צביעה תוך תאית במאגר החדירות כדי להבטיח חדירת נוגדנים נאותה. כמו כן, יש לשטוף את התאים ביסודיות עם מאגר החדירות לאחר צביעה תוך-תאית כדי להסיר נוגדנים לא קשורים.

פרוטוקול זה מאפשר מספר שינויים אפשריים. ניתן להתאים את לוחות CyTOF המפורטים כאן כך שיכללו סמנים נוספים או יחליפו סמנים קיימים. בפרט, לוח הליגנד תוכנן עם מספר ערוצים פתוחים כדי לאפשר גמישות בעיצוב הפאנל. כל שינוי או תוספת ללוח עשויים לדרוש פתרון בעיות נוסף. בפרט, יש לאמת ביסודיות כל זוג איזוטופים של נוגדן/מתכת כמתואר לעיל, כדי למנוע כל בעיה של זליגת אות לערוצים הקיימים. לוחות אלה תוכננו גם כך שיהיו תואמים לברקוד לדוגמה. ברקוד מקטין את האפשרות של השפעות אצווה והעברת דגימה לדגימה, תוך מזעור צריכת ריאגנטים²². למרות שברקוד מביא בדרך כלל לאיכות נתונים מוגברת כוללת, שלב זה אינו הכרחי לרכישת נתוני CyTOF באיכות טובה וניתן לדלג עליו לחלוטין. באופן דומה, למרות שאנו ממליצים על טיהור תאי NK לפני הצביעה, לוח תאי ה-NK תואם לפנוטיפ של תאי NK מ-PBMCs שלמים.

לשיטה זו יש כמה מגבלות. בשל אופי התפוקה הנמוך מטבעו של CyTOF, שיטה זו אינה מתאימה לדגימות עם ספירת תאים נמוכה. דגימות כאלה לא צפויות להניב נתונים באיכות מספקת לניתוח. בנוסף, בהתחשב בכך שפאנלים אלה תוכננו במיוחד כדי לחקור אינטראקציות בין תא NK לתאי מטרה, הם מוגבלים ביכולתם להעריך אינטראקציות בין סוגי תאים אחרים, כגון תאי CD8⁺ T ותאים מיאלואידים. באופן דומה, לוחות אלה תוכננו לאימונופנוטיפ ישיר ex vivo ולא נבדקו או אומתו לשימוש בתנאים מפעילים, כגון גירוי ציטוקינים. יתר על כן, למרות שפאנלים אלה מכסים רשימה מקיפה של קולטנים וליגנדים של תאי NK, הם אינם ממצים לחלוטין, ומספר סמנים בעלי חשיבות פוטנציאלית לא נכללו בשל מגבלות מקום. חלק מהסמנים הללו כוללים, אך אינם מוגבלים ל-KLRG1, CRACC, TIM-3, LAIR-1 בפאנל NK ו-PD-L1 בלוח הליגנד. לבסוף, שיטה זו אינה מתאימה לשימוש בדגימות קבועות, בהתחשב בכך שרוב האפיטופים של סמני תאי NK מושפעים מקיבוע.

לפרוטוקול המתואר כאן יתרונות משמעותיים בהשוואה לשיטות אחרות. קבוצות אחרות תיארו פאנלים של זרימה ציטומטרית שמטרתם לחקור תאי NK 3,4,5,6,7,8,23. בהשוואה לזרימה ציטומטרית, השימוש ב-CyTOF מבטל בעיות הקשורות לפיצוי פלואורופור, ומאפשר זיהוי בו זמנית של מספר גבוה של סמנים. למרות שאחרים פיתחו גם לוחות CyTOF לחקר תאי NK 9,10,11,12,13,14, כאן אנו מתארים את השימוש בשני לוחות CyTOF משלימים, החוקרים את הביטוי של קולטני תאי NK והליגנדים שלהם, ובכך מספקים תמונה מפורטת יותר של תפקוד תאי NK.

הקבוצה שלנו השתמשה בפרוטוקול זה ובאחד מהפאנלים הללו או בשניהם כדי לאפיין את תגובת תאי ה-NK האנושיים בתורמים בריאים, ובמגוון מצבי מחלה כולל זיהום HIV וזיהום בנגיף דנגי 24,25,26,27,28. למרות שהם תוכננו למטרת חקר זיהומים נגיפיים, לוחות אלה מתאימים לחקר תאי NK במצבים אחרים בהתחשב בנשימת החלבונים שהם מכסים. למעשה, הקבוצה שלנו השתמשה בפאנלים אלה גם כדי לאפיין את רפרטואר הקולטן-ליגנד של תאי NK בחולים עם חסר חיסוני וטרשת נפוצה 25,27,29,30, כמו גם בעכברים אנושיים ^31,32. ככזה, ניתן להרחיב את השימוש בפאנלים אלה להקשרים אחרים. לדוגמה, קולטנים רבים של תאי NK וליגנדים קוגנטיים המעורבים בהגדרת סרטן כלולים בפאנלים אלה, מה שהופך את הפאנלים הללו לכלים מצוינים למחקרים עתידיים על תפקידם של תאי NK בתגובה האנטי-גידולית. באופן רחב יותר, ניתן ליישם את הפרוטוקול שלנו לייצור ואחסון המוני של לוחות CyTOF כמו גם עיבוד מקביל של דגימות לביצוע ויישום של כל פאנל CyTOF.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לכל החברים הנוכחיים והקודמים במעבדת בליש שתרמו לפאנל זה. תודה לקבוצת הניסויים הקליניים של איידס ולצוות ACTG A5321 וכן לד"ר סנדרה לופז-ורג'ס ודייוויס בלטראן במכון גורגס למחקרי בריאות על אוצרות הדגימות. לבסוף, תודה למייקל לייפולד, הולדן מאקר והמרכז לניטור חיסוני אנושי בסטנפורד על השימוש במכונות הליוס שלהם. עבודה זו נתמכה על ידי NIH U19AI057229, NIH R21 AI135287, NIH R21 AI130532, NIH DP1 DA046089, וחוקרי קרן בורוז וולקאם בפתוגנזה של מחלות זיהומיות #1016687 ל-CB, NIH Ruth L. Kirschstein Institutional National Research Service Award T32 AI007502, TL1 TR001084 ו-NIH/NIAID K08 AI138640 ל-EV, מלגת מחקר לתארים מתקדמים של הקרן הלאומית למדע DGE-1656518 למענק הכשרה של JM ו-NIH T32-AI-007290 (PI אוליביה מרטינז). מחקר ACTG קיבל תמיכה במענקים מ-AI-68634 (מרכז סטטיסטיקה וניהול נתונים), UM1-A1-26617, AI-131798 ו-AI-68636 (ACTG). CB הוא חוקר הפקולטה לרפואה תרגומית לילדים ע"ש טאשיה וג'ון מורגרידג' ממכון המחקר לבריאות האם והילד בסטנפורד וחוקר של Chan Zuckerberg Biohub.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
⁸⁹Y	Sigma-Aldrich	204919
102-Palladium nitrate	Trace Sciences International	Special Order
104-Palladium nitrate	Trace Sciences International	Special Order
106-Palladium nitrate	Trace Sciences International	Special Order
108-Palladium nitrate	Trace Sciences International	Special Order
¹¹⁵In	Trace Sciences International	Special Order
¹⁴¹Pr	Fluidigm	201141A
¹⁴²Nd	Fluidigm	201142A
¹⁴³Nd	Fluidigm	201143A
¹⁴⁴Nd	Fluidigm	201144A
¹⁴⁵Nd	Fluidigm	201145A
¹⁴⁶Nd	Fluidigm	201146A
¹⁴⁷Sm	Fluidigm	201147A
¹⁴⁸Nd	Fluidigm	201148A
¹⁴⁹Sm	Fluidigm	201149A
¹⁵⁰Nd	Fluidigm	201150A
¹⁵¹Eu	Fluidigm	201151A
¹⁵²Sm	Fluidigm	201152A
¹⁵³Eu	Fluidigm	201153A
¹⁵⁴Sm	Fluidigm	201154A
¹⁵⁵Gd	Fluidigm	201155A
¹⁵⁶Gd	Fluidigm	201156A
¹⁵⁷Gd	Trace Sciences International	N/A
¹⁵⁸Gd	Fluidigm	201158A
¹⁵⁹Tb	Fluidigm	201159A
¹⁶⁰Gd	Fluidigm	201160A
¹⁶¹Dy	Fluidigm	201161A
¹⁶²Dy	Fluidigm	201162A
¹⁶³Dy	Fluidigm	201163A
¹⁶⁴Dy	Fluidigm	201164A
¹⁶⁵Ho	Fluidigm	201165A
¹⁶⁶Er	Fluidigm	201166A
¹⁶⁷Er	Fluidigm	201167A
¹⁶⁸Er	Fluidigm	201168A
¹⁶⁹Tm	Fluidigm	201169A
¹⁷⁰Er	Fluidigm	201170A
¹⁷¹Yb	Fluidigm	201171A
¹⁷²Yb	Fluidigm	201172A
¹⁷³Yb	Fluidigm	201173A
¹⁷⁴Yb	Fluidigm	201174A
¹⁷⁵Lu	Fluidigm	201175A
¹⁷⁶Yb	Fluidigm	201176A
²⁰⁹Bi anti-CD16	Fluidigm	3209002B	Clone 3G8. Used at a 1:50 dilution.
697 cells	Creative Bioarray	CSC-C0217
Amicon Ultra Centrifugal Filter Units 0.5 with Ultracel-30 Membrane, 30 kDa	Millipore	UFC503096
Anhydrous acetonitrile	Fisher Scientific	BP1165-50
anti-2B4	Biolegend	329502	Clone C1.7.
anti-B7-H6	R&D Systems	MAB7144	Clone 875001.
anti-CCR2	Biolegend	357202	Clone K036C2.
anti-CD2	Biolegend	300202	Clone RPA-2.10.
anti-CD3	Biolegend	300402	Clone UCHT1.
anti-CD4	Biolegend	317402	Clone OKT4.
anti-CD4	Biolegend	344602	Clone SK3.
anti-CD7	Biolegend	343102	Clone CD7-6B7.
anti-CD8	Biolegend	344702	Clone SK1.
anti-CD11b	Biolegend	301302	Clone ICRF44.
anti-CD14	Biolegend	301802	Clone M5E2.
anti-CD19	Biolegend	302202	Clone HIB19.
anti-CD33	Biolegend	303402	Clone WM53.
anti-CD38	Biolegend	303502	Clone HIT2.
anti-CD48	Biolegend	336702	Clone BJ40.
anti-CD56	BD Pharmingen	559043	Clone NCAM16.2.
anti-CD57	Biolegend	322302	Clone HCD57.
anti-CD62L	Biolegend	304802	Clone DREG-56.
anti-CD69	Biolegend	310902	Clone FN50.
anti-CD94	Biolegend	305502	Clone DX22.
anti-CD95	Biolegend	305602	Clone DX2.
anti-CD155	Biolegend	337602	Clone SKII.4.
anti-CXCR6	Biolegend	356002	Clone K041E5.
anti-DNAM-1	BD Biosciences	559787	Clone DX11.
anti-DR4	Biolegend	307202	Clone DJR1.
anti-DR5	Biolegend	307302	Clone DJR2-2.
anti-FAS-L	Biolegend	306402	Clone NOK-1.
anti-FcRg	Millipore	06-727	Polyclonal antibody.
anti-HLA-C,E	Millipore	MABF233	Clone DT9.
anti-HLA-Bw4	Miltenyi Biotec	Special Order	Clone REA274.
anti-HLA-Bw6	Miltenyi Biotec	130-124-530	Clone REA143.
anti-HLA-DR	Biolegend	307602	Clone L243.
anti-HLA-E	Biolegend	342602	Clone 3D12.
anti-ICAM-1	Biolegend	353102	Clone HA58.
anti-Ki-67	Biolegend	350502	Clone Ki-67.
anti-KIR2DL1/KIR2DS5	R&D Systems	MAB1844	Clone 143211.
anti-KIR2DL3	R&D Systems	MAB2014	Clone 180701.
anti-KIR2DL5	Miltenyi Biotec	130-096-200	Clone UP-R1.
anti-KIR2DS4	R&D Systems	MAB1847	Clone 179315.
anti-KIR3DL1	BD Biosciences	555964	Clone DX-9.
anti-LFA-3	Biolegend	330902	Clone TS2/9.
anti-LILRB1	R&D Systems	292319	Clone MAB20172.
anti-LLT-1	R&D Systems	AF3480	Clone 402659.
anti-MICA	R&D Systems	MAB1300-100	Clone 159227.
anti-MICB	R&D Systems	MAB1599-100	Clone 236511.
anti-Nectin-1	Biolegend	340402	Clone R1.302.
anti-Nectin-2	Biolegend	337402	Clone TX31.
anti-NKG2A	R&D Systems	MAB1059	Clone 131411.
anti-NKG2C	R&D Systems	MAB1381	Clone 134522.
anti-NKG2D	Biolegend	320802	Clone 1D11.
anti-NKp30	Biolegend	325202	Clone P30-15.
anti-NKp44	Biolegend	325102	Clone P44-8.
anti-NKp46	Biolegend	331902	Clone 9E2.
anti-NTB-A	Biolegend	317202	Clone NT-7.
anti-Pan HLA class I	Biolegend	311402	Clone W6/32.
anti-PD1	Biolegend	329902	Clone EH12.2H7.
anti-Perforin	Abcam	ab47225	Clone B-D48.
anti-Siglec-7	Biolegend	347702	Clone S7.7.
anti-Syk	Biolegend	644302	Clone 4D10.2.
anti-TACTILE	Biolegend	338402	Clone NK92.39.
anti-TIGIT	R&D Systems	MAB7898	Clone 741182.
anti-ULBP-1	R&D Systems	MAB1380-100	Clone 170818.
anti-ULBP-2, 5, 6	R&D Systems	MAB1298-100	Clone 165903.
Antibody Stabilizer	Candor Bioscience	131 050
Benzonase Nuclease	Millipore	70664
Bond-Breaker TCEP Solution	Thermo Fisher Scientific	77720
Bovine Serum Albumin solution	Sigma-Aldrich	A9576
Calcium chloride dihydrate (CaCl₂+2H₂O)	Sigma-Aldrich	223506-25G
Cis-Platinum(II)diamine dichloride (cisplatin)	Enzo Life Sciences	ALX-400-040-M250	A 100 mM stock solution was prepared in DMSO and divided into 25 µL aliquots. Used at a 25 µM dilution for live/dead stain. Signal appears in 194Pt and 195Pt channels.
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
eBioscience Permeabilization Buffer	Thermo Fisher Scientific	00-8333-56
EDTA (0.5 M)	Hoefer	GR123-100	A double-concentrated HEPES buffer with EDTA was made according to the following recipe: 1.3 g NaCl (Thermo Fisher Scientific), 27 mg CaCl₂+2H₂O (Sigma-Aldrich), 23 mg MgCl₂ (Sigma-Aldrich), 83.6 mg KH₂PO₄ (Thermo Fisher Scientific), 4 mL of 1M HEPES (Thermo Fisher Scientific), 2 mL of 0.5M EDTA (Hoefer, Holliston, MA, USA), and 100mL H₂O. The pH of this double-concentrated HEPES buffer was adjusted to a pH of 7.3 using 1M HCl and 1M NaOH.
EQ Four Element Calibration Beads	Fluidigm	201078
Fetal Bovine Serum	Thermo Fisher Scientific	N/A
Helios mass cytometer	Fluidigm	N/A
HEPES (1M)	Thermo Fisher Scientific	15630080
HyClone Antibiotic/Antimycotic Solution (Pen/Strep/Fungiezone) solution	Fisher Scientific	SV3007901
Iridium - 191Ir/193Ir intercalator	DVS Sciences (Fluidigm)	201192B	Used at a 1:10000 dilution.
Isothiocyanobenzyl-EDTA (ITCB-EDTA)	Dojindo Molecular Technologies, Inc.	M030-10	Diluted to 1.25 mg/mL in anhydrous acetonitrile.
K562 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC CCL-243
L-Glutamine (200 mM)	Thermo Fisher Scientific	SH30034
Magnesium chloride (MgCl₂)	Sigma-Aldrich	208337-100G
Maxpar X8 Antibody Labeling Kits	Fluidigm	N/A	No catalog number as kits come with metals.
Millex-VV Syringe Filter Unit, 0.1 µm	Millipore	SLVV033RS
Milli-Q Advantage A10 Water Purification System	Millipore	Z00Q0V0WW
MS Columns	Miltenyi Biotec
NALM6 cells	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC CRL-3273
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 3K	Pall Corporation	OD003C35
NK Cell Isolation Kit, human	Miltenyi Biotec	130-092-657
Paraformaldehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15710
PBS	Thermo Fisher Scientific	10010023
Potassium Phosphate Monobasic (KH₂PO₄)	Fisher Scientific	MP021954531
Qdot 655 anti-CD19	Thermo Fisher Scientific	Q10179	Clone SJ25-C1. Used at a 1:50 dilution. Signal appears in 112Cd-114Cd channels.
Qdot 655 anti-HLA-DR	Thermo Fisher Scientific	Q22158	Clone Tü36. Used at a 1:200 dilution.
Rockland PBS	Rockland Immunochemicals, Inc.	MB-008	Used to make CyPBS (10X Rockland PBS diluted to 1X in Milli-Q water) and CyFACS buffers (10X Rockland PBS diluted to 1X in Milli-Q water with 0.1% BSA and 0.05% sodium azide). Buffers were sterile-filtered through a 0.22 µM filter and sotred at 4°C in Stericup bottles.
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific	21870092
Sodium azide (NaN₃)	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride (NaCl)	Fisher Scientific	S271-500
Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System	Millipore Sigma	S2GPU10RE
Tuning solution	Fluidigm	201072
Washing solution	Fluidigm	201070

References

Shimasaki, N., Jain, A., Campana, D. NK cells for cancer immunotherapy. Nature Reviews. Drug Discovery. 19 (3), 200-218 (2020).
Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S. Functions of natural killer cells. Nature Immunology. 9 (5), 503-510 (2008).
Eller, M. A., Currier, J. R. OMIP-007: phenotypic analysis of human natural killer cells. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (6), 447-449 (2012).
Mahnke, Y. D., Beddall, M. H., Roederer, M. OMIP-029: Human NK-cell phenotypization. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 87 (11), 986-988 (2015).
Hammer, Q., Romagnani, C. OMIP-039: Detection and analysis of human adaptive NKG2C + natural killer cells : Detection of Human Adaptive NKG2C + NK Cells. Cytometry. 91 (10), 997-1000 (2017).
Liechti, T., Roederer, M. OMIP-058: 30-Parameter flow cytometry panel to characterize iNKT, NK, unconventional and conventional T cells. Cytometry. 95 (9), 946-951 (2019).
Béziat, V., et al. NK cell responses to cytomegalovirus infection lead to stable imprints in the human KIR repertoire and involve activating KIRs. Blood. 121 (14), 2678-2688 (2013).
Pfefferle, A., et al. Intra-lineage plasticity and functional reprogramming maintain natural killer cell repertoire diversity. Cell Reports. 29 (8), 2284-2294 (2019).
Barcenilla, H., Åkerman, L., Pihl, M., Ludvigsson, J., Casas, R. Mass cytometry identifies distinct subsets of regulatory T cells and Natural killer cells associated with high risk for Type 1 diabetes. Frontiers in Immunology. 10, 982(2019).
Kurioka, A., et al. CD161 defines a functionally distinct subset of pro-inflammatory Natural killer cells. Frontiers in Immunology. 9, 486(2018).
Romee, R., et al. Cytokine-induced memory-like natural killer cells exhibit enhanced responses against myeloid leukemia. Science Translational Medicine. 8 (357), (2016).
Shinko, D., et al. Mass cytometry reveals a sustained reduction in CD16+ Natural killer cells following chemotherapy in colorectal cancer patients. Frontiers in Immunology. 10, 2584(2019).
Pohlmeyer, C. W., et al. Identification of NK cell subpopulations that differentiate HIV-infected subject cohorts with diverse levels of virus control. Journal of Virology. 93 (7), 01790(2019).
Palgen, J. -L., et al. NK cell immune responses differ after prime and boost vaccination. Journal of Leukocyte Biology. 105 (5), 1055-1073 (2019).
Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. The Journal of Immunology. 194 (4), 2022-2031 (2015).
Takahashi, C., et al. Mass cytometry panel optimization through the designed distribution of signal interference. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 39-47 (2017).
Baumgart, S., Peddinghaus, A., Schulte-Wrede, U., Mei, H. E., Grützkau, A. OMIP-034: Comprehensive immune phenotyping of human peripheral leukocytes by mass cytometry for monitoring immunomodulatory therapies. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 91 (1), 34-38 (2017).
Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 87 (5), 380-382 (2015).
Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
Leipold, M. D., Newell, E. W., Maecker, H. T. Multiparameter phenotyping of human PBMCs using mass cytometry. Methods in Molecular Biology. 1343, 81-95 (2015).
Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry. Part A: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 81 (6), 467-475 (2012).
Zivanovic, N., Jacobs, A., Bodenmiller, B. A practical guide to multiplexed mass cytometry. Current Topics in Microbiology and Immunology. 377, 95-109 (2014).
Béziat, V., Hilton, H. G., Norman, P. J., Traherne, J. A. Deciphering the killer-cell immunoglobulin-like receptor system at super-resolution for natural killer and T-cell biology. Immunology. 150 (3), 248-264 (2017).
Wilk, A. J., et al. Charge-altering releasable transporters enable specific phenotypic manipulation of resting primary natural killer cells. BioRxiv. , 970491(2020).
Vendrame, E., et al. TIGIT is upregulated by HIV-1 infection and marks a highly functional adaptive and mature subset of natural killer cells. AIDS. 34 (6), 801-813 (2020).
Zhao, N. Q., et al. Natural killer cell phenotype is altered in HIV-exposed seronegative women. PloS One. 15 (9), 0238347(2020).
McKechnie, J. L., et al. HLA upregulation during dengue virus infection suppresses the natural killer cell response. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 9, 268(2019).
McKechnie, J. L., et al. Mass cytometry analysis of the NK cell receptor-ligand repertoire reveals unique differences between dengue-infected children and adults. ImmunoHorizons. 4 (10), 634-647 (2020).
Ranganath, T., et al. Characterization of the impact of daclizumab beta on circulating natural killer cells by mass cytometry. Frontiers in immunology. 11, 714(2020).
Fernandez, I. Z., et al. A novel human IL2RB mutation results in T and NK cell--driven immune dysregulation. The Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1255-1267 (2019).
Herndler-Brandstetter, D., et al. Humanized mouse model supports development, function, and tissue residency of human natural killer cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (45), 9626-9634 (2017).
Nikzad, R., et al. Human natural killer cells mediate adaptive immunity to viral antigens. Science Immunology. 4 (35), (2019).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

NK CyTOF HIV

This article has been published

Video Coming Soon

Keep me updated: