Dysfunktion des Locus coeruleus wurde in neurologische und neuropsychiatrische Störungen verwickelt, einschließlich Parkinson-Krankheit, Alzheimer-Krankheit, Depression, bipolare Störung, und Angst. Angesichts dieser Rollen ist die Analyse von locus coeruleus entscheidend für die Untersuchung seiner Funktion und Dysfunktion. Während der Maus-Gehirn-Sektion, der Locus coeruleus kann leicht in koronalen oder sagittalen Abschnitten aufgrund seiner geringen Größe verpasst werden.
Um Anleitungen für die Lokalisierung von locus coeruleus zu bieten, beschreiben wir ein Protokoll, das wir entwickelt haben, um diese Region im Maushirn für mehrere Anwendungen zu lokalisieren. Beginnen Sie damit, frisch isoliertes Gehirn einer anästhesierten und dann perfundierten Maus in 4%PFA in einer 50-Milliliter-Röhre zu platzieren. Inkubieren Sie das Gehirn für 24 Stunden bei vier Grad Celsius.
Verwenden Sie Zangen, um das Gehirn in ein 50-Milliliter konisches Rohr zu übertragen, das mit 25 Millilitern 30%Saccharoselösung gefüllt ist. Inkubieren Sie es bei vier Grad Celsius für 48 bis 72 Stunden, bis das Gehirn auf den Boden der Röhre sinkt. Um den Hirnstammabschnitt einzubetten, legen Sie seine schnittoberfläche auf den Boden einer Einbettform, und fügen Sie eine optimale Schnitttemperaturverbindung hinzu, um den Hirnstamm zu umgeben.
Einfrieren Des eingebetteten Gehirns in einem Gefrierschrank von minus 80 Grad Celsius für mindestens 12 Stunden bis zur weiteren Verwendung einfrieren. Legen Sie die Form mit dem Gehirn in den Kryostat und inkubieren Sie es für mehrere Stunden, um seine Temperatur an die des Kryostats anzupassen. Um den OCT-Block mit dem Gehirn freizulegen, verwenden Sie eine Rasierklinge, um die vier Kanten der Form bis zum Boden zu schneiden, und schälen Sie dann die Einbettform davon.
Verwenden Sie Rasierklingen, um überschüssiges OCT von der Oberfläche des Blocks zu entfernen, um sicherzustellen, dass das Gehirn nicht berührt wird. Dann montieren Sie den OCT-Block auf dem Spannfutter des Kryostats und legen Sie die schnittige Oberfläche des Gehirns nach vorne frei. Um das Gehirn anzupassen, orientieren Sie die schnittoberfläche parallel zu den Rasierklingen des Kryostats.
Die richtige Ausrichtung der Probe ist ein entscheidender Schritt in diesem Protokoll. Da wir anatomische Merkmale der dorsalen Oberfläche des Gehirns verwenden, um LC zu lokalisieren, wie z. B. die Grenze zwischen Kleinhirn und minderwertigem Colliculus, ist es wichtig, dass die Abschnitte richtig ausgerichtet werden. Dies erfordert Sorgfalt bei der richtigen Einstellung des Gehirns in die Maus Gehirn Slicer Matrix.
Schneiden Sie das Gehirn beginnend an der Medulla, schneiden 100-Mikrometer-Abschnitte rostral. Sobald das Kleinhirn und der Hirnstamm beginnen, als eine kontinuierliche Scheibe auf der Ebene des vierten Ventrikels zu schneiden, beginnen Sie, Scheiben mit 50 Mikrometer Dicke zu sammeln. Verwenden Sie Zangen, um jede Gehirnscheibe zu sammeln und legen Sie es in einem Brunnen einer 24-Well-Platte mit PBS gefüllt.
Der Locus coeruleus wird am deutlichsten in einer Scheibe, wo das Kleinhirn und minderwertige Colliculus einander bei etwa 5,52 Millimeter hinter dem Bregma treffen. Am ersten Tag die Gehirnscheiben in der 24-Well-Platte dreimal für jeweils fünf Minuten in PBS waschen. Dann 0,5%PBS mit Waschmittel hinzufügen und sie bei vier Grad Celsius für 24 Stunden durchpermeabilisieren.
Am nächsten Tag die Scheiben dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,5%PBSD waschen. Fügen Sie dann den primären Antikörper bei einer Verdünnung von ein bis 500 in 0,5% PBSD hinzu und brüten bei vier Grad Celsius für 18 Stunden. Am dritten Tag die Scheiben dreimal für jeweils 10 Minuten mit 0,5%PBSD waschen und dann den sekundären Antikörper bei einer Verdünnung von eins bis 1000 in 0,5% PBSD hinzufügen.
Die Platte mit Aluminiumfolie umwickeln und 16 Stunden bei vier Grad Celsius bebrüten. Nach der Inkubation die Scheiben dreimal für jeweils fünf Minuten mit 0,5%PBSD und dann fünf Minuten in PBS waschen. Bedecken Sie die Abschnitte mit fest gesetztem Montagemedium ohne DAPI.
Mit einer Glasabdeckung abdecken und 30 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Verwenden Sie dann ein konfokales Mikroskop mit Einstellungen, um Signal von der entsprechenden Fluoreszenzwellenlänge zu Bildhirnscheiben zu erkennen. Nachdem Sie das Mikroskop an die Brennebene der Hirnscheibe angepasst haben, verwenden Sie die 10-fache Vergrößerung, um ein einzelnes Bild aufzunehmen.
Verwenden Sie die vierte Herzkammer unterhalb des Kleinhirns und über Pons und Hirnstamm, um eine mögliche LC-Region in der Gehirnscheibe zu lokalisieren. Konzentrieren Sie sich auf die seitlichen Ränder des vierten Ventrikels und der LC wird von den Rändern des vierten Ventrikels aus in Richtung der Pons Brainstem Region platziert werden. Die intrazelluläre Verteilung von Dopamin-Beta-Hydroxylase, einem im LC exprimierten Protein, wurde mit diesem Protokoll untersucht, um die LC-Morphologie und die neuronale Dichte zu untersuchen.
Ein weiteres Protein, das in der LC exprimiert wurde, Tyrosinhydroxylase, zeigte ebenfalls ein starkes grünes Fluoreszenzsignal in Hirnscheiben, die den LC enthalten. Veränderungen der Metallhomöostase werden häufig bei neurologischen Störungen beobachtet, einschließlich Veränderungen in der LC.In diesem Beispiel, wenn eine durch den LC geschnittene Hirnscheibe für Phosphat, Kalium, Zink und Kupfer gemessen wurde, nur Kupfer zeigte eine spezifische Erhöhung des Signals. Wir empfehlen, etwa 500 Mikron mehr Gewebe vor und hinter lc zu schneiden, um zu vermeiden, dass der Kern fehlt, und mehr Abschnitte als nötig zu schneiden, vor allem, wenn dieses Protokoll zum ersten Mal durchgeführt wird. Sorgfältige Untersuchung der Gehirnatlas-Bilder vor der Färbung ist sehr hilfreich.
Sobald LC durch Immunhistochemie lokalisiert ist, können benachbarte Gehirnscheiben für weitere Studien verwendet werden, einschließlich morphologischer und metabolischer Analysen, sowie Metallbildgebungsstudien mittels Röntgenfluoreszenzmikroskopie. Die mit dem beschriebenen Protokoll erzeugten Hirnabschnitte können verwendet werden, um den Kupfergehalt und andere Metalle im LC zu quantifizieren und mit den Werten in Regionen außerhalb des LC zu vergleichen, was für das Verständnis des Krankheitsmechanismus erforderlich ist. Weitere mögliche Anwendungen dieses Protokolls sind der Nachweis von Häufigkeit und intrazellulärer Verteilung von Dopamin-Beta-Hydroxylase, Tyrosin-Hydroxylase und anderen Proteinen, die im LC einzeln oder in den Co-Staining-Assays, Studien der LC-Morphologie und der neuronalen Dichte exprimiert werden.
