Wir danken für ihre Beratung auf die AbScale Experimente, Charles Yokoyama zur Bearbeitung des Manuskripts, Atsushi Miyawaki und Hiroshi Hama Eriko Ohshima und Miyuki Kishino für ihre technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von Forschungsgeldern aus RIKEN, t.h. und Grants-in-Aid für die wissenschaftliche Forschung vom Bundesministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (MEXT) von Japan, t.h. unterstützt (Innovative Bereiche "Mesoskopischen Neurocircuitry"; 22115004) und S.S. (25890023).

Alle experimentelle Verfahren wurde vom RIKEN Wako Animal Experimente Committee und RIKEN genetische rekombinante Experiment Safety Committee genehmigt und durchgeführt nach den institutionellen Richtlinien der Tierhaltung des RIKEN Brain Science Institut.
1. Vorbereitung von Imaging-Kammern
<ol><li>
Imaging-Kammer19
	<ol>
<li>Mit Silikon-Beläge, bereiten Sie eine Kammer mit einer Dicke von ca. 5 mm und Boden Platten in verschiedenen stärken. Darüber hinaus bereiten Sie Petrischalen mit und ohne einem Glasboden (Abbildung 1A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Slice-Abstandhalter
	<ol>
<li>Bereiten Sie Abstandhalter für Samples, mit Silikon-Beläge mit einer Dicke von 0,5 mm (Abbildung 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Tracer Injektion
Hinweis: Stellen Sie Injektionen in der Pons (2.1) oder superior Colliculus (2.2). Injektion in den Pons Label Sub zerebralen Projektion Neuronen in einem breiten Hirnregion einschließlich der visuellen und motorischen Bereiche während der Injektion in die superior Colliculus Labels Sub zerebralen Projektion Neuronen im visuellen Bereich. Injizieren Sie für Experimente Kochsalzlösung statt eindringmittel beschriftet Cholera Toxin Untereinheit B. Verwenden Sie für die Wartung von sterilem Zustand sterilisierte Geräte und Plastikhandschuhe mit Ethanol gereinigt.
<ol><li>
Machen Sie Injektionen in der Pons Erwachsener Mäuse.
	<ol>
<li>1 µL eindringmittel beschriftet Cholera Toxin Untereinheit B zu zeichnen (25 µg/µL mit PBS-Puffer) in eine 26 G Hamilton-Spritze.</li>
		<li>Legen Sie eine Einspritzpumpe auf die Spritze.</li>
		<li>Legen Sie die Spritze und Pumpe auf dem Werkzeugträger eines Manipulator, platziert auf einem stereotaktischen Instrument. Kippen Sie den Manipulator 12° nach hinten aus der vertikalen Achse.</li>
		<li>Betäuben Sie eine männliche oder weibliche Erwachsene Maus (C57BL/6J oder Tlx3-Cre/Ai9) durch die intraperitoneale Injektion von Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht) oder durch die Gabe von Isofluran (2 – 3 %). Warten Sie, bis die Maus macht keine Antwort, wenn seine Rute eingeklemmt ist, mit der Pinzette, darauf hinweist, dass die Maus vollständig betäubt ist.</li>
		<li>Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem stereotaktischen Instrument.</li>
		<li>Entfernen Sie vorsichtig die Haare mit einer Rasierklinge um Infektionen zu verhindern und 10 mm von der Kopfhaut zu schneiden, so dass die Bregma und Lambda sichtbar sind. Verabreichen Sie 0,1 mL von 1 % Lidocain mit einer Pipette. Legen Sie den Winkel des Kopfes, die vertikale Position des Mundstücks auf dem stereotaktischen Instrument so angepasst, dass die Bregma und Lambda die gleichen Z-Ebene haben.</li>
		<li>Passen Sie die Position des Manipulators am stereotaktischen Gerät schieben, so dass die Spitze der Spritze in der Nähe der Bregma und zeichnen Sie die Position des Manipulators. Ziehen Sie die Spritze durch Verschieben der Werkzeughalter auf dem Manipulator.</li>
		<li>Verschieben den Manipulator 5,4 mm nach hinten und 0,4 mm seitlich. Voraus die Spritze, so dass die Spitze in der Nähe der Einstiegspunkt auf dem Schädel ist. Ziehen Sie die Spritze und markieren Sie den Eintrittspunkt.</li>
		<li>Bohren Sie an der markierten Stelle ein Loch mit einem Durchmesser von ca. 1 mm.</li>
		<li>Legen Sie die Spitze der Spritze durch das Loch, so dass die Spitze Tiefe 6,9 mm ist mehr als, dass bei der Bregma gemessen.</li>
		<li>1 µL Tracer mit der Pumpe bei 0,2 µL/min zu injizieren.</li>
		<li>Ziehen Sie die Spritze aus dem Gehirn.</li>
		<li>Bei Bedarf decken Sie die exponierten Gehirn mit kleine Fragmente von mikrofibrillären Gefäßklemme und Sekundenkleber.</li>
		<li>Spülen Sie die exponierten Gehirn mit Kochsalzlösung mit einer Pipette geliefert um Infektionen zu verhindern und die Kopfhaut Naht.</li>
		<li>Entfernen Sie die Maus aus dem stereotaktischen Gerät. Lassen Sie die Maus wieder aus der Narkose in einem Inkubator bei 30 ° c, in der Regel für 1 h. Nicht unbeaufsichtigt lassen die Maus bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Zurückzugeben Sie die Maus an die Gesellschaft anderer Tiere, nachdem es vollständig erholt hat.</li>
		<li>Halten Sie die Maus für 3 – 7 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Machen Sie Injektionen in den superior Colliculus Erwachsener Mäuse.
	<ol>
<li>Bereiten Sie eine Glaspipette mit einem Durchmesser von 30 – 50 µm.</li>
		<li>Verbinden Sie die Glaspipette mit einer Hamilton-Spritze durch ein Kunststoffrohr (Abbildung 2A).</li>
		<li>Füllen Sie die Glaspipette, Kunststoffrohr und Hamilton Spritze mit Paraffin Flüssigkeit.</li>
		<li>Legen Sie eine Einspritzpumpe auf die Spritze.</li>
		<li>Der Manipulator der Glaspipette aufsetzen und Kippen des Manipulators 60° nach hinten aus der vertikalen Achse (Abb. 2 b).</li>
		<li>Führen Sie 2.1.4–2.1.9. Die Position des Manipulators ist 1,4 mm posterior, 0,5 mm seitlich an den Lambda-Ausdruck.</li>
		<li>Legen Sie einen kleine Kunststoff-Paraffin-Film auf den Schädel, dann setzen Sie ca. 1 µL Tracer Lösung auf. Schnell die Glaspipette voraus und füllen Sie ihn mit mindestens 0,5 µL Tracer-Lösung.</li>
		<li>Fügen Sie die Glaspipette, sodass die Spitze Tiefe 3,0 mm von der Oberfläche des Gehirns ist.</li>
		<li>0,5 µL Tracer mit der Pumpe bei 0,2 µL/min zu injizieren.</li>
		<li>Die Glaspipette aus dem Gehirn zu entfernen.</li>
		<li>Führen Sie 2.1.13–2.1.16.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) Fixierung und trimmen
<ol><li>Verleihen Sie Natrium-Pentobarbital (60 mg/kg Körpergewicht) intraperitoneal eine Maus (C57BL/6J oder Tlx3-Cre/Ai9, mit oder ohne die Tracer-Injektion wie in Schritt 2 beschrieben. Warten Sie, bis die Maus macht keine Antwort, wenn seine Rute eingeklemmt ist, mit der Pinzette, darauf hinweist, dass die Maus vollständig betäubt ist.</li>
	<li>Einschläfern der Maus menschlich von Vorrichtung die Maus Transcardially20 mit 0,9 % Kochsalzlösung.</li>
	<li>Fix die Maus20 durch Vorrichtung 4 % Paraformaldehyd (PFA) in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5).</li>
	<li>
Schneiden Sie die Kopfhaut mit einer Schere, um den Schädel wie beschrieben20verfügbar zu machen.
	<ol>
<li>Schneiden Sie die Mittellinie des freigelegten Schädel mit einer Schere. Entfernen Sie den Schädel mit Pinzette.</li>
		<li>Wenn markiert die Position des Bregma und Lambda notwendig ist, entfernen Sie zunächst eine Hemisphäre des Schädels. Legen Sie dünne Wolfram Nadeln in das Gehirn an den Stellen der Bregma und Lambda auf dem Schädel noch auf das Gehirn, dann entfernen Sie die restlichen Schädel. Hinweis: Das Gehirn kann mit PBS-Puffer bei 4 ° c gespeichert werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Um durchzuführen Antikörper Färbung der hemmenden Neuronen, schneiden Sie die Gehirn-Muster in Scheiben.
	<ol>
<li>Legen Sie die Gehirn-Probe auf einem Vibratome.</li>
		<li>Scheiben Sie bis zu 500 µm Dicke mit PBS-Puffer bei Raumtemperatur und fahren Sie mit Schritt 5 (AbScale-Methode).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenn Antikörper Färbung nicht erforderlich ist, trim zu Probe Gehirn blockiert (bis zu 3 mm dick) mit einer Rasierklinge (Abbildung 3) und fahren Sie mit Schritt 4 (SeeDB-Methode). Hinweis: Das Gehirn kann mit PBS-Puffer bei 4 ° C nach dem Schneiden oder Trimmen gespeichert werden. Die SeeDB-Methode ist vorzuziehen, wenn Antikörper Färbung nicht notwendig ist, denn es weniger Zeit als die AbSca-l-e-Methode erfordert.</li>
</ol>4. löschen ohne Antikörper Färbung (SeeDB Methode)
<ol><li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 20 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 40 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 60 % (w/V) Fruktose enthält und 4 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 80 % (w/V) Fruktose enthält und 12 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 100 % (w/V) Fruktose enthält und 12 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie die Probe mit einem Spatel, ein 50 mL-Kunststoff-Rohr, 20 mL 0,5 % α-Thioglycerol und 80,2 % (w/w) Fruktose enthält und 24 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren. Hinweis: Behandeln Sie die Probe sorgfältig, um Verformungen so gering wie möglich zu halten. Inkubieren Sie Proben länger als angegeben, nicht als Proben schnell undurchsichtig werden können.</li>
	<li>Betten Sie die Probe in einer bildgebenden Kammer gefüllt mit 80,2 % Fructose-Lösung (Abbildung 1 b). Gegebenenfalls zu beheben die Probe indem man kleine Stücke von Kautschukkleber um. Wenn die Kammer zu tief ist, legen Sie eine Bodenplatte in der Kammer vor den Proben.</li>
	<li>Die Petrischale mit einer Glasabdeckung auf der bildgebenden Kammer legen Sie und Wasser in die Schüssel und Bild eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit. Erregung Wellenlängen und Emission Filter sind in Tabelle 1beschrieben. Verwenden Sie ggf. eine motorisierte Bühne.</li>
</ol>(5) Clearing mit Antikörper Färbung (AbScale-Methode)
<ol><li>Bereiten Sie Reagenzien, wie in Tabelle 2beschrieben.</li>
	<li>Übertragen Sie die Scheiben mit einem Spatel zu einer 5 mL-Kunststoff-Rohr mit 4 mL des Sca/eS0 Lösung und inkubieren sie 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° C (Abbildung 4 b).</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL Sca/eA2 Lösung hinzugeben und die Scheiben für 36 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL Sca/eB4-Lösung und inkubieren die Scheiben für 24 h mit sanft schütteln bei 37 ° c</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL Sca/eA2 Lösung hinzugeben und die Scheiben für 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL PBS hinzu und inkubieren Sie die Scheiben für 6 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 2 mL-kunststofftube mit einem Spatel.</li>
	<li>Brüten Sie mit Primärantikörpern (Tabelle 3) in 1 mL AbScale Lösung für 48-72 h bei 37 ° C (Abbildung 4) mit sanft schütteln.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 5 mL-kunststofftube mit einem Spatel.</li>
	<li>Brüten Sie in 4 mL AbScale Lösung für 2 h 2 Mal bei Raumtemperatur mit sanft schütteln.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Scheiben auf einer 2 mL-kunststofftube mit einem Spatel.</li>
	<li>Inkubieren Sie mit fluoreszent-markierten Sekundärantikörper (Table of Materials, 1: 100) in 1 mL AbScale Lösung für 48 h bei 37 ° C mit sanft schütteln.</li>
	<li>Vorsichtig die Scheiben mit einem Spatel zu einer 5 mL-Kunststoff-Rohr mit 4 mL der AbScale Lösung zu entfernen und die Scheiben für 6 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL AbScale Lösung hinzugeben und die Scheiben für 2 h 2 Mal mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL 4 % PFA und die Scheiben für 1 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und fügen Sie 4 mL PBS hinzu und inkubieren Sie die Scheiben für 1 h mit sanft schütteln bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Entfernen Sie die Lösung aus dem Rohr mit einer Pipette und 4 mL der Sca/eS4 Lösung hinzufügen und die Scheiben für 12 h mit sanft schütteln bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Legen Sie das Distanzstück auf einen Glasobjektträger und legen Sie die Scheiben in der Abstandhalter und Tauchen Sie die Scheiben mit Sca/eS4 Lösung ein. Versiegeln Sie das Distanzstück mit einem Deckglas (Abbildung 1).</li>
	<li>Das Deckglas und Bild eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit setzen Sie Wasser auf. Verwenden Sie ggf. eine motorisierte Bühne. Hinweis: Überprüfen Sie, ob die tiefen Teile der Probe zu den oberflächlichen teilen, ohne eine deutliche Kennzeichnung Voreingenommenheit bestätigen ähnlich beschriftet werden. Hinweis: Die Durchdringung der getesteten Antikörper ist in Tabelle 3beschrieben.</li>
</ol>6. Zelle Positionsbestimmung
<ol><li>Berechnen Sie für jede Position in den gescannten Bildern Korrelationswerte mithilfe ein dreidimensionales Bild Filter14 (Abb. 5A-5D).</li>
	<li>Bestimmen der Gipfel der Korrelationswert (Abbildung 5).</li>
	<li>Untersuchen Sie Bilder rund um die Gipfel, Zellen (Abb. 5E) zu finden.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lein, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+atlas+of+gene+expression+in+the+adult+mouse+brain.">Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain.</a> Nature. 445 (7124), 168-176 (2007).</li><li>Defelipe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+classification+and+nomenclature+of+cortical+GABAergic+interneurons.">New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14 (3), 202-216 (2013).</li><li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+connectivity+among+morphologically+defined+cell+types+in+adult+neocortex.">Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex.</a> Science. 350 (6264), aac9462 (2015).</li><li>Sorensen, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlated+gene+expression+and+target+specificity+demonstrate+excitatory+projection+neuron+diversity.">Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity.</a> Cerebral Cortex. 25 (2), 433-449 (2015).</li><li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+structure.+Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq.">Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 347, 1138-1142 (2015).</li><li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics.">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (2), 335-346 (2016).</li><li>Zeng, H., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+cell-type+classification:+Challenges,+opportunities+and+the+path+forward.">Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (9), 530-546 (2017).</li><li>Horton, J. C., Adams, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cortical+column:+a+structure+without+a+function.">The cortical column: a structure without a function.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360 (1456), 837-862 (2005).</li><li>Costa, N. M., Martin, K. A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whose+cortical+column+would+that+be?.">Whose cortical column would that be?.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 4, (2010).</li><li>Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+subtype+specification+in+the+cerebral+cortex.">Neuronal subtype specification in the cerebral cortex.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 427-437 (2007).</li><li>Hioki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+type-specific+inhibitory+inputs+to+dendritic+and+somatic+compartments+of+parvalbumin-expressing+neocortical+interneuron.">Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron.</a> Journal of Neuroscience. 33 (2), 544-555 (2013).</li><li>Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periodic+organization+of+a+major+subtype+of+pyramidal+neurons+in+neocortical+layer+V.">Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V.</a> Journal of Neuroscience. 31 (50), 18522-18542 (2011).</li><li>Kwan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-dependent+posttranscriptional+regulation+of+NOS1+by+FMRP+in+the+developing+cerebral+cortex.">Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex.</a> Cell. 149 (4), 899-911 (2012).</li><li>Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lattice+system+of+functionally+distinct+cell+types+in+the+neocortex.">Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex.</a> Science. 358 (6363), 610-615 (2017).</li><li>Treweek, J. B., Gradinaru, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+structural+and+functional+features+of+widely+distributed+biological+circuits+with+single+cell+resolution+via+tissue+clearing+and+delivery+vectors.">Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors.</a> Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+Principles+in+Tissue+Clearing+and+Staining+Protocols+for+Whole-Body+Cell+Profiling.">Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), (2016).</li><li>Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GENSAT+BAC+cre-recombinase+driver+lines+to+study+the+functional+organization+of+cerebral+cortical+and+basal+ganglia+circuits.">GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits.</a> Neuron. 80 (6), 1368-1383 (2013).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ScaleS:+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging.">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+Animal+Perfusion+Fixation+for+Rodents.">Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).</li><li>Kim, S. -. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stochastic+electrotransport+selectively+enhances+the+transport+of+highly+electromobile+molecules.">Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (46), E6274-E6283 (2015).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems.">Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li><li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+mapping+of+neuronal+circuitry+with+an+index-optimized+clearing+agent.">Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent.</a> Cell Reports. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6, 18631 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+of+Brain+Activity+by+Automated+Volume+Analysis+of+Immediate+Early+Genes.">Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes.</a> Cell. 165 (7), 1789-1802 (2016).</li><li>Kubota, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+profiling+of+cancer+metastasis+with+single-cell+resolution.">Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution.</a> Cell Reports. 20 (1), 236-250 (2017).</li><li>Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex,+quantitative+cellular+analysis+in+large+tissue+volumes+with+clearing-enhanced+3D+microscopy+(Ce3D).">Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (35), E7321-E7330 (2017).</li><li>Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+of+acrylamide+sodium+dodecyl+sulphate+(SDS)-based+tissue+clearing+(FASTClear):+a+novel+protocol+of+tissue+clearing+for+three-dimensional+visualization+of+human+brain+tissues.">Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues.</a> Neuropathology and Applied Neurobiology. 43 (4), 346-351 (2017).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wir stellten Verfahren um großformatige dreidimensionale Bilder der Zelle Typ-spezifische Organisation der wichtigsten Zelltypen in Maus neokortikalen Schicht 5 zu erhalten. Im Vergleich zu herkömmlichen Slice Färbung, eignet sich die Methode bei der Bestimmung der dreidimensionalen Organisation des Neocortex. Die Methode ermöglicht die Bildaufnahme aus der breiteren und tieferen Hirnregionen im Vergleich zu den typischen in Vivo 2-Photonen-Mikroskopie oder konventionelle konfokale Mikroskopie und somit können die umfassende Analyse der neokortikalen Mobilfunk Organisation.
Ein wichtiger Schritt der Methode ist die Antikörper-Penetration. Eine Teilmenge von Antikörpern zeigt schlechte Penetration in dicken Proben (Tabelle 3) und daher nicht für die AbSca-l-e-Methode verwendet werden. Um einheitliche Kennzeichnung mit den in dieser Studie verwendeten Antikörper zu erhalten, war es notwendig, das Gehirn in 500 µm Scheiben schneiden. Die Verwendung von kleineren Antikörperfragmente, z. B. Fab oder F(ab') 2 Fragmente und/oder andere clearing Methoden21,22,23,24,25,26 27,28 kann zur Verbesserung der Ergebnisse.
Antikörper-Antigen-bindenen Besonderheit zeichnet sich in der Regel in dünne Gewebe Scheiben aber möglicherweise unterschiedlich Dicke Gewebe verarbeitet werden für das Clearing. Um Antikörperbesonderheit zu kontrollieren, wir gemeinsam mit der Bezeichnung Gewebe mit Tracer Injektion und Marker-gen-Expression bei transgenen Tieren und auch blockierende Experimente mit Antigen Proteine und Peptide14durchgeführt. Diese Verfahren und Experimente mit mutierten Tieren fehlt die Ziel-Antigene sollte für die Bestätigung der Spezifität von Antikörpern nützlich sein.
Eine Einschränkung der Methode ist, dass einige Verformung der Probe durch die Handhabung der weichen Mischproben unvermeidlich ist. In Vivo Bilder vor der Fixierung zu erhalten und diese Bilder zu verwenden, da Verweise hilft, um solche Verformungen zu korrigieren.
Die derzeitigen Verfahren wurden für die Analyse der neokortikalen Schicht 5 entwickelt. Aktuelle Analysen haben viele molekulare Marker identifiziert das Label neuronalen Zelltypen in anderen Schichten4,5,6,7, und die Anwendung dieser Hersteller auf das vorliegende Verfahren ermöglichen Kennung der wichtige zelluläre Organisation in anderen Schichten. Darüber hinaus sollte es möglich sein, ähnliche Analysen in den Gehirnregionen außer den Neocortex und in den Organen als das Gehirn zu untersuchen, ob eine präzise zelluläre Organisation ähnlich wie Microcolumns vorhanden ist.

Der Säugetier-Neocortex besteht aus eine Vielzahl von Zelltypen, die jeweils mit spezifischen gen Expressionsmuster, elektrophysiologische und biochemischen Eigenschaften, synaptischen Verbindungen und Funktionen in Vivo 1,2 ,3,4,5,6,7. Ob dieser Zelltypen in wiederholten Strukturen organisiert sind war ungeklärt. Kortikale Säulen, einschließlich visuelle Orientierung Spalten und somatosensorischen Fässer haben Strukturen wiederholt, aber ihre zelluläre Organisation bleibt unklar8,9. Diese sind in der kortikalen Bereiche und sind kein Gehirn-System.
In neokortikalen Schicht 5 sind die große Mehrheit der Neuronen in vier Haupttypen eingeteilt. Eine wichtige Art von exzitatorischen Neuronen, Sub-zerebrale Projektion Neuronen Axone, subkortikale Ziele einschließlich der Pons, Rückenmark und Colliculus superior-Projekte und stellt daher, die größeren kortikalen Ausgang Weg10. Kortikalen Projektion Neuronen, eine weitere wichtige Art von exzitatorischen Neuronen innervieren den Kortex-10. Hemmende Neuronen enthalten auch zwei Hauptgruppen: Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen11.
Jüngste Analysen deuten darauf hin, dass die vier Zelltypen in wiederholten Strukturen12,13,14organisiert sind. Sub-zerebrale Projektion Neuronen12,13,14 und kortikalen Projektion Neuronen14 organisieren in Zelltyp spezifische Microcolumns mit einem Durchmesser von 1 – 2 Zellen. Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen richten Sie speziell mit Microcolumns von Sub-zerebrale Projektion Neuronen, aber nicht mit Microcolumns von kortikalen Projektion Neuronen14. Microcolumns selbst ausrichten in regelmäßigen Abständen in Form eines sechseckigen Gitter Array14 und sind in mehrere kortikalen Bereiche einschließlich visuelle, somatosensorische und motorische Bereichen Maus Gehirn12,14 und in Sprache Bereiche des menschlichen Gehirns13. Neuronen in den einzelnen Microcolumn synchronisierte Aktivität aufweisen und haben ähnliche sensorischen Antworten14. Diese Beobachtungen zeigen, dass die Schicht 5 Zelltypen in einer Microcolumn Gitterstruktur repräsentieren die erste bekannte Gehirn-weiten Organisation wiederholen Funktionsmodule zu organisieren.
Microcolumns haben einen Radius von ca. 10 µm und eine räumliche Periodizität von etwa 40 µm. Darüber hinaus ist die Ausrichtung des Microcolumns parallel zu ihrer apikalen Dendriten und ändert sich je nach ihrer Position in der Kortex-14. Das Microcolumn System ist daher schwer zu analysieren, mit herkömmlichen kortikalen Scheiben mit einer typischen Dicke von ein paar Dutzend Mikrometer. Darüber hinaus die Analyse der Periodizität erfordert dreidimensionale Daten aus einer Vielzahl von Hirnareale und daher die typische imaging-Bereich der konfokalen Mikroskopie oder in Vivo 2-Photonen-Bildgebung ist zu schmal.
Vor kurzem haben Techniken entwickelt worden, um Dicke Gewebe15,16zu löschen. Hier beschreiben wir die Anwendung dieser Methoden auf groß angelegte, dreidimensionale Bilder der wichtigsten Zelltypen in Maus neokortikalen Schicht 5 erhalten, aus die das Microcolumn-System besteht. Subcerebral Projektion Neuronen sind gekennzeichnet durch die retrograde Beschriftung oder den Ausdruck das erhöhte grün fluoreszierende Protein in Crym-Egfp Transgene Mäuse12und kortikalen Projektion Neuronen durch entweder die retrograde beschriftet sind Kennzeichnung oder durch den TdTomato Ausdruck im Tlx3-Cre/Ai9 Mäuse17. Parvalbumin-mit dem Ausdruck und Somatostatin Zellen sind von Immunohistochemistry bezeichnet. (Antikörper Skala S) AbScale Methode18 dient für den Antikörper Experimente, Färbung, während die SeeDB (siehe Deep Brain) Methode19 für andere Experimente verwendet wird. Diese Methoden der konventionellen bildgebenden Verfahren die oben genannten Schwierigkeiten überwinden und zeigen die genaue zelluläre Organisation der Schicht 514.

<table><tbody><tr><td>Crym-egfp transgenic mice</td><td>MMRRC</td><td>012003-UCD</td><td></td></tr><tr><td>Tlx3-cre transgenic mice</td><td>MMRRC</td><td>36547-UCD</td><td></td></tr><tr><td>ROSA-CAG-flox-tdTomato mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>JAX #7909</td><td></td></tr><tr><td>Silicone rubber sheet</td><td>AS ONE</td><td>6-611-01</td><td>0.5 mm thickness</td></tr><tr><td>Silicone rubber sheet</td><td>AS ONE</td><td>6-611-02</td><td>1.0 mm thickness</td></tr><tr><td>Silicone rubber sheet</td><td>AS ONE</td><td>6-611-05</td><td>3.0 mm thickness</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>Falcon</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Matsunami</td><td>C022241</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C22841</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C22843</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C22842</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate</td><td>Invitrogen</td><td>C34778</td><td></td></tr><tr><td>26 G Hamilton syringe</td><td>Hamilton</td><td>701N</td><td></td></tr><tr><td>Injector pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 310</td><td>Pons injection</td></tr><tr><td>Injector pump</td><td>KD Scientific</td><td>KDS 100</td><td>Superior colliculus injection</td></tr><tr><td>Manipulator</td><td>Narishige</td><td>SM-15</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td>Somnopentyl</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pfizer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lidocaine</td><td>AstraZeneca</td><td>Xylocaine injection 1% with epinephrine</td><td></td></tr><tr><td>Drill</td><td>Toyo Associates</td><td>HP-200</td><td></td></tr><tr><td>Avitene microfibrillar hemostat</td><td>Davol Inc</td><td>1010090</td><td></td></tr><tr><td>Alonalfa</td><td>Daiichi-Sankyo</td><td>Alonalpha A</td><td></td></tr><tr><td>Surgical silk</td><td>Ethicon</td><td>K881H</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>UVP</td><td>HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>2-000-075</td><td></td></tr><tr><td>Electrode puller</td><td>Sutter Instrument Company</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin Liquid, light</td><td>Nacalai tesque</td><td>26132-35</td><td></td></tr><tr><td>Saline</td><td>Otsuka</td><td>1326</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Nacalai tesque</td><td>26126-54</td><td></td></tr><tr><td>Tungsten needle</td><td>Inter medical</td><td>&amp;Phi;0.1 *L200 mm</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>50 mL plastic tube</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-thioglycerol</td><td>Nacalai tesque</td><td>33709-62</td><td></td></tr><tr><td>D(-) Fructose</td><td>Nacalai tesque</td><td>16315-55</td><td></td></tr><tr><td>BluTack</td><td>Bostik</td><td>CKBT-450000</td><td></td></tr><tr><td>Two-photon microscope</td><td>Nikon</td><td>A1RMP</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersion long working distance objectives</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersion long working distance objectives</td><td>Nikon</td><td>CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm</td><td></td></tr><tr><td>Motorized stage</td><td>COMS</td><td>PT100C-50XY</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-492/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF03-525/50-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF03-575/25-25</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Semrock</td><td>FF01-629/56</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Chroma</td><td>D605/55m</td><td></td></tr><tr><td>5 mL plastic tube</td><td>AS ONE</td><td>VIO-5B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL plastic tube</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td>0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Nacalai tesque</td><td>35905-35</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Nacalai tesque</td><td>35501-15</td><td></td></tr><tr><td>Glyserol</td><td>Sigma-aldrich</td><td>191612</td><td></td></tr><tr><td>D(-)-sorbitol</td><td>Wako</td><td>191-14735</td><td></td></tr><tr><td>Methyl-&amp;beta;-cyclodextrin</td><td>Tokyo chemical industry</td><td>M1356</td><td></td></tr><tr><td>&amp;gamma;-Cyclodextrin</td><td>Wako</td><td>037-10643</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-L-hydroxyproline</td><td>Skin Essential Actives</td><td>33996-33-7</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Nacalai tesque</td><td>13445-45</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20 (1.1 g/mL)</td><td>Nacalai tesque</td><td>35624-15</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21422</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21428</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21235</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Water-immersion long working distance objectives</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>ABN78</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CTIP2</td><td>Abcam</td><td>ab18465</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Statb2</td><td>Abcam</td><td>ab51502</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GAD67</td><td>Millipore</td><td>MAB5406</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GABA</td><td>Sigma</td><td>A2052</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Swant</td><td>235</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Frontier Institute</td><td>PV-Go-Af460</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Sigma</td><td>P3088</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Parvalbumin</td><td>Abcam</td><td>ab11427</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Somatostatin</td><td>Peninsula Laboratories</td><td>T-4103</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-Fos</td><td>CalbioChem</td><td>PC38</td><td></td></tr></tbody></table>

large-scale three-dimensional imaging of cellular organization in the mouse neocortex

Säugetier-Neocortex besteht aus vielen Arten von erregenden und hemmenden Neuronen, mit jeweils spezifischen elektrophysiologische und biochemischen Eigenschaften, synaptischen Verbindungen und in Vivo Funktionen, aber ihre grundlegende funktionelle und anatomische Organisation von zellulären Netzwerk maßstabsgetreu ist wenig bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode für die dreidimensionale Bildgebung von eindringmittel beschriftet Neuronen über große Bereiche des Gehirns für die Untersuchung der kortikalen zelluläre Organisation. Bestimmte Arten von Neuronen sind durch die Injektion von fluoreszierenden retrograde neuronaler Tracer oder Ausdruck von fluoreszierenden Proteinen bei transgenen Mäusen beschriftet. Block Gehirn Proben, z. B. eine Halbkugel, zubereitet nach der Fixierung mit Gewebe clearing Methoden transparent gemacht und fluoreszierende Immunolabeling der spezifischen Zelltypen unterzogen. Große Flächen werden gescannt, konfokale oder zwei-Photonen-Mikroskopie mit großen Arbeiten Abstand Ziele und motorisierte Stufen ausgestattet. Die regelmäßige Organisation der Zelle typspezifischen Microcolumn Funktionsmodule in der Maus Neocortex kann mit dieser Methode beheben. Das Verfahren kann für das Studium der dreidimensionalen zellulären Architektur in den verschiedenen Hirnarealen und anderen komplexen Geweben nützlich sein.

Wir beschriftet kortikalen Projektion Neuronen durch Expression von TdTomato in Tlx3-Cre/Ai9 Transgene Mäuse und Sub-zerebrale Projektion Neuronen durch die Injektion der retrograden Tracers CTB488 in der Pons visualisiert. Die linke Hemisphäre des Gehirns wurde an die SeeDB-Methode unterzogen und mit einem zwei-Photonen-Mikroskop verfügt über eine lange Distanz Ziel arbeiten Wasserlagerung gescannt (25 X, N.A. 1.1, Arbeitsabstand 2 mm) und einem motorisierten Stadium. Ein Stapel von 401 Bilder (512 x 512 Pixel, Pixel-Größe = 0,99 µm) bei Z-Step = 2,8 µm bei jedem der 30 Positionen Scannen wurde erhalten. Die Zellkörper der zwei Zelltypen waren über einen weiten Bereich der Hirnareale (Abbildung 6) und optischen Abschnitte zeigten periodischen Microcolumns (Abb. 7A) sichtbar. Darüber hinaus wurden die Gehirne von Crym-Egfp -Mäusen (gepflegt als heterozygoten mit C57BL/6J Hintergrund) durch die SeeDB-Methode und wie oben abgebildet. Die Zellkörper und apikalen Dendriten EGFP exprimierenden Sub zerebralen Projektion Neuronen waren in optischen Abschnitte (Abb. 7 b) sichtbar.
Wir führten auch retrograde Kennzeichnung von Sub-zerebrale Projektion Neuronen in C57BL/6J Mäuse mit CTB488. Das feste Gehirn war mit einer Dicke von ca. 500 µm in koronalen Scheiben schneiden und unterzogen die AbScale Methode beschriften Parvalbumin exprimierenden Zellen (Anti-Parvalbumin, 1: 1000; Anti-Maus IgG eindringmittel beschriftet). Bilder zu Stapeln (512 x 512 Pixel, Pixel-Größe = 1,24 µm; Z-Schritt = 2,17 µm, 268 Bilder/Stack) erhielten eine lange Entfernung Ziel arbeiten Wasserlagerung konfokalen Mikroskopie mit (20 X, N.A. 1.0, Arbeitsabstand 2 mm). Sub-zerebrale Projektion Neuronen und Parvalbumin exprimierenden Zellen waren beide sichtbar in Scheiben (Abbildung 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig1.jpg"> Abbildung 1: Imaging-Kammern und Distanzstücke. (A) oben: handgemachte Glasboden-Petrischale (rechts) und einer Petrischale ohne einen Glasboden (links). Unten: Eine Kammer (rechts) und Bodenplatten (links), hergestellt aus Silikon Blätter. (B) ein Maus-Hemisphäre unterzogen, die SeeDB-Methode nach Injektion von CTB555 in den Colliculus superior in die Kammer festgelegt ist. Die Probe wird mit einem Stück wiederverwendbare Kleber fixiert. (C) A Objektträger (oben) und ein Abstandhalter aus einem Silikon-Blatt mit einer Dicke von 0,5 mm (unten) gemacht. (D) zwei koronale Scheiben des Mäusegehirns waren die Abstandshalter eingelassen und mit einem Deckglas abgedeckt. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58027/58027fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig2.jpg"> Abbildung 2: Tracer Injektion. (A) A Glaspipette mit einer Hamilton-Spritze durch ein Kunststoffrohr verbunden. (B) ein Maus befindet sich auf einer stereotaktischen Instrument. Die Glaspipette gekippt ca. 60° nach hinten aus der vertikalen Achse für die Injektion in den Colliculus superior. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58027/58027fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig3.jpg"> Abbildung 3: Zuschneiden von Gehirn Proben. (A) ganze Gehirn Probe nach Injektion von CTB555 in der superior Colliculus und Fixierung. Die Bregma und Lambda wurden mit Wolfram Nadeln (Pfeilspitzen) markiert. (B) die gleiche Probe getrimmt, um eine Halbkugel zu erhalten. Beachten Sie, dass die Wolfram-Nadeln (Pfeilspitzen) bleiben. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58027/58027fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig4.jpg"> Abbildung 4: Eintauchen des Gehirns Proben in Lösungen für die SeeDB und AbScal-e-Methoden. (A) A Hemisphäre Probe eingetaucht in 0,5 % α-Thioglycerol und 20 % (w/V) Fruktose für die SeeDB-Methode. (B) koronalen Scheiben inmitten der Sca/eA2 Lösung für die AbSca-l-e-Methode. (C) koronalen Scheiben eingebettet in AbScale Lösung, Antikörper für die AbSca-l-e-Methode enthält. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58027/58027fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig5.jpg"> Abbildung 5: Bestimmung der Zelle stellen. Sub-zerebrale Projektion Neuronen wurden beschriftet, durch die Injektion der retrograden Tracers CTB488 in der Pons bei 5 Wochen alt. Die linke Hemisphäre wurde die SeeDB-Methode unterzogen und überprüft mit zwei-Photonen-Mikroskopie (512 x 512 Pixel, Pixel-Größe = 0,99 µm; Z-Schritt = 2,8 µm, 601 Bilder/Stack). (A) A Einzelbild. (B) fünf Bilder aus einem Einzelbild-Stapel. (C) das Bild Filter verwendet, um CTB-Label Sub zerebralen Projektion Neuronen zu erkennen. (D) Korrelationswerte für fünf Bilder in (B) mit Hilfe des Filters (c) berechnet. (E) Beispiele von erkannten Sub zerebralen Projektion Neuronen. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58027/58027fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig6.jpg"> Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse der groß angelegten Bildgebung. Kortikalen Projektion Neuronen (grün) wurden durch TdTomato-Ausdruck in Tlx3-Cre/Ai9 Transgene Mäuse, beschriftet und Sub-zerebrale Projektion Neuronen (Magenta) wurden durch die Injektion der retrograden Tracers CTB488 in der Pons bei 7 Wochen visualisiert Alter. Die linke Hemisphäre die SeeDB-Methode unterzogen wurde und der Bereich 1.250 µm bis 2.690 µm Lateral und-3,400 µm bis 1.230 µm anterior der Bregma wurde gescannt, mit zwei-Photonen-Mikroskopie. (A) Draufsicht. Ungefähre Positionen der kortikalen Bereiche wurden gezeigt. (B–D) Schrägansicht des CTB 488 Fluoreszenz zeigt Sub zerebralen Projektion Neuronen (B), TdTomato Fluoreszenz zeigt kortikalen Projektion Neuronen (C) und das zusammengefügte Bild (D). A: vordere; P: Posterior; M: Medial; D: Dorsal. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58027/58027fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58027/58027fig7.jpg"> Abbildung 7: hoher Vergrößerung Fotos von repräsentative Ergebnisse. (A) eine optische Abschnitt des Bildes in Abbildung 6. Bild Dicke = 20 µm. (B) EGFP-Label Sub zerebralen Projektion Neuronen in einer heterozygoten Crym-Egfp -Maus im Alter von 6 Wochen. Bild Dicke = 30 µm. (C) Subcerebral Projektion Neuronen (Magenta) waren gekennzeichnet durch Injektion von CTB488 in der Pons von Mäusen C57BL/6J an postnatalen Tag 49 und Parvalbumin exprimierenden Zellen (grün) wurden durch die AbScale Methode visualisiert. Bild Dicke = 55 µm. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/58027/58027fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Fluorophor</td>
			<td>Ex (nm).</td>
			<td>Filter (nm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>EGFP</td>
			<td>910</td>
			<td>500-550 (FF03-525/50-25, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>tdTomato</td>
			<td>1.000</td>
			<td>578-633 (D605 / 55m, Chroma)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 488</td>
			<td>750</td>
			<td>500-550 (FF03-525/50-25, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 555</td>
			<td>750</td>
			<td>563-588 (FF03-575/25-25, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa Fluor 594</td>
			<td>750</td>
			<td>601-657 (FF01-629/56, Semrock)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DAPI</td>
			<td>700</td>
			<td>400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Erregung Wellenlängen und Filter für die zwei-Photonen-Mikroskopie.
Tabelle 2: Reagenzien für die AbScale Methode. <a href="/files/ftp_upload/58027/JoVE_Table2_AbScaleReagents0411_1829_RE0425_1806.xlsx">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Antigen</td>
			<td>Immunisierten Tieres</td>
			<td>Produkt-ID</td>
			<td>Konzentration</td>
			<td>3 mm block</td>
			<td>500 μm slice</td>
		</tr>
<tr>
<td>NeuN</td>
			<td>Maus</td>
			<td>MAB377</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>NeuN</td>
			<td>Kaninchen</td>
			<td>ABN78</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>CTIP2</td>
			<td>Ratte</td>
			<td>ab18465</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>L1-L6</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Statb2</td>
			<td>Maus</td>
			<td>ab51502</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>GAD67</td>
			<td>Maus</td>
			<td>MAB5406</td>
			<td>1: 200</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>GABA</td>
			<td>Kaninchen</td>
			<td>A2052</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumin</td>
			<td>Maus</td>
			<td>235</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumin</td>
			<td>Ziege</td>
			<td>PV-Go-Af460</td>
			<td>1: 100</td>
			<td>L1-L2/3</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumin</td>
			<td>Maus</td>
			<td>P3088</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>Parvalbumin</td>
			<td>Kaninchen</td>
			<td>ab11427</td>
			<td>1: 500</td>
			<td>ND</td>
			<td>-</td>
		</tr>
<tr>
<td>Somatostatin</td>
			<td>Kaninchen</td>
			<td>T-4103</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>L1-L2/3</td>
			<td>+</td>
		</tr>
<tr>
<td>c-Fos</td>
			<td>Kaninchen</td>
			<td>PC38</td>
			<td>1: 1000</td>
			<td>ND</td>
			<td>+</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 3: Eindringen der getesteten Antikörper. Ergebnisse für 3 mm Dicke Blöcke wie folgt dargestellt ist; L1-L6: Eindringen in die gesamte kortikale Dicke; L1-L2/3: Durchgriff auf Layer 2/3; -: keine Kennzeichnung; ND: nicht ermittelt. Ergebnisse für 500 µm dicken Scheiben wie folgt dargestellt ist; +: einheitliche Kennzeichnung; -: keine oder eingeschränkte Kennzeichnung.

Watch this Scientific Journal Video about Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex at JoVE.com

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Groß angelegte dreidimensionale Bildgebung der zelluläre Organisation in der Maus Neocortex

Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

large-scale-three-dimensional-imaging-cellular-organization-mouse

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Aufrufe.  RIKEN Brain Science Institute. Hier beschreiben wir eine Vorgehensweise für Gewebe, clearing, fluoreszierende Kennzeichnung und umfangreiche Darstellung der Maus Hirngewebe, die dadurch ermöglicht die Visualisierung der dreidimensionalen Organisation der Zelltypen der Großhirnrinde.

Serie: Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Chronische Imaging of Mouse Visual Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Forschung

Neurowissenschaften

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Mehrschicht-Cortical Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Imaging in frei beweglichen Mäusen mit Prisma-Sonden und miniaturisierte Fluoreszenzmikroskopie

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Verhalten

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphotonen Mikroskopie Cleared Maushirn Ausdruck YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Acute Slices of the Adult Mouse Forebrain

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells in restricted areas of the adult mammalian brain. Newborn neuroblasts from the subventricular zone (SVZ) migrate along the rostral migratory stream (RMS) to their final destination in the olfactory bulb (OB)1. In the RMS, neuroblasts migrate tangentially in chains ensheathed by astrocytic processes2,3 using blood vessels as a structural support and a source of molecular factors required for migration4,5. In the OB, neuroblasts detach from the chains and migrate radially into the different bulbar layers where they differentiate into interneurons and integrate into the existing network1, 6.
In this manuscript we describe the procedure for monitoring cell migration in acute slices of the rodent brain. The use of acute slices allows the assessment of cell migration in the microenvironment that closely resembling to in vivo conditions and in brain regions that are difficult to access for in vivo imaging. In addition, it avoids long culturing condition as in the case of organotypic and cell cultures that may eventually alter the migration properties of the cells. Neuronal precursors in acute slices can be visualized using DIC optics or fluorescent proteins. Viral labeling of neuronal precursors in the SVZ, grafting neuroblasts from reporter mice into the SVZ of wild-type mice, and using transgenic mice that express fluorescent protein in neuroblasts are all suitable methods for visualizing neuroblasts and following their migration. The later method, however, does not allow individual cells to be tracked for long periods of time because of the high density of labeled cells. We used a wide-field fluorescent upright microscope equipped with a CCD camera to achieve a relatively rapid acquisition interval (one image every 15 or 30 sec) to reliably identify the stationary and migratory phases. A precise identification of the duration of the stationary and migratory phases is crucial for the unambiguous interpretation of results. We also performed multiple z-step acquisitions to monitor neuroblasts migration in 3D. Wide-field fluorescent imaging has been used extensively to visualize neuronal migration7-10. Here, we describe detailed protocol for labeling neuroblasts, performing real-time video-imaging of neuroblast migration in acute slices of the adult mouse forebrain, and analyzing cell migration. While the described protocol exemplified the migration of neuroblasts in the adult RMS, it can also be used to follow cell migration in embryonic and early postnatal brains.

We describe a protocol for real-time videoimaging of neuronal migration in the mouse forebrain. The migration of virally-labeled or grafted neuronal precursors was recorded in acute live slices using wide-field fluorescent imaging with a relatively rapid acquisition interval to study the different phases of cell migration, including the durations of the stationary and migration phases and the speed of migration.

Zeitraffer-Imaging von Neuroblast Migration in Acute Scheiben von der adulten Maus Vorderhirnneuronen

There is a substantial body of evidence indicating that new functional neurons are constitutively generated from an endogenous pool of neural stem cells ...

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size and have a reflective coating on the hypotenuse to allow internal reflection of excitation and emission light.  The microprism probe simultaneously images multiple cortical layers with a perspective typically seen only in slice preparations.  Images are collected with a large field-of-view (~900 &mu;m).  In addition, we provide details on the non-survival surgical procedure and microscope setup.  Representative results include images of layer V pyramidal neurons from Thy-1 YFP-H mice showing their apical dendrites extending through the superficial cortical layer and extending into tufts.  Resolution was sufficient to image dendritic spines near the soma of layer V neurons.  A tail-vein injection of fluorescent dye reveals the intricate network of blood vessels in the cortex.  Line-scanning of red blood cells (RBCs) flowing through the capillaries reveals RBC velocity and flux rates can be obtained. This novel microprism probe is an elegant, yet powerful new method of visualizing deep cellular structures and cortical function in vivo.

In vivo Imaging of Deep Cortical Layers using a Microprism

Right-angle microprisms inserted into the mouse neocortex allows for deep imaging of multiple cortical layers with a viewpoint typically found in slice. One-millimeter microprisms offer a wide field-of-view (~900 &mu;m) and spatial resolutions sufficient to resolve dendritic spines. We demonstrate layer V neuronal imaging and neocortical vascular imaging using microprisms.

In-vivo-Imaging von Deep kortikalen Schichten mit einem MICROPRISMEN

We present a protocol for in vivo imaging of cortical tissue using a deep-brain imaging probe in the shape of a microprism.  Microprisms are 1-mm in size ...

Biologie

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Micron-Skala Resolution Optical Tomography von Entire Gehirn der Maus mit der konfokalen Mikroskopie Licht Blatt

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

Using multiple angles to cut the mouse pup brain, we improve upon a previously-described acute brain slice which captures the connections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures.

Modifikation eines Colliculo-thalamokortikalen Maus Hirnschnitt, Einbindung der 3D-Druckkammerkomponenten und Multiskalen Optical Imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their activity in vivo in behaving mice. This paper describes a method for the implantation of a chronic cranial window to allow for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. In combination with genetic strategies and viral injections, it is possible to label specific cells and regions of interest with structural or physiological markers. This protocol demonstrates how to combine viral injections to label neurons in the vicinity of GCaMP6-expressing astrocytes in the cortex for simultaneous imaging of both cells through a cranial window. Multiphoton imaging of the same cells can be performed for days, weeks, or months in awake, behaving animals. This approach provides researchers with a method for viewing cellular dynamics in real time and can be applied to answer a number of questions in neuroscience.

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

Presented here is a protocol for the implantation of a chronic cranial window for the longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice.

Implantation eines kranialen Fensters für wiederholte In-vivo-Bildgebung bei wachen Mäusen

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

Whole-Brain Single-Cell Imaging and Analysis of Intact Neonatal Mouse Brains Using MRI, Tissue Clearing, and Light-Sheet Microscopy

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of structural changes caused by genetic or environmental perturbations. Whole-brain imaging results in more accurate quantification of cells and the study of region-specific differences that may be missed with commonly used microscopy of physically sectioned tissue. Using light-sheet microscopy to image cleared brains greatly increases acquisition speed as compared to confocal microscopy. Although these images produce very large amounts of brain structural data, most computational tools that perform feature quantification in images of cleared tissue are limited to counting sparse cell populations, rather than all nuclei.
Here, we demonstrate NuMorph (Nuclear-Based Morphometry), a group of analysis tools, to quantify all nuclei and nuclear markers within annotated regions of a postnatal day 4 (P4) mouse brain after clearing and imaging on a light-sheet microscope. We describe magnetic resonance imaging (MRI) to measure brain volume prior to shrinkage caused by tissue clearing dehydration steps, tissue clearing using the iDISCO+ method, including immunolabeling, followed by light-sheet microscopy using a commercially available platform to image mouse brains at cellular resolution. We then demonstrate this image analysis pipeline using NuMorph, which is used to correct intensity differences, stitch image tiles, align multiple channels, count nuclei, and annotate brain regions through registration to publicly available atlases.
We designed this approach using publicly available protocols and software, allowing any researcher with the necessary microscope and computational resources to perform these techniques. These tissue clearing, imaging, and computational tools allow measurement and quantification of the three-dimensional (3D) organization of cell-types in the cortex and should be widely applicable to any wild-type/knockout mouse study design.

This protocol describes methods for conducting magnetic resonance imaging, clearing, and immunolabeling of intact mouse brains using iDISCO+, followed by a detailed description of imaging using light-sheet microscopy, and downstream analyses using NuMorph.

Ganzhirn-Einzelzellbildgebung und Analyse intakter neonataler Mausgehirne mittels MRT, Gewebereinigung und Lichtblattmikroskopie

Tissue clearing followed by light-sheet microscopy (LSFM) enables cellular-resolution imaging of intact brain structure, allowing quantitative analysis of ...

Mikro-CT-Scannen und Bildverarbeitung des Gehirns von Mäusen bei Neugeborenen

Micro-CT Imaging and Morphometric Analysis of Mouse Neonatal Brains

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard method for soft tissues, although its low spatial resolution poses some limits for small animals. Here, we describe a protocol for obtaining high-resolution three-dimensional (3D) information on mouse neonate brains and skulls using micro-computed tomography (micro-CT). The protocol includes those steps needed to dissect the samples, stain and scan the brain, and obtain morphometric measurements of the whole organ and regions of interest (ROIs). Image analysis includes the segmentation of structures and the digitization of point coordinates. In sum, this work shows that the combination of micro-CT and Lugol's solution as a contrast agent is a suitable alternative for imaging the perinatal brains of small animals. This imaging workflow has applications in developmental biology, biomedicine, and other sciences interested in assessing the effect of diverse genetic and environmental factors on brain development.

Autor im Rampenlicht: Hochauflösende Bildgebung von Gehirnen von Mäusen – ein Mikro-CT-Protokoll mit Lugols Lösungskontrastmittel

This study describes the steps for obtaining high-resolution images of neonatal mouse brains by combining micro-computed tomography (micro-CT) and a contrast agent in ex vivo samples. We describe basic morphometric analyses to quantify brain size and shape in these images.

Mikro-CT-Bildgebung und morphometrische Analyse von Neugeborenengehirnen von Mäusen

Neuroimages are a valuable tool for studying brain morphology in experiments using animal models. Magnetic resonance imaging (MRI) has become the standard ...