Le dysfonctionnement du locus coeruleus a été impliqué dans les désordres neurologiques et neuropsychiatriques, y compris la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, la dépression, le désordre bipolaire, et l’inquiétude. Compte tenu de ces rôles, l’analyse du locus coeruleus est cruciale pour étudier sa fonction et son dysfonctionnement. Pendant la section du cerveau de souris, le locus coeruleus peut être facilement manqué dans les sections coronale ou sagittale en raison de sa petite taille.
Ainsi, pour offrir des conseils pour la localisation du locus coeruleus, nous décrivons un protocole que nous avons développé pour localiser cette région dans le cerveau de la souris pour plusieurs applications. Commencez par placer le cerveau fraîchement isolé d’une souris anesthésiée, puis perfusée dans 4% PFA dans un tube de 50 millilitres. Incuber le cerveau pendant 24 heures à quatre degrés Celsius.
Utilisez des forceps pour transférer le cerveau dans un tube conique de 50 millilitres rempli de 25 millilitres de solution de saccharose à 30 %. Incubez-le à quatre degrés Celsius pendant 48 à 72 heures jusqu’à ce que le cerveau s’enfonce au fond du tube. Pour intégrer la section du tronc cérébral, placez sa surface coupée au fond d’un moule d’intégration et ajoutez un composé optimal de température de coupe pour entourer le tronc cérébral.
Congeler le cerveau intégré dans un congélateur de moins 80 degrés Celsius pendant au moins 12 heures jusqu’à ce qu’il soit utilisé davantage. Placez le moule avec le cerveau dans le cryostat et incubez-le pendant plusieurs heures pour ajuster sa température à celle du cryostat. Pour exposer le bloc OCT contenant le cerveau, utilisez une lame de rasoir pour couper les quatre bords du moule tout le chemin vers le bas, puis peler le moule d’intégration de celui-ci.
Utilisez des lames de rasoir pour éliminer l’excès d’OCT de la surface du bloc, en vous assurant de ne pas toucher le cerveau. Montez ensuite le bloc OCT sur le mandrin du cryostat, exposant la surface coupée du cerveau vers l’avant. Pour ajuster le cerveau, orientez la surface coupée parallèlement aux lames de rasoir du cryostat.
Bien orienter le spécimen est une étape cruciale dans ce protocole. Parce que nous utilisons des caractéristiques anatomiques de la surface dorsale du cerveau pour localiser LC, comme la frontière entre le cervelet et colliculus inférieur, il est important que les sections soient alignées correctement. Cela nécessite des soins pour bien mettre le cerveau dans la matrice de trancheuse du cerveau de la souris.
Couper le cerveau à partir de la médulle, en coupant 100 micromètres sections rostrally. Une fois que le cervelet et le tronc cérébral commencent à couper comme une tranche continue au niveau du quatrième ventricule, commencer à recueillir des tranches à 50 micromètres d’épaisseur. Utilisez des forceps pour recueillir chaque tranche de cerveau et la placer dans un puits d’une plaque de 24 puits remplie de PBS.
Le locus coeruleus sera le plus visible dans une tranche où le cervelet et le colliculus inférieur se rencontrent à environ 5,52 millimètres postérieur de bregma. Le premier jour, lavez les tranches de cerveau dans la plaque de 24 puits trois fois pendant cinq minutes chacune dans PBS. Ajouter ensuite 0,5 % de PBS avec du détergent et les perméabiliser à quatre degrés Celsius pendant 24 heures.
Le lendemain, laver les tranches trois fois pendant cinq minutes chacune avec 0,5 % de PBSD. Ajoutez ensuite l’anticorps primaire à une dilution de 1 à 500 en 0,5%PBSD et incubez à quatre degrés Celsius pendant 18 heures. Le troisième jour, laver les tranches trois fois pendant 10 minutes chacune avec 0,5 % de PBSD, puis ajouter l’anticorps secondaire à une dilution de 1 à 1 000 en 0,5 % de PBSD.
Envelopper la plaque de papier d’aluminium et l’incuber à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Après l’incubation, laver les tranches trois fois pendant cinq minutes chacune avec 0,5 % de PBSD, puis pendant cinq minutes en PBS. Couvrez les sections à l’aide d’un support de montage dur sans DAPI.
Couvrir d’un couvercle en verre et sécher pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, utilisez un microscope confocal avec des paramètres pour détecter le signal de la longueur d’onde de fluorescence appropriée à l’image des tranches de cerveau. Après avoir ajusté le microscope au plan focal de la tranche du cerveau, utilisez 10 fois le grossissement pour prendre une seule image.
Utilisez le quatrième ventricule situé sous le cervelet et au-dessus des pons et du tronc cérébral pour localiser une éventuelle région de LC dans la tranche du cerveau. Concentrez-vous sur les bords latéraux du quatrième ventricule et le LC sera situé à partir des bords du quatrième ventricule et pointant vers la région du tronc cérébral pons. La distribution intracellulaire de la bêta-hydroxylase de dopamine, une protéine exprimée dans le LC, a été évaluée utilisant ce protocole afin d’étudier la morphologie de LC et la densité neuronale.
Une autre protéine exprimée dans le LC, hydroxylase de tyrosine, a également montré un signal fluorescent vert fort dans les tranches de cerveau contenant le LC.Les changements dans l’homéostasie en métal sont souvent observés dans les désordres neurologiques, y compris des changements dans le LC.In cet exemple, quand une tranche de cerveau découpée par le LC a été mesurée pour le phosphate, le potassium, le zinc, et le cuivre, seulement le cuivre a montré une augmentation spécifique du signal. Nous recommandons de couper environ 500 microns de tissu plus antérieur et postérieur à LC pour éviter de manquer le noyau, et de couper plus de sections que nécessaire, surtout si la première fois effectuer ce protocole. Une étude minutieuse des images de l’atlas cérébral avant la coloration est très utile.
Une fois que LC est situé par immunohistochimie, les tranches adjacentes de cerveau peuvent être employées pour d’autres études, y compris l’analyse morphologique et métabolique, aussi bien que des études d’imagerie de métal par l’intermédiaire de la microscopie de fluorescence de rayon X. Les sections cérébrales générées à l’aide du protocole décrit peuvent être utilisées pour quantifier les niveaux de cuivre et d’autres métaux dans le LC et les comparer aux niveaux dans les régions en dehors du LC, ce qui est nécessaire pour comprendre le mécanisme de la maladie. D’autres applications possibles de ce protocole incluent la détection de l’abondance et de la distribution intracellulaire de la bêta-hydroxylase de dopamine, de l’hydroxylase de tyrosine, et d’autres protéines exprimées dans le LC individuellement, ou dans les analyses de co-coloration, des études de la morphologie de LC et de la densité neuronale.
