메뚜기 coeruleus의 기능 장애는 신경 및 신경 정신 장애에 연루 되었습니다., 파 킨 슨 병을 포함 하 여, 알 츠 하이 머 병, 우울증, 양극성 장애, 그리고 불안. 이러한 역할을 감안할 때, 궤적 coeruleus의 분석은 그것의 기능 및 기능 장애를 공부에 중요 하다. 마우스 뇌 절개 하는 동안, 궤 적 coeruleus 쉽게 그것의 작은 크기 로 인해 관상 또는 처상 섹션에서 놓칠 수 있습니다.
따라서, 궤적 coeruleus의 국소화를 위한 지침을 제공하기 위하여는, 우리는 우리가 몇몇 응용을 위한 마우스 두뇌에 있는 이 지역을 찾아내는 것을 개발한 프로토콜을 기술합니다. 50 밀리리터 튜브에 4%PFA에 마취된 마우스의 갓 고립된 뇌를 배치하여 시작합니다. 4섭씨에서 24시간 동안 뇌를 배양합니다.
집게를 사용하여 뇌를 30% 자당 용액의 25밀리리터로 채워진 50밀리리터 원추형 튜브로 전달합니다. 뇌가 튜브 바닥으로 가라 앉을 때까지 48 ~72 시간 동안 섭씨 4도에서 배양하십시오. 브레인스STEM 섹션을 포함하려면 절단 된 표면을 포함 금형의 바닥에 놓고 뇌간을 둘러싸기 위해 최적의 절삭 온도 화합물을 추가하십시오.
추가 사용까지 적어도 12 시간 동안 마이너스 80섭씨 냉동고에 내장 된 뇌를 동결. 뇌의 곰팡이를 극저온에 넣고 몇 시간 동안 배양하여 온도를 극저온에 맞게 조정합니다. 뇌가 포함된 OCT 블록을 노출하려면 면도날을 사용하여 금형의 네 가장자리를 바닥까지 잘라낸 다음 임베딩 몰드를 벗겨냅니다.
면도날을 사용하여 블록 표면에서 10월 초과를 제거하여 뇌를 만지지 않도록 하십시오. 그런 다음 10 월 블록을 극저온의 척에 장착하여 뇌의 절단 표면을 앞쪽으로 노출시합니다. 뇌를 조정하려면, 저울증의 면도날과 평행하게 절단 된 표면을 지향한다.
시편을 올바르게 지향하는 것은 이 프로토콜에서 중요한 단계입니다. 우리는 뇌의 등대 표면의 해부학적 특징을 사용하여 소뇌와 열등한 콜리큘러스 사이의 경계와 같은 LC를 찾는 것이 중요하기 때문에 섹션이 올바르게 정렬되는 것이 중요합니다. 이것은 마우스 두뇌 슬라이서 매트릭스로 두뇌를 제대로 설정하는 주의가 필요합니다.
수둘라에서 시작하여 100 마이크로미터 섹션을 연일무게 절단합니다. 소뇌와 뇌간이 네 번째 심실 수준에서 하나의 연속 슬라이스로 절단시작하면 50 마이크로 미터 두께로 조각을 수집하기 시작합니다. 각 뇌 조각을 수집하고 PBS로 채워진 24 웰 플레이트의 우물에 배치하려면 집게를 사용합니다.
궤적 coeruleus는 소뇌와 열등한 콜리큘러스가 bregma의 약 5.52 밀리미터 후방에서 서로 만나는 조각에서 가장 두드러질 것입니다. 첫날, PBS에서 각각 5 분 동안 24 웰 플레이트에서 뇌 슬라이스를 세 번 씻으시다. 그런 다음 세제로 0.5 %의 PBS를 추가하고 24 시간 동안 섭씨 4도에서 투과합니다.
다음 날, 0.5 %의 PBSD로 5 분 동안 슬라이스를 세 번 씻으시다. 그런 다음 0.5%PBSD에서 1~500의 희석시 1차 항체를 추가하고 18시간 동안 섭씨 4도에서 배양한다. 셋째 날에는 각각 0.5%의 PBSD로 10분 동안 슬라이스를 세 번 씻은 다음 0.5%PBSD에서 1~1000의 희석시 이차 항체를 첨가한다.
알루미늄 호일로 접시를 감싸고 섭씨 4도에서 16시간 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 각각 0.5%의 PBSD로 5분간 슬라이스를 세 번 씻은 다음 PBS에서 5분간 세척합니다. DAPI 없이 하드 셋 장착 매체를 사용하여 섹션을 덮습니다.
유리 커버로 덮고 실온에서 30 분 동안 건조하십시오. 그런 다음 설정이있는 공초점 현미경을 사용하여 적절한 형광 파장에서 이미지를 이미지하는 뇌 슬라이스에 신호를 감지하십시오. 현미경을 뇌 슬라이스의 초점 평면으로 조정한 후 10배 배율을 사용하여 단일 이미지를 취합니다.
소뇌 아래와 폰과 브레인스템 위에 위치한 네 번째 심실을 사용하여 뇌 슬라이스에서 가능한 LC 영역을 찾습니다. 4심실의 측면 가장자리에 초점을 맞추고 LC는 제4 심실의 가장자리에서 시작하여 폰브레인스영역을 가리킵니다. LC에서 발현된 단백질인 도파민 베타-하이드록실라제의 세포내 분포는 LC 형태학 및 뉴런 밀도를 연구하기 위해 이 프로토콜을 사용하여 평가되었다.
LC에서 발현된 또 다른 단백질인 티로신 하이드록실라제는 LC를 함유한 뇌 슬라이스에서 강한 녹색 형광 신호를 보였으며, 금속 항상성에 대한 변화는 종종 LC.In 신경학적 장애에서 관찰되며, 이 예에서는 LC의 변화를 포함하여 신경학적 장애에서 관찰되는 경우가 많으며, LC를 통해 절단된 뇌 슬라이스가 인산염, 칼륨, 아연 및 구리만 을 측정하였다. 핵을 놓치지 않도록 약 500미크론의 조직 전방 및 후방을 LC로 자르고, 특히 이 프로토콜을 처음 수행하는 경우 필요한 부분보다 더 많은 부분을 절단하는 것이 좋습니다. 염색하기 전에 뇌 아틀라스 이미지에 대한 주의 깊은 연구는 매우 유용합니다.
일단 LC는 면역 조직화학에 의해 위치되면, 인접한 두뇌 조각은 엑스레이 형광 현미경 검사를 통해 금속 화상 진찰 연구뿐만 아니라 형태학 및 신진 대사 분석을 포함하여 추가 연구 결과, 또한 이용될 수 있습니다. 기술된 프로토콜을 사용하여 생성된 뇌 섹션은 LC의 구리 및 기타 금속 수준을 정량화하고 질병 메커니즘을 이해하는 데 필요한 LC 외부 영역의 수준과 비교할 수 있습니다. 이 프로토콜의 추가 가능한 응용 프로그램은 도파민 베타 하이드록실라제, 티로신 하이드록실라제 및 LC에서 개별적으로 발현된 기타 단백질의 풍부하고 세포내 분포의 검출을 포함하며, 또는 LC 형태학 및 뉴런 밀도의 공동 염색 분석에서.
