小鼠大脑中耳蜗的定位

蝗虫功能障碍与神经和神经精神病有关，包括帕金森病、阿尔茨海默病、抑郁症、双相情感障碍和焦虑症。鉴于这些作用，对位子库的分析表明，对于研究其功能和功能障碍至关重要。在小鼠大脑剖面过程中，由于体积小，在日冕或下垂部分很容易错过。

因此，为了指导位子库的定位，我们描述了一个协议，我们开发了一个协议，定位这个区域在小鼠大脑的几个应用程序。首先将麻醉后刚分离的大脑放入 4%PFA 中，放入 50 毫升管中。在4摄氏度下孵育大脑24小时。

使用钳子将大脑转移到一个 50 毫升的圆锥形管中，管中装满了 25 毫升的 30% 蔗糖溶液。在4摄氏度下孵育48至72小时，直到大脑沉入管底。要嵌入脑干部分，请将其切割表面放在嵌入模具的底部，并添加最佳的切割温度化合物来包围脑干。

将嵌入式大脑冷冻在零下80摄氏度的冰柜中至少12小时，直到进一步使用。将带大脑的模具放入低温恒温器中，孵育数小时，将其温度调整到低温恒温器的温度。要露出含有大脑的 OCT 块，请使用剃刀刀片将模具的四个边缘一直切割到底部，然后从底部剥离嵌入模具。

使用剃须刀刀片从块表面去除多余的 OCT，确保不要接触大脑。然后将 OCT 块安装在低温恒温器的夹头上，将大脑的切割表面朝前露出来。要调整大脑，请将切割表面与低温恒温器的剃须刀刀片平行定向。

正确定位试样是该协议中的关键步骤。由于我们使用大脑的后面的解剖特征来定位LC，例如小脑和低劣的结肠之间的边界，因此，各部分正确对齐非常重要。这需要小心，正确设置大脑到小鼠大脑切片矩阵。

修剪大脑从梅杜拉开始，修剪100微米部分。一旦小脑和脑干开始切割为连续切片在第四心室的水平，开始收集切片在50微米厚度。使用钳子收集每个大脑切片，并放在一个装满PBS的24井板的井中。

在小脑和低劣的胶合体在小脑和劣质的大肠杆菌后部约5.52毫米的切片中，蝗虫最明显。第一天，在PBS中洗三次24井板中的大脑切片，每次洗5分钟。然后加入0.5%PBS与洗涤剂，并在4摄氏度24小时渗透。

第二天，用0.5%PBSD将切片洗三次，每次五分钟。然后在0.5%PBSD中稀释1至500的原抗体，在4摄氏度下孵育18小时。第三天，用0.5%PBSD清洗切片三次，每次10分钟，然后在0.5%PBSD中稀释1至1000次抗体。

用铝箔包裹板，在4摄氏度下孵育16小时。孵育后，用0.5%PBSD清洗切片三次，每次洗5分钟，然后用PBS洗涤5分钟。使用硬设置安装介质覆盖各部分，无需 DAPI。

盖上玻璃盖，在室温下干燥30分钟。然后使用具有设置的共和显微镜来检测来自适当荧光波长的信号，以成像脑切片。将显微镜调整到大脑切片的焦平面后，使用 10 倍放大倍率拍摄单个图像。

使用位于小脑下方和波恩和脑干下方的第四个心室，在脑片中定位可能的LC区域。聚焦第四心室的横向边缘，LC 将从第四个心室的边缘开始，指向庞脑干区域。使用本协议评估多巴胺β-羟基酶的细胞内分布，这是一种在LC中表达的蛋白质，用于研究LC形态和神经元密度。

LC中表达的另一种蛋白质，酪氨酸羟基酶，也显示出含有LC的大脑切片中强烈的绿色荧光信号。 在神经紊乱中经常观察到金属平衡的变化，包括LC.In这个例子中的变化，当大脑切片切入LC时，测量磷酸盐、钾、锌和铜，只有铜显示信号的特定增加。我们建议切割约500微米的组织前和后LC，以避免错过细胞核，并削减更多的部分比必要的，特别是如果第一次执行此协议。在染色之前仔细研究大脑地图集图像是非常有帮助的。

一旦LC通过免疫组织化学定位，相邻的脑片可用于进一步研究，包括形态学和代谢分析，以及通过X射线荧光显微镜进行金属成像研究。使用所述协议生成的脑部分可用于量化 LC 中的铜和其他金属水平，并将其与 LC 以外的区域中的水平进行比较，这是了解疾病机制所必需的。该协议的进一步可能应用包括检测多巴胺β-羟基酶、酪氨酸羟基酶和在LC中单独表达的其他蛋白质的丰度和细胞内分布，或在共染色测定、LC形态学和神经元密度研究中。