وقد تورط الخلل الوظيفي للوcus coeruleus في الاضطرابات العصبية والنفسية العصبية, بما في ذلك مرض باركنسون, مرض الزهايمر, الاكتئاب, اضطراب ثنائي القطب, والقلق. وبالنظر إلى هذه الأدوار، فإن تحليل مركز الوُسَرَل أمر بالغ الأهمية لدراسة وظيفته واختلاله الوظيفي. أثناء اقسام دماغ الماوس، يمكن أن يغيب بسهولة coeruleus المُلَكَن في الأقسام التاجية أو القوسية بسبب صغر حجمها.
وهكذا، لتقديم التوجيه لتوطين coeruleus locus، ونحن وصف بروتوكول التي وضعناها لتحديد موقع هذه المنطقة في الدماغ الماوس لعدة تطبيقات. ابدأ بوضع دماغ معزول حديثًا من فأر مُغَمَّر ثم مُنشر في 4٪ PFA في أنبوب 50 ملليلتر. احتضن الدماغ لمدة 24 ساعة عند أربع درجات مئوية.
استخدام ملقط لنقل الدماغ إلى أنبوب مخروطي 50 ملليلتر مليئة 25 ملليلتر من محلول السكروز 30٪. احتضانه عند أربع درجات مئوية لمدة 48 إلى 72 ساعة حتى يغرق الدماغ إلى أسفل الأنبوب. لتضمين قسم جذع الدماغ، ضع سطحه المقطوع على الجزء السفلي من قالب التضمين، وإضافة مركب درجة حرارة القطع الأمثل ليحيط بـ جذع الدماغ.
تجمّد الدماغ المضمّن في ثلاجّة ناقص 80 درجة مئوية لمدة 12 ساعة على الأقل حتى الاستخدام الإضافي. ضع القالب مع الدماغ في التبريد واحتضانه لعدة ساعات لضبط درجة حرارته إلى درجة حرارة المبرد. لفضح كتلة أكتوبر التي تحتوي على الدماغ، واستخدام شفرة حلاقة لقطع حواف أربعة من العفن على طول الطريق إلى أسفل، ومن ثم قشر بعيدا العفن تضمين منه.
استخدم شفرات الحلاقة لإزالة فائض أوكت من سطح الكتلة، مع التأكد من عدم لمس الدماغ. ثم جبل كتلة أكتوبر على تشاك من cryostat، وفضح سطح قطع من الدماغ نحو الجبهة. لضبط الدماغ، قم بتوجيه السطح المقطوع بالتوازي مع شفرات الحلاقة في التبريد.
توجيه العينة بشكل صحيح هو خطوة حاسمة في هذا البروتوكول. لأننا نستخدم السمات التشريحية للسطح الظهري للدماغ لتحديد موقع LC، مثل الحدود بين المخيخ وcolliculus أدنى، من المهم أن تكون محاذاة المقاطع بشكل صحيح. وهذا يتطلب الرعاية في وضع صحيح في الدماغ في مصفوفة تقطيع الدماغ الماوس.
تقليم الدماغ ابتداء من النخاع، وقطع 100 ميكرومتر أقسام rostrally. بمجرد أن يبدأ المخيخ و الدماغ في القطع كشريحة واحدة مستمرة على مستوى البطين الرابع ، ابدأ في جمع الشرائح بسمك 50 ميكرومتر. استخدام ملقط لجمع كل شريحة الدماغ ووضعها في بئر من لوحة 24-well مليئة برنامج تلفزيوني.
وسوف coeruleus locus يكون أكثر وضوحا في شريحة حيث المخيخ وcolliculus أدنى تلبية بعضها البعض في حوالي 5.52 ملليمتر الخلفي من bregma. في اليوم الأول، غسل شرائح الدماغ في لوحة 24 جيدا ثلاث مرات لمدة خمس دقائق كل في برنامج تلفزيوني. ثم إضافة 0.5٪ برنامج تلفزيوني مع المنظفات و permeabilizeize لهم في أربع درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي، اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها مع 0.5٪ PBSD. ثم إضافة الأجسام المضادة الأولية في تخفيف من واحد إلى 500 في 0.5٪ PBSD واحتضان في أربع درجات مئوية لمدة 18 ساعة. في اليوم الثالث، وغسل شرائح ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل مع 0.5٪ PBSD، ثم إضافة الأجسام المضادة الثانوية في تخفيف من واحد إلى 1000 في 0.5٪ PBSD.
التفاف لوحة مع رقائق الألومنيوم واحتضان في أربع درجات مئوية لمدة 16 ساعة. بعد الحضانة، وغسل شرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع كل 0.5٪ PBSD، ثم لمدة خمس دقائق في برنامج تلفزيوني. قم بتغطية المقاطع باستخدام وسائط التركيب الثابتة بدون DAPI.
يُغطّى الغطاء مع غطاء زجاجي ويُجفف لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم استخدم مجهرًا مشتركًا مع إعدادات للكشف عن الإشارة من الطول الموجي الملائم للفلورس إلى شرائح الدماغ الصورة. بعد ضبط المجهر إلى الطائرة البؤرية لشريحة الدماغ، استخدم التكبير 10 مرات لالتقاط صورة واحدة.
استخدم البطين الرابع الموجود أسفل المخيخ وفوق الوطن و الدماغ لتحديد موقع منطقة LC محتملة في شريحة الدماغ. التركيز على الحواف الجانبي للبطين الرابع وسوف يكون موجودا LC بدءا من حواف البطين الرابع والإشارة نحو منطقة الدماغ البونز. تم تقييم التوزيع داخل الخلايا من الدوبامين بيتا هيدروكسيلاس, بروتين أعرب عنه في LC, باستخدام هذا البروتوكول من أجل دراسة LC مورفولوجيا وكثافة الخلايا العصبية.
بروتين آخر أعرب عنه في LC، التيروزين هيدروكسيلاس، كما أظهرت إشارة فلورية خضراء قوية في شرائح الدماغ التي تحتوي على LC.Changes في التوازن المعادن وغالبا ما لوحظ في اضطرابات عصبية، بما في ذلك التغيرات في LC.In هذا المثال، عندما تم قياس شريحة الدماغ قطع من خلال LC للفوسفات والبوتاسيوم والزنك والنحاس، وأظهرت النحاس فقط زيادة محددة في الإشارة. نوصي بقطع حوالي 500 ميكرون أكثر من الأنسجة الأمامية والخفية لتجنب فقدان النواة، وقطع أقسام أكثر من اللازم، خاصة إذا كان أول مرة تنفيذ هذا البروتوكول. دراسة متأنية لصور أطلس الدماغ قبل تلطيخ مفيد جدا.
مرة واحدة يقع LC عن طريق الكيمياء المناعية، يمكن استخدام شرائح الدماغ المجاورة لمزيد من الدراسات، بما في ذلك التحليل المورفولوجي والتمثيلي، فضلا عن دراسات التصوير المعدني عن طريق المجهر الفلورسيسين بالأشعة السينية. ويمكن استخدام أقسام الدماغ التي تم إنشاؤها باستخدام البروتوكول الموصوف لتحديد مستويات النحاس والمعادن الأخرى في LC ومقارنتها بالمستويات في المناطق خارج LC، وهو أمر ضروري لفهم آلية المرض. وتشمل التطبيقات المحتملة الأخرى لهذا البروتوكول الكشف عن وفرة وتوزيع داخل الخلايا من الدوبامين بيتا هيدروكسيلاس, التيروزين هيدروكسيلاس, وغيرها من البروتينات التي أعرب عنها في LC بشكل فردي, أو في اختبار التلطخ المشترك, دراسات من مورفولوجيا LC وكثافة الخلايا العصبية.
